アメフラシ神経細胞の培養を含む実験室での作業がリストNIH R01とNIH R21MH077921によって運営されている。

準備（ソリューションの構成のためのプロトコルの終了時にソリューションを参照してください） <ol><li>培養皿を準備します。ポリ- L -リジン（ホウ酸ナトリウムで作られた）とマテックガラス底培養皿のよくコートガラス。完全によくガラスをカバーし、&gt; 1時間（一晩放置することができます）に向けて出発するのに十分な追加。徹底的に人工海水（ASW）4-5回ですすぐことにより、ポリ- L -リジンを削除します。すすぎの最後を削除した後、2 50パーセントL15のMLS（塩を補充および2mMの最終濃度でL -グルタミンを含む）/ 50％の血リンパを追加。この培地は、プレーティング前の細胞に少なくとも1時間のための皿の中でその血リンパのコートディッシュことでなければなりません。 </li><li>エタノールとツールとSylgardの皿をきれいに、DDH 2 0で、それらを徹底的に洗い、その後、文化のフードにUV光の下で&gt; 1時間のためにそれらを置きます。 </li><li>神経細胞のマイクロダイセクションのための鋭い電極を準備します。 微小電極プラー（例えばブラウンP - 97をフレーミングサッタが）、1.5ミリメートル外径、0.86〜1.12ミリメートル内径と長さ100 mmのガラスピペット電極を引くの使用（例えば、システムカタログ＃628000午前、世界の精密機器TW150 - 4、1.55 / 1.12）。溶液中に配置された流体のない毛細管摂取がないことをそのような高抵抗の長いとうっすらと細かいチップを用いて電極を製造パラメータを使用してください。流体メニスカスの存在は、電極の先端が分離中にニューロンに損​​傷を与えることを意味します。サター電極の料理本は、電極のプログラムを設定するための優れたガイドラインを提供します。我々は、ボックスのフィラメントを使用し、ワンステップでは、文化の電極を生成するために引き出します。 </li><li>麻酔液（0.35M MgCl 2を）、培養培地（塩類および血リンパを添加したL15）、およびプロテアーゼ溶液を（1％プロテアーゼIX型、シグマ、1単位/ mg、10単位/ mlの最終濃度まで）の準備。 </li><li>動物：感覚ニューロンのとLFS運動ニューロンの単離のために成人の80〜100グラムアメフラシを使用。 L7運動ニューロンの単離のために幼若1〜4グラムアメフラシを使用してください。海水タンクから静かに動物を削除し、麻酔と文化の手順を開始する前に30分以上のために海水（ビーカー、バケツやビニール袋）に維持する。 </li></ol>文化手順 80〜100グラムアメフラシからA.の培養胸膜感覚ニューロン<ol><li>神経節の除去のために動物を麻酔：18ゲージ1.5インチの針と60mlのシリンジを使用して、成人アメフラシ （80〜100グラム）に0.35MのMgCl 2を注入。約35度の角度で動物の足を入力し、あまりにも深く入力しないでください。目標は、内臓を貫通することなく、動物の血体腔に注入することです。動物は非常に膨張したとリラックスになるはず。 </li><li>神経を解剖：頭部と尾部でのピン（18ゲージの針が80〜100グラムの動物のために働く）、と上に向けて足で、解剖皿に麻酔動物をピン。歯鉗子で足をホールドし、外科はさみで皮膚と下層の結合組織の足の全長（先頭から末尾）カットスルー。両側を突き止める。鉗子やハサミを使用して、食道を切断し、神経節を露出する側に引き出します。細かい鉗子と細かいハサミを使用して、胸膜ペダル神経節を（感覚ニューロンは、側神経節にある）切り取ります。これはそれが簡単にプロテアーゼ処理後の神経節を突き止めることができなくしていますので、神経のかなりの量を残す。 </li><li>神経節のプロテアーゼ消化：34.5でのインキュベーターセット内のプレースプロテアーゼ溶液の神経節（L15で1単位/ mgの10 mg / mlの）℃（34〜35℃で大丈夫です）2時間と15分のため。 ASW三回に神経を転送し、洗浄するために微細な先端の鉗子を使用する。 L15で神経をしてください。プロテアーゼのインキュベーション時間が異なることに注意してください。目的は、結合組織は簡単に削除できるようにすることです。それが神経細胞を損傷することなくdesheath核をするのが困難である場合、プロテアーゼのインキュベーション時間を増やします。それは、神経節desheathに非常に簡単で、神経細胞は&quot;ソフト、&quot;プロテアーゼのインキュベーション時間を短縮している。場合</li><li>神経節をDesheathing：sylgardとL15を含む60 mmまたは35mmディッシュにプロテアーゼ消化神経を転送。ステレオ顕微鏡（外部ハロゲン照明付）での表示、削除する足神経節と虫ピンと微細な鉗子を使用して正しい向きにSylgard皿の側神経節を突き止める。細かい鉗子とヴァンナ外科ハサミで、慎重に結合組織を持ち上げて、感覚クラスタを公開するために、それをカット。これまでに触れたり、神経細胞のsomaの複数形を傷つけないように注意してください。皿から余分な結合組織を取り出して、空気にdesheathed神経節を公開することはないことに注意しながら、より多くの培地を加える。感覚クラスタは40〜50ミクロンの直径の約200クラスタ化されたニューロンで構成されています。 ganglから短い距離で&quot;ポスト&quot;を作るためにピンを設定します。イオン（視野内）。 </li><li>神経細胞の単離：長い、鋭いガラス文化の電極を使用するには、離れてから、軸索と一緒に、（自由に動けなくするしない）で、市内中心部から細胞体に触れるとゆっくりと着実に細胞体を引っ張り、いずれかによって識別されるニューロンを引き抜く神経節。ゆっくりと電極から神経細胞を取り除くために、ピンに対してタップ。 </li><li>メッキのニューロンは：培養皿にSylgard皿から個々のニューロンを転送するpipetman（P10）を使用してください。プラスチック製の先端が血リンパでコー​​ティングされるように、先端に神経細胞、ピペットの培養液を転送する前に（これは、プラスチックに付着するから神経細胞を防ぎます）。し、気泡や、極端な力（すなわち、非常に穏やかに取るとpipettemanから神経細胞を取り除く）にニューロンを公開しないように細心の注意が払われています。皿全体に均等にニューロンを配布する。ストレートプロセス優しくする鋭い電極を使用し、底にそれらをタップします。 </li><li>インキュベーション：3つ以上時間室温で顕微鏡のステージ上で料理を残す。我々は日常的にそれらを一晩おきます。顕微鏡のステージがこの期間中に摂動されていることを確認します。光から保護するために、アルミホイルでステージをカバー。ゆっくりと18℃インキュベーターに移す。 </li><li>文化は、約3時間以内にシャーレに付着する必要があり、新たな神経突起の成長は、約6-12時間以内に表示されるはずです。孤立した感覚ニューロンの成長は、DIV 3または4でプラトーに達する。彼らは形電気ギャップ結合を行うが、互いに孤立した感覚ニューロン雌ではないフォームのautapsesまたは化学シナプスことに注意してください。 </li></ol>感覚ニューロン、運動ニューロン共培養のB.の準備感覚ニューロンは、培養中のターゲットの運動ニューロンとシナプスを形成する。最も一般的に使用される運動ニューロンは、腹部神経節から、LFSの運動ニューロンとL7運動ニューロンです。 LFS運動ニューロンは成人（80〜100グラム） アメフラシから単離し、腹部神経節あたり約20 LFSの運動ニューロンが存在している。 L7運動ニューロンは、幼若（1-4 g）の動物から単離し、そして腹部神経節ごとに1つだけL7が存在しています。 LFS運動ニューロンは、直径40〜50ミクロンである腹部神経節の腹側表面上にサイフォンの神経の根に近いLE感覚ニューロンの間に散らばっている、とそれぞれの細胞体に微妙な濃い顔料のスポットによって特徴付けられる。 L7運動ニューロンは、直径100から150ミクロンであり、神経節の左側の中央の端に、神経節の背側表面上に存在しています。それはLFS運動ニューロンを使用するより経済的である一方、L7運動ニューロンの大きなサイズはいくつかの実験のために有利である。 L7の尾も腹部神経節の背側の左表面上L11運動ニューロンは、、、非標的運動ニューロンであり、効果的に感覚神経がfasciculates先のコントロールとして使用することができますが、化学シナプスを形成しない。 <ol><li>神経節の除去のために動物を麻酔。 LFS運動ニューロンの場合は、のような胸膜感覚ニューロンについて記載はありません。 L7運動ニューロンの場合は、21ゲージ針で10mlの注射器を用いて幼若アメフラシ （1-4 G）に0.35MのMgCl 2を注入する。 </li><li> （幼若動物のために21ゲージの針を使用して）上記のような解剖皿に麻酔動物をピン：腹部神経節を細かく分析。細かい鉗子と細かいハサミを用いて、腹部神経節を切り取る。 </li><li>神経節のプロテアーゼ消化は：これは、消化時間が幼若（1-4 g）の動物から神経節のための1時間45分に短縮されることを除いて、胸膜の感覚ニューロンで説明したように行われます。 </li><li>神経節をDesheathing：sylgardとL15を含む、35または60 mmディッシュにプロテアーゼ消化神経を転送。昆虫ピンと微細な鉗子を使用して正しい向きにSylgard皿に神経節に、ステレオ顕微鏡（外部ハロゲン照明付）の下に​​ダウンの表示。細かい鉗子とヴァンナ外科ハサミで、慎重に結合組織を持ち上げ、それが神経細胞体を公開するカット。 LFS運動ニューロンを分離するには、腹面が上を向くように神経節を固定し、ピンセットでLFS運動ニューロン（右手に）、desheath含む神経節の全体の半分を公開するために戻って結合組織鞘を引く神経節の残りの部分は、皿から任意の結合組織を除去し、より多くのL15を追加。 L7またはL11運動ニューロンを単離するために、背面が上を向くように神経節を固定し、ピンセットでL7とL11（左手に）の両方を含む神経節の半分を公開するために戻って結合組織鞘を引き出します。これまでに触れたり、神経細胞のsomaの複数形を傷つけないように注意してください。神経節から短い距離（視野内）で&quot;ポスト&quot;を作るためにピンを置きます。 </li><li>神経細胞の分離：のような感覚ニューロンで説明した鋭い電極とニューロンを削除します。 LFSのニューロンは、diffです彼らのsomaの複数形の小さな黒い色素スポットに基づいて隣接するLE感覚ニューロンからerentiated。 L11の軸索は細胞には2つの密接に分岐する傾向があるので、L7細胞体が丸くなるとしながらL11細胞体の形状がより多くの長方形であるため、L11は、L7の尾側なので、L7ニューロンは、最初のL11ニューロンと区別することができますボディ。 </li><li>メッキのニューロンは：感覚神経のために説明されているように培養皿にSylgard皿から個々のニューロンを転送するpipetman（P10）を使用してください。 </li><li>感覚ニューロンとペアリング：運動ニューロンは、少なくとも1時間培養皿に付着してみましょう。その後、分離された感覚ニューロンは、メッキ運動ニューロンに隣接する各感覚神経を提供し、pipetmanを追加。鋭いガラス電極を使用すると、慎重に等しいか、感覚細胞の軸索の長さよりわずかに小さい距離で、感覚神経の軸索をまっすぐにし、運動ニューロンの隣に位置する感覚細胞の本体を同軸。ガラス電極を使用して、非常に静かに最終的に物理的に運動ニューロンの軸索に連絡して感覚神経軸索を持つようにテーパ状電極の側面を使用して、運動ニューロンと接触する感覚軸索を同軸。培養皿を持ち上げるのではなく、静かに顕微鏡のステージに沿って料理を滑空しないでください。 </li><li>として感覚ニューロンで説明した3つ以上時間と18℃のインキュベーターへの転送のために室温で顕微鏡のステージ上で料理を残す。 </li><li>文化は、約3時間以内にシャーレに付着する必要があり、新たな神経突起の成長は、約6-12時間以内に表示されるはずです。感覚ニューロンは、非常に短時間で運動ニューロンをグルタミン酸シナプスを形成する - など、すぐに細胞が、興奮性後シナプス電位シャープ電極記録（3-5時間）を実行するための十分な接着なので記録することができます。シナプス接続はDIV 3日まで増加し続け、そしてDIV7まで、安定しています。神経細胞は、培養の最初の1〜3日中に精巧な神経突起伸長を示す必要があります。 </li></ol>血リンパのC.の準備血リンパは、 アメフラシの培養中の成長因子（哺乳動物細胞培養におけるウシ胎児血清の使用に類似）として使用されます。それは大（500 G - 1 kg）の動物から採取し、（逸話的に）血リンパを収集するのに最適な時間帯は、春（6月中旬〜3月）中になっています。動物のごく一部が露出されるように、使い捨てunderpadで動物をおくるみ、エタノールで皮膚のその部分を清掃して別の人が露出面積の切開を行うために無菌のカミソリの刃を使用している間それを保持する。きれいなビーカーに血リンパのホヤが、それは動物の汚れた皮膚に接触しないことを確認するように動物を絞る。血リンパは、動物の血体腔を埋める（すなわち、動物は基本的に血リンパ嚢です）。 （それが汚れた場合は、最初のコレクションはまだ使用可能であるように、新しいビーカーに集める）新たな切開を行い、可能な限り多くの血リンパを集めるのは難しい絞る、一度か二度、動物をRewrap。各動物から体液が（すなわち、異なる動物からプール血リンパをしない）別々に保つ必要があります。血液細胞を除去するために10分間2,000 xgで血リンパを回転させる。 10mlのアリコートに分注し清、-80℃で動物と店舗別ラベル℃の-20℃で保存した血リンパは、培地中に沈殿物を形成することに注意してください。血リンパの新しいアリコートたびに培養液を調製し使用する必要があります、そしてアリコート培地を準備する直前に解凍してください。解凍後の再凍結はしないでください。

<ol>
	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialogue+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Rayport, S. G., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+vitro:+cell+culture+of+identified+Aplysia+neurons+mediating+short-term+habituation+and+sensitization.">Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization.</a> J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).</li><li>Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).</li><li>Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+target+motor+neuron+regulates+neurite+outgrowth+and+synapse+formation+of+aplysia+sensory+neurons+in+vitro.">Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro.</a> Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li><li>Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific,+long-term+facilitation+of+aplysia+sensory+to+motor+synapses:+a+function+for+local+protein+synthesis+in+memory+storage.">Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage.</a> Cell. 91 (7), 927-938 (1997).</li><li>Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+long-term-memory-related+synaptic+plasticity+involves+bidirectional+regulation+of+gene+expression+and+chromatin+structure.">Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure.</a> Cell. 111 (4), 483-493 (2002).</li></ol>

それは、ステレオ顕微鏡を通して見た個々の神経細胞のマイクロダイセクションと操作に関連付けられている細かい運動能力の開発を含んでいるので、 アメフラシ感覚運動文化の成功の準備は、やや遅い学習曲線を持っています。我々の経験では、それは運動ニューロンと感覚ニューロンをペアリングする方法については、文化と追加の1〜3週間で健康な分離感覚神経を得るために練?...

培養のために必要なソリューション<ol><li>麻酔に使用される室温で保存されて0.35Mの塩化マグネシウム、、。 </li><li>ポリ- L -リジン溶液、シグマ：0.1Mホウ酸ナトリウムpH8.2に0.5mg/ml溶液中で作られたP - 1524、MW&gt; 30万。よくとフィルター渦が0.22μmフィルターを通して滅菌、4Cの°に保管してください。凍結融解しないでください。 </li><li> L - 15培地の粉末（リーボ）（シグマ：L4386）は1リットルを作るために以下のように塩を補充 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> L - 15粉</td><td> 13.8グラム</td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 15.4グラム</td></tr><tr><td> D -グルコース</td><td> 6.24グラム</td></tr><tr><td>し、MgSO 4 7H 2 0 </td><td> 6.45グラム</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 350mgを</td></tr><tr><td> NaHCO 3の </td><td> 170mgの</td></tr><tr><td>のMgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 5.49グラム</td></tr><tr><td>のCaCl 2 2H 2 O </td><td> 1.43グラム</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.53グラム</td></tr></table> ddH20に1リットルを追加。 pHは、7.4から7.5程度である100Xペン/咽頭ソリューション10mlのを追加し、0.22メートルフィルターを通して濾過滅菌してください。 1ヶ月以上、もはや用4C0で保存。 </li><li>プロテアーゼ消化液：1％プロテアーゼIX（1unit/mg）は使用直前にL15（上記のように塩を添加した）でまたはASWで作られ、0.22メートルミリポアを通して濾過滅菌。 5mlsは2つの動物（神経節が完全にプロテアーゼ溶液に浸漬されていることを確認）から基底核で十分でしょう。シグマは、プロテアーゼIXの販売を中止することを報告している。代替プロテアーゼは、次のとおりです。ディスパーゼII（ロシュダイアグノスティックスのカタログ＃04942078001）。 </li><li>培地。直前の準備の文化に、血リンパの10mlのアリコートを解凍し、20mls培地を作るためにL15の10mlの（上記のように塩を添加した）と混ぜる。 L -グルタミン200ミリメートルの200μlを追加、よく混ぜると文化を調製するために使用します。この培地は、培養が行われるたびに新鮮な準備する必要があります。 </li><li>人工海水はインスタントオーシャン（水族館システムズ、メンター、オハイオ州）からか、次のように行うことができます：450 mMのNaCl、10mMのKClを、30 mMのMgCl 2（6H 2 O）、20mMのMgSO 4を 、10mMのCaCl 2の （2H 2 O）、7.4に調整pHを10 mMのHEPES、。 </li></ol>

preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures

海洋軟体動物アメフラシカリの神経系は、約20,000のニューロンで構成される、比較的簡単です。ニューロンは、異なるサイズ、形状、位置や色素沈着で、大（直径最大1 mm）と識別可能であり、細胞体は、外部から動物の体全体に分散fiveペアの神経節に公開されています。これらのプロパティは、動物1の特定の行動の根底に回路を描くために捜査官を許可している。感覚および運動ニューロン間のシナプス接続は、動物の鰓の離脱反射、動物は、サイフォンの触覚刺激に応答し、その鰓を撤回したシンプルな防衛反射の中心的なコンポーネントです。この反射は、感作、馴化と古典的条件を含む非結合と連合学習の形態を、受ける。シナプス可塑性の研究に特に有益である、感覚運動シナプスが十分に特徴付けられた刺激は動物2,3の動作に直接の相関を持っている可塑性の形態を引き出す場所、文化の中で再構成することができる。具体的には、セロトニンのアプリケーションは、アプリケーションのプロトコルに応じて、シナプスの強化を生成する、（長期的なファシリテーション）分（短期促進）、時間（中間的なファシリテーション）または数日間続きます。対照的に、ペプチドトランスミッタFMRFamideのアプリケーションは、アプリケーションのプロトコルに応じて、シナプスの弱体化やうつ病を生成、日（長期不況）に数分から続くことができる。ニューロンの大サイズが特定のシグナル伝達カスケードと分子を標的とし、それによって変化の根底にある分子細胞生物学的なステップを識別するための発現ベクター、siRNAおよび他の化合物のマイクロインジェクションと一緒に日の期間にわたってシナプス強度の繰り返し鋭い電極の録音が可能シナプス伝達効率インチ アメフラシの培養系のさらなる利点は、神経細胞が培養4,5でシナプス-特異性を示すという事実に由来しています。このように、感覚ニューロンは、それ自体（autapses）でまたは他の感覚ニューロンとシナプスを形成しない、またかれらは、培養中の非標的同定された運動ニューロンとシナプスを形成してください。 varicosities、感覚および運動ニューロン間のシナプス接触部位は、光学顕微鏡レベルで検討する対象の運動ニューロンとのシナプス形成を（だけでなく、シナプスの形態変化）を許可する（直径2-6：ミクロン）に十分な大きさです。 このビデオでは、我々は彼らの神経節、神経節のプロテアーゼ消化、顕微解剖により結合組織の除去、感覚および運動ニューロンと除去の両方の識別を解剖、麻酔、成人および若年アメフラシを含む感覚運動ニューロンの培養を、準備の各ステップを示す顕微解剖によって各細胞型の、運動ニューロン、培養運動ニューロンとの接触を形成するために感覚神経の感覚神経や操作の追加のメッキ。

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Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

の初代培養<em&gt;アメフラシ</em&gt;感覚運動ニューロンは、シナプス形成とシナプス可塑性を研究するためのモデルの準備をしなくては<em&gt; in vitroで</em&gt;。このビデオでは、より感覚および運動ニューロンの同定とマイクロダイセクションを示しています<em&gt;アメフラシ</em&gt;節と同様に文化の中で感覚運動ニューロンを確立し、維持するための方法。

の準備アメフラシ感覚運動神経細胞の培養

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

preparation-of-aplysia-sensory-motor-neuronal-cell-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

15.9K ビュー.  University of California, Los Angeles. の初代培養アメフラシ感覚運動ニューロンは、シナプス形成とシナプス可塑性を研究するためのモデルの準備をしなくては in vitroで。このビデオでは、より感覚および運動ニューロンの同定とマイクロダイセクションを示していますアメフラシ節と同様に文化の中で感覚運動ニューロンを確立し、維持するための方法。

ビデオ: Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In general, the differentiation of ES cells follows the concept to first generate immature progenitor cells, which then can be propagated and differentiated into mature cellular phenotypes. This also applies for ES cell-derived neurogenesis, in which the development of neural cells follows two major steps: First, the derivation and expansion of immature neuroepithelial precursors and second, their differentiation into mature neural cells. A common method to produce neural progenitors from ES cells is based on embryoid body (EB) formation, which reveals the differentiation of cells from all germ layers including neuroectoderm. An alternative and more efficient method to induce neuroepithelial cell development uses stromal cell-derived inducing activity (SDIA), which can be achieved by co-culturing ES cells with skull bone marrow-derived stromal cells (1). Both, EB formation and SDIA, reveal the development of rosette-like structures, which are thought to resemble neural tube- and/or neural crest-like progenitors. The neural precursors can be isolated, expanded and further differentiated into specific neurons and glia cells using defined culture conditions. Here, we describe the generation and isolation of such rosettes in co-culture experiments with the stromal cell line MS5 (2-5).

Derivation of neuroepithelial precursors from embryonic stem (ES) cells using stromal cell-derived inducing activity (SDIA).

ES細胞由来の神経上皮細胞の培養

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

生物学

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

解離マウス皮質ニューロンの培養の準備

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

成長円錐の高分解能イメージングのためのアメフラシから神経細胞の培養

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2 - dGuo処理した胸腺器官培養の準備

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

コンパートメント文化の後根神経節ニューロンの準備とメンテナンス

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

ニューロンとグリアの開発研究ラットの脳の集計文化の調製

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Methods Article

の準備アメフラシ感覚運動神経細胞の培養