この研究は、中国国家自然科学基金会(82130113)、中国国家自然科学基金会(82204765)、四川省自然科学基金会(2022NSFSC1470)、四川省ポスドク特別資金プロジェクト(TB2023020)、成都中医薬大学の興林奨学生研究促進プログラム(BSH2021030)によって資金提供されました。これらの資金は、実験装置、実験材料、出版料などの支援となります。

1. 事前準備
<ol><li>サンプル調製<ol><li>1/10,000の感度天秤を使用して、3 mLの微量遠心チューブに0.25 g(乾燥重量)のAPBを秤量し、2.5 mLのメタノールを加えた後、30分間超音波処理します(出力240 W、周波数40 kHz)。</li>
		<li>1.2 x g で5分間遠心分離を行い、上清を回収し、孔径0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過します。</li>
	</ol></li>
	<li>実験材料の準備<ol><li>二次元移動相を調製し、有機相B相としてアセトニトリルを使用し、水相Aとして0.1%ギ酸超純水を構成します。</li>
		<li>二相ろ過(0.22μm)を行い、超音波装置(40kHz)を用いて15分間超音波処理します。交換した移動相をパージして、気泡を除去します。この実験では、C18カラムを1Dカラム、親水性カラムを2Dカラムとして、カラムを装置に取り付けました。</li>
	</ol></li>
	<li>適切なシャント比の調整<ol><li>2D-LC装置のアウトラインをティーを介してマスインレットに接続し、ティーのもう一方の端をシャントラインに接続します。質量スペクトルへの流量が0.3〜0.5mL / minになるように、流量を適切な値に調整します。 注:2D-LC の 2 次元は通常 2 mL/分以上に設定されているため、この流速は MS には大きすぎるため、スプリットを実行する必要があります。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 2D-LC操作
<ol><li>Instrument 1 Onlineアイコンをダブルクリックすると、ケミカルワークステーションが自動的に1260 LCと通信し、ワークステーションに入ります。</li>
	<li>2D-LCメソッドパラメータ設定では、ViewメニューからMethod and Run Control画面を選択し、通常はデフォルトで入力される目的のインターフェースを呼び出します。インジェクターモジュールをクリックし、[メソッド]を右クリックして、1Dポンプの注入量、流速、移動相の時間勾配を設定します。</li>
	<li>[停止時間] にサンプルの実行時間を入力します。メインメニューの「Instrument」をクリックし、ドロップダウンメニューの「2D-LC Method」をクリックします。2D-LCモードで[包括的]を選択します。Modulation timeに2分、2D Gradient Stop時間に1.9分を入力します。[Flow Settings]を[2 mL]に設定します。2D-Gradientを編集し、波長に設定します。メソッドを編集した後、「メソッド」メニューの「名前を付けてメソッドを保存」を選択して新しいメソッドに名前を付け、「OK」をクリックします。 注:外部移送ポンプでは、流量を手動で設定する必要があります。</li>
</ol>3. MS操作
<ol><li>真空ポンプのスイッチをONにします。アルゴンシリンダーのメインバルブと分圧器バルブを開き、圧力を約0.3MPaに調整します。窒素バルブを開きます。</li>
	<li>実験条件に十分な真空を確保するために、少なくとも8時間待ちます。分析する前に、アルゴンと窒素の空気圧が十分に高いことを確認してください。</li>
	<li>MS制御ソフトウェアを起動するには、ソフトウェアパネルの [Heating SEI Source ]をクリックし、ヒーター温度(350 °C)、シース流量(35 arb)、補助空気流量(15 arb)、スプレー電圧(ポジティブモードで3.8 KV、ネガティブモードで-2.5 KV)、キャピラリー温度(275 °C)などのMSパラメータを入力します。 Apply ボタンをクリックして、イオン源を活性化します。</li>
	<li>MSメソッドを設定するには、値を入力して、取り込み時間、極性、質量範囲、転写値番号、転写値持続時間などを設定します。MS 実行時間 (分): 93.00 を設定します。ScanEventの詳細を設定します:ITMS + c norm o(100.0-1200.0)、CV = 0.0v。ITMS + c ノルム Dep MS/MS、(1) からの最も強度の高いイオン: 活性化タイプ: CID、必要な最小信号: 500、分離幅: 2.00、正規化された結合エネルギー: 35.0、デフォルトの充電状態: 3、活性化 Q: 0.250、活性化時間: 93.000.データ依存の設定を行うには、別々の極性設定を無効にします。「Neutral loss in top:3」、「Product in top:3」です。「 Save 」をクリックして、装置メソッドとして設定を構成します。 メモ: 実行時間の終了時間は 2D-LC と一致しています。</li>
	<li>「Sequence Setup」ボタンをクリックして、シーケンステーブルを開きます。サンプルの種類、ファイル名、パス、サンプルID、装置メソッド、場所、注入量、およびその他の情報をフォームに入力します。</li>
	<li>「Save」ボタンをクリックしてシーケンスリストを記録し、「Start Analysis」ボタンをクリックしてMS取得をセットアップして開始します。2D-LC装置のRun Controlをクリックし、Run Methodを選択します。同時に、MS 装置は「実行」ボタンもクリックします。 注:この実験では、2D-LCとMSは同じソフトウェアで制御されないため、両方の装置で別々に設定する必要があります。</li>
</ol>4. 分子ネットワーク操作
<ol><li>データ準備:2D-HPLC-MSの生質量スペクトルデータをエクスポートし、ProteoWizardのMsconvertを介して二次質量スペクトルデータをmzXMLまたはmzMLデータに変換します。(http://proteowizard.sourceforge.net/)。</li>
	<li>データをアップロードするには、公式WebサイトでWinSCPソフトウェアをダウンロードし、FTPプロトコルを介してGNPSが作成したアカウントにmzMLデータをアップロードします。インストールが完了したら、WinSCPを起動します。</li>
	<li>GNPS FTP サーバーに接続する: WinSCP インターフェイスの [セッション 構成] ページで、次の接続情報を入力します。 ファイル プロトコル: FTP を選択します。[ホスト名] に massive.ucsd.edu. と入力し、[ポート番号] にデフォルトの 22 のままにします。</li>
	<li>アカウント番号とパスワードを入力します。上記の情報を入力したら、[ ログイン ]ボタンをクリックしてGNPSFTPサーバーへの接続を確立します。</li>
	<li>Webブラウザを開き、GNPSのWebサイト(https://gnps.ucsd.edu/)にアクセスして、分子ネットワークを作成します。新規ユーザーは、アカウントにサインアップしてからログインする必要があります。</li>
	<li>GNPS Webサイトのメインインターフェイスで、上部のナビゲーションバーの [タスク ]タブをクリックし、ドロップダウンメニューから [新しいタスクの作成 ]を選択します。タスク作成ページで、[ ファイルの追加 ] ボタンをクリックし、データ ファイルを選択してアップロードします。(例:mzML形式)。</li>
	<li>[タスク パラメーター] タブで、MN を生成するさまざまなパラメーターを設定します。これらのパラメータには、ピーク抽出アルゴリズム、ピークオーバートラベル値、類似性計算方法などが含まれます。必要に応じて、適切なパラメータ設定を行います。ページの下部にある 「Launch Analysis 」ボタンをクリックして、タスクを実行します。</li>
	<li>タスクの実行後、タスクリストで作成したタスクを見つけ、[ サービス名 ] をクリックして分析結果を表示します。このWebサイトでは、MN図、代替図、共生ネットワーク、およびその他の関連情報を提供しています。</li>
</ol>

2D-HPLC-MSと分子ネットワーキングを用いたチベットの薬用植物APBの分析

<ol>
	<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+Tibetan+and+traditional+Chinese+medicine+body+constitutions:+A+cross-sectional+study+of+Tibetan+college+students+in+the+Tibet+Autonomous+Region.">Correlation between Tibetan and traditional Chinese medicine body constitutions: A cross-sectional study of Tibetan college students in the Tibet Autonomous Region.</a> J Tradl Chinese Med Sci. 5 (3), 215-221 (2018).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+identification+of+compound+structure+in+Tibetan+medicine+using+ion+trap+mass+spectrometry+and+multiple-stage+fragmentation+analysis.">Standardized identification of compound structure in Tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis.</a> J Vis Exp. (193), 65054 (2023).</li><li>Kumar, P. R., Dinesh, S. R., Rini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCMS-a+review+and+a+recent+update.">LCMS-a review and a recent update.</a> J Pharm Pharm Sci. 5, 377-391 (2016).</li><li>Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+identification+and+quantitative+analysis+of+the+phytochemicals+of+traditional+Chinese+medicine+by+LC-MS/MS.">Strategy for the identification and quantitative analysis of the phytochemicals of traditional Chinese medicine by LC-MS/MS.</a> Acta Pharm Sinica. 55 (7), 1494-1503 (2020).</li><li>Iguiniz, M., Heinisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+liquid+chromatography+in+pharmaceutical+analysis.+Instrumental+aspects,+trends+and+applications.">Two-dimensional liquid chromatography in pharmaceutical analysis. Instrumental aspects, trends and applications.</a> J Pharma Biomed Anal. 145, 482-503 (2017).</li><li>Ye, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+progress+of+2D-LC+in+analysis+and+quality+control+of+traditional+Chinese+medicine.">Application progress of 2D-LC in analysis and quality control of traditional Chinese medicine.</a> Chem Reag. 44 (8), 1103-1110 (2022).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+comprehensive+two-dimensional+hydrophilic+interaction+chromatography+x+reversed-phase+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+phenolic+acids+in+Salvia+miltiorrhiza.">Online comprehensive two-dimensional hydrophilic interaction chromatography x reversed-phase liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry for the analysis of phenolic acids in Salvia miltiorrhiza.</a> J Chromatogr A. 1536, 216-227 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+characterization+of+phenolic+and+diterpenoid+constituents+in+Danshen+(Salvia+miltiorrhiza)+by+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass.">Qualitative and quantitative characterization of phenolic and diterpenoid constituents in Danshen (Salvia miltiorrhiza) by comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass.</a> J Chromatogr. 1427, 79-89 (2016).</li><li>Wang, J., Ren, X., Wen, C., Xu, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+characterization+of+unknown+impurities+in+rutin+tablets+using+trap-free+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+ion+trap/time-of-flight+mass+spectrometry.">Separation and characterization of unknown impurities in rutin tablets using trap-free two-dimensional liquid chromatography coupled with ion trap/time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (10), e8739 (2020).</li><li>Ma, L. J., Ma, N., Cao, J. L., Wan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+influence+of+different+drying+methods+on+chemical+components+of+Panax+notoginseng+leaves+by+heart-cutting+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+orbitrap+high-resolution+mass+spectrometry.">Characterizing the influence of different drying methods on chemical components of Panax notoginseng leaves by heart-cutting two-dimensional liquid chromatography coupled to orbitrap high-resolution mass spectrometry.</a> Food Chem. 369, 130965 (2022).</li><li>Wong, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+profiling+of+Glycyrrhiza+glabra+extract+with+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography-mass+spectrometry+using+multi-segmented+shift+gradients+in+the+second+dimension:+Expanding+the+metabolic+coverage.">Untargeted profiling of Glycyrrhiza glabra extract with comprehensive two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry using multi-segmented shift gradients in the second dimension: Expanding the metabolic coverage.</a> Electrophoresis. 39 (15), 1993-2000 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensively+qualitative+and+quantitative+analysis+of+ginsenosides+in+Panax+notoginseng+leaves+by+online+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+with+deeply+optimized+dilution+and+modulation+system.">Comprehensively qualitative and quantitative analysis of ginsenosides in Panax notoginseng leaves by online two-dimensional liquid chromatography coupled to hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry with deeply optimized dilution and modulation system.</a> Anal Chim Acta. 1079, 237-251 (2019).</li><li>Nothias, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature-based+molecular+networking+in+the+GNPS+analysis+environment.">Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment.</a> Nat methods. 17 (9), 905-908 (2020).</li><li>Qin, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS/MS-based+molecular+networking:+an+efficient+approach+for+natural+products+Dereplication.">MS/MS-based molecular networking: an efficient approach for natural products Dereplication.</a> Molecules. 28 (1), 157 (2023).</li><li>Qu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multidimensional+chromatography-mass+spectrometry+and+feature-based+molecular+networking+methods+for+the+systematic+characterization+of+compounds+in+the+supercritical+fluid+extract+of+Tripterygium+wilfordii+Hook+F.">Combining multidimensional chromatography-mass spectrometry and feature-based molecular networking methods for the systematic characterization of compounds in the supercritical fluid extract of Tripterygium wilfordii Hook F.</a> Analyst. 148 (1), 61-73 (2023).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+analytical+strategy+integrating+offline+two-dimensional+liquid+chromatography+with+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+and+molecular+networking:+Comprehensive+characterization+of+HuangLian+JieDu+Decoction+as+a+case+study.">An enhanced analytical strategy integrating offline two-dimensional liquid chromatography with high-resolution accurate mass spectrometry and molecular networking: Comprehensive characterization of HuangLian JieDu Decoction as a case study.</a> J Sep Sci. 45 (14), 2734-2745 (2022).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+Sanguisorba+officinalis+using+offline+two-dimensional+mixed-mode+liquid+chromatography+&#215;+reversed-phase+liquid+chromatography,+tandem+high-resolution+mass+spectrometry,+and+molecular+network.">Comprehensive profiling of Sanguisorba officinalis using offline two-dimensional mixed-mode liquid chromatography &#215; reversed-phase liquid chromatography, tandem high-resolution mass spectrometry, and molecular network.</a> J Sep Sci. 45 (10), 1727-1736 (2022).</li><li>Chen, Y., Montero, L., Luo, J., Li, J., Schmitz, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+new+at-column+dilution+(ACD)+modulator+for+the+two-dimensional+RP&#215;+HILIC+analysis+of+Buddleja+davidii.">Application of the new at-column dilution (ACD) modulator for the two-dimensional RP&#215; HILIC analysis of Buddleja davidii.</a> Anal Bioanal Chem. 412 (7), 1483-1495 (2020).</li><li>Zhou, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+action+and+toxicity+of+Aconite+and+its+main+components.">Pharmacological action and toxicity of Aconite and its main components.</a> Acta Pharm Sinica. (05), 394-400 (1983).</li><li>Shao, X., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+role+of+14-Benzoylaconine+in+rheumatoid+arthritis.">Progress in the role of 14-Benzoylaconine in rheumatoid arthritis.</a> Chinese J Pharmacol Toxicol. 33 (10), 917 (2019).</li><li>Hao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Study on the chemical constituents of the alkaloids from the root of Aconitum flavum HandMazz and its anti-tumor activities. , (2015).</li><li>Han, X., Hou, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+the+pharmacological+effects+and+toxicity+of+Aconitine.">Research progress on the pharmacological effects and toxicity of Aconitine.</a> J China Prescrip Drug. 12 (12), 149-150 (2014).</li></ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

この実験の主な焦点は、2次元液相分離の枠組み内での部分法の最適化でした。これを達成するために、新しいアットカラム希釈モジュレーターを 2 次元液体クロマトグラフィー(2D-LC)システムにシームレスに統合しました。この技術的な調整は、APBとして知られるチベット医学に存在する化学成分のプロファイリングの習熟度を大幅に向上させたため、最も重要でした。2D-HPLC-MS技術を組み込?...

チベット医学は、チベットの医療行為の原則を遵守し、伝統的な中国医学の不可欠な部分であり、病気の予防と治療に使用されます1。しかし、チベットの漢方薬には、含有量の大幅な変動を特徴とする複雑な植物化学成分が含まれています。基本的な生理活性元素の理解が限られていることが、チベット医学の近代化のボトルネックとなっています2。クロマトグラフィーの強力な分離力と質量分析(MS)の高感度を組み合わせた液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)の応用は、自然医学分析で広く使用されています3。しかし、単一の分離メカニズムには制限があるため、構造が類似性の高い成分は、1次元液体クロマトグラフィー分離で共溶出する傾向があります。その後の質量分析では、高存在量成分4によるイオン抑制により、低存在量の共溶出成分を検出することが困難でした。
2D-HPLCは、Two-Dimensional High-Performance Liquid Chromatographyの略で、一対のカラムを使用して異なる分離メカニズムを調和的に組み合わせた新しいクロマトグラフィー法です。これには、順相クロマトグラフィーと逆相液体クロマトグラフィー、および親水性相互作用液体クロマトグラフィーと逆相液体クロマトグラフィーとの融合または交互使用が含まれます5。これらの相補的なクロマトグラフィー特性を融合させることで、分離能力が向上し、複雑なサンプルマトリックス6が引き起こす課題に効果的に対処できます。さらに、2次元クロマトグラフィーとMSを結合させることで、2D-HPLCの強力な分離能とMSの高感度検出能力を存分に発揮することができ、複雑な薬物系とその基本成分の研究を支援することができる7,8,9。
チベット医学は一般的に、多面的な成分と機能性を特徴としており、有効成分は通常、複雑な組成で最小限の濃度で存在します。2D-LCを堅牢な分離システムとして、MSを非常に高感度な検出器として統合することにより、分離と同定の観点から複雑なサンプルがもたらす課題により効果的に対処できます10、11、12。この合併は、チベット医学の化学組成の探求を前進させることに大きく貢献しています。
従来のLC-MSでも2D-LC-MSでも、膨大な情報を得ることができます。しかし、この膨大な情報から複雑なシステム部品の構造情報を抽出することは、常に大きな課題でした。そのため、研究者はMSデータのスクリーニングとマイニングのためのさまざまな方法を開発してきました。Global Natural Products Social Molecular Networking(GNPS)は、2D-LC-MS質量分析データをアップロードできるMS/MSデータ整理および可視化プラットフォームです13。各スペクトルはベクトルと見なされ、コサイン類似度を使用して他のすべてのスペクトルと比較されます。2つのスペクトル間の類似性が閾値を超えると、それらは分子ネットワーク(MN)で接続されます。これは、既知の化合物の迅速な同定および種々の未知の天然物の測定に用いることができる14。
チベット医学は通常、複数の機能を持っていますが、その複雑な組成と大きな濃度の違いにより、機能と物質的基礎との関係を効果的に解明することは困難です15。チベット医学の詳細な研究には、できるだけ多くの成分を体系的に特徴づけることが必要です。本研究の枠組みでは、チベット医学におけるAPBを研究対象として、2D-HPLC-MS技術とMN技術を用いてチベット医学の複雑な化学成分を体系的に研究する戦略とプロセスを実証するつもりです。2D クロマトグラフィーシステムの構築では、逆相液体クロマトグラフィーと親水性相互作用液体クロマトグラフィーを重要な分離メカニズムと組み合わせて、APB16 の複雑な成分をより効果的に分離することを達成しました。さらに、2つの次元間の溶媒の不適合を克服するために、アットカラム希釈変調モードが採用されました。2D-LCの強力な分離機能とMSの高感度検出能力を組み合わせることで、APBの複雑な成分のスペクトル情報をより効果的かつ包括的に取得できます。さらに、MN技術による膨大なスペクトル情報のネットワーク化と可視化により、APBの構成要素を系統的に解析します。本研究で実証された戦略とプロセスは、他のチベット医薬品の研究にも応用されることが期待され、チベット医学の物質的基礎に関する研究を促進することは、チベットの医薬品資源の進歩とチベットのハーブの品質管理基準の向上にとって大きな意義を持つ17。全体的な実験プロセスを 図 1 に示します。
ここで提示した実験では、新しいアットカラム希釈調節器をAgilentの2次元液体クロマトグラフィー(2D-LC)システム18に導入した。独立した吐出ポンプを追加することで、解析の流路を変更し、2D-LC解析の直交性を高めました。2 つの寸法間の結合と切り替えは、 図 2 に示すように、2 つの 6 ポート バルブによって行われます。1 つ目の次元に 1 つのサンプル ループが埋められると、2 つ目の次元で別のサンプル ループが解析されます。これは、1Dループの充填時間と2Dの実行時間が等しいことを意味します。これには、2次元のバイナリポンプによって生成される高速勾配が必要です。全体の排水を分析するときにピークが失われることはありません。これは、未知のサンプルの分析に特に役立ちます。その結果、データ解析のために組み合わせる必要のある多数の2Dクロマトグラムが生成されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>F22M81203</td>
			<td>Mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aconitum pendulum</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Herb medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2198-90001</td>
			<td>Liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringes</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>3ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid phase injection bottle</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1.5ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ XL Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LTQ21991</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microporous membranes&#160;</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate XB-C18,5 &#956;m,2.1 x 200 mm</td>
			<td>Welch</td>
			<td>00201-31015</td>
			<td>Reversed-phase column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>UGT20DEC048Y</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAmide,3 &#956;m,100A</td>
			<td>Dalian Mondi Technology</td>
			<td>D2019110601</td>
			<td>Hydrophilic column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d-hplc-ms technology combined with molecular network for the identification of components in tibetan medicine aconitum pendulum

本研究では、2D-HPLC-MS技術と分子ネットワークを併用し、チベットの薬用植物APBの複雑な化学組成を解明する包括的なアプローチを採用しました。2D-HPLCの導入により、複雑な混合物の分離が向上し、その後の分析のために個々の化合物を単離することが可能になりました。分子ネットワークアプローチは、これらの化合物間の構造的関係の解明にさらに役立ち、潜在的な生理活性分子の決定に貢献しました。この統合戦略により、プラント内に存在するさまざまな化学成分を効率的に特定することができました。その結果、APBにはアルカロイドなど、さまざまな化学成分が含まれていることが明らかになりました。この研究は、この伝統的なチベット医学の植物化学的プロファイルの理解を進めるだけでなく、その潜在的な治療特性に関する貴重な洞察も提供します。2D-HPLC-MSと分子ネットワークの統合は、漢方薬の複雑な化学組成を体系的に探索および同定するための強力なツールであることが証明されており、天然物発見の分野におけるさらなる研究開発への道を開きます。

Tibetan medicine is an integral part of traditional Chinese medicine, adhering to the principles of Tibetan medical practices, and is used for disease prevention and treatment1. However, Tibetan herbal medicine contains complex plant chemical constituents characterized by significant fluctuations in content. Limited understanding of the fundamental bioactive elements has become a bottleneck in the modernization of Tibetan medicine2. The application of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), combining the strong separation power of chromatography with the high sensitivity of mass spectrometry (MS), has been widely used in natural medicine analysis3. However, due to the limitation of a single separation mechanism, components with highly similar structures tend to coelute in one-dimensional liquid chromatography separation. In subsequent mass spectrometric analysis, the low-abundance co-eluted components are difficult to detect due to ion suppression caused by high-abundance components4.
2D-HPLC, which stands for two-dimensional high-performance liquid chromatography, represents a novel chromatographic method that harmoniously combines different separation mechanisms using a pair of columns. This includes the fusion or alternation of normal-phase chromatography with reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with reversed-phase liquid chromatography5. By merging these complementary chromatographic properties, the enhanced separation capability is achieved, effectively addressing the challenges caused by complex sample matrices6. Furthermore, by coupling two-dimensional chromatography with MS, the powerful separation ability of 2D-HPLC and the high sensitivity detection capability of MS can be fully integrated, providing support for the study of complex drug systems and their fundamental constituents7,8,9.
Tibetan medicine commonly features a multifaceted array of components and functionalities, where active ingredients typically exist in intricate compositions and at minimal concentrations. By integrating 2D-LC as a robust separation system and MS as an exceedingly sensitive detector, the challenges posed by intricate samples in terms of separation and identification can be more effectively addressed10,11,12. This amalgamation substantially contributes to advancing the exploration of the chemical composition of Tibetan medicine.
Regardless of whether it is traditional LC-MS or 2D-LC-MS, a vast amount of information can be obtained. However, extracting structural information of complex system components from this massive amount of information has always been a significant challenge. Therefore, researchers have developed various methods for screening and mining MS data. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) is an MS/MS data organization and visualization platform where 2D-LC-MS mass spectrometry data can be uploaded13. Each spectrum is considered as a vector and compared to all other spectra using cosine similarity. When the similarity between two spectra exceeds a threshold, they are connected in a molecular network (MN). This can be used for the rapid identification of known compounds and the determination of various unknown natural products14.
Tibetan medicine usually has multiple functions, but its complex composition and significant concentration differences make it difficult to effectively elucidate the relationship between function and material basis15. An in-depth study of Tibetan medicine requires the systematic characterization of as many components as possible. In the framework of this study, we intend to use APB in Tibetan medicine as the research object to demonstrate the strategy and process of systematically studying the complex chemical components of Tibetan medicine using 2D-HPLC-MS technology and MN technology. In the construction of the 2D chromatographic system, we combined reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with significant separation mechanisms to achieve more effective separation of the complex components of APB16. In addition, to overcome solvent incompatibility between the two dimensions, an at-column dilution modulation mode was adopted. By combining the powerful separation capability of 2D-LC with the high sensitivity detection capability of MS, the spectral information of the complex components in APB is obtained more effectively and comprehensively. Furthermore, through the network and visualization of massive spectral information by MN technology, the components of APB are systematically analyzed. The strategy and process demonstrated in this study are expected to be applied to the study of other Tibetan medicines, promoting research on the material basis of Tibetan medicine, which is of great significance for advancing Tibetan medicine resources and improving quality control standards for Tibetan herbs17. The overall experimental process is shown in Figure 1.
In the experiment presented here, a new at-column dilution modulator was introduced into the Agilent two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) system18. By adding an independent delivery pump, the flow path of the analysis was changed, resulting in a high orthogonality of the 2D-LC analysis. The coupling and switching between the two dimensions are accomplished by two six-port valves, as shown in Figure 2. When one sample loop is filled in the first dimension, another sample loop is analyzed in the second dimension. This means that the filling time of the 1D loop and the running time of the 2D are equal. This requires the fast gradient generated by the Binary pump in the second dimension. No peaks are lost when the entire effluent is analyzed. This is particularly helpful for the analysis of unknown samples. It results in a large number of 2D chromatograms that need to be combined for data analysis.

注目の著者:自然医学分析における 2D-HPLC-MS と分子ネットワーキングの統合(英語)

チベット医学トリカブト振り子中の成分同定のための分子ネットワークと組み合わせた2D-HPLC-MS技術

In this study, we employed a comprehensive approach utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with molecular networking to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant APB. We want to establish a more efficient method for identifying the chemical composition of natural medicines. The main challenging of the current experiments is that the mass spectrometry section is not equipped with high-resolution mass spectrometry, resulting in the detection of different components.2D-LC-MS enables more accurate identification and the quantification of the compounds. Complex mixtures based on sample separation, combined with molecular network technology, it can be better process complex data information and it improves the efficiency and the accuracy of any size. Our laboratory will focus applying existing technologies to get the separation of natural, medicinal, chemical components.

APBは、MN法と組み合わせた2D-HPLC-MSテクノロジーの実現可能性を検証するためのモデル生物として利用されました。パラメーターをデフォルトに設定して MS の生データを MN にインポートすると、MN が生成されました。MNは、完全なLC-MS-MS実験で検出されたすべての分子イオンと、これらの分子イオン間の化学関係を視覚化する視覚的な計算戦略です13。
MN?...

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この研究では、2次元高速液体クロマトグラフィー-質量分析(2D-HPLC-MS)技術と分子ネットワークを組み合わせて、チベットの薬用植物 であるトリカブ ト振り子ブッシュ(APB)の複雑な化学組成を解明します。この記事では、漢方薬の複雑な化学成分を体系的に調査し、同定するための詳細なプロトコルを提供します。

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate ...

本研究では、2D-HPLC-MS技術と分子ネットワークを併用した包括的なアプローチにより、チベットの薬用植物APBの複雑な化学組成を解明しました。私たちは、天然医薬品の化学組成をより効率的に同定する方法を確立したいと考えています。現在の実験の主な課題は、質量分析セクションに高分解能質量分析が装備されていないため、さまざまな成分が検出されることです。2D-LC-MSは、化合物のより正確な同定と定量を可能にします。サンプル分離に基づく複雑な混合物と分子ネットワーク技術を組み合わせることで、複雑なデータ情報をより適切に処理し、あらゆるサイズの効率と精度を向上させることができます。私たちの研究室では、既存の技術を適用して、天然、薬用、化学成分の分離に焦点を当てます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

2D-HPLC-MS Technology Combined with Molecular Network for the Identification of Components in Tibetan Medicine Aconitum pendulum

292 ビュー.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. 本研究では、2D-HPLC-MS技術と分子ネットワークを併用した包括的なアプローチにより、チベットの薬用植物APBの複雑な化学組成を解明しました。私たちは、天然医薬品の化学組成をより効率的に同定する方法を確立したいと考えています。現在の実験の主な課題は、質量分析セクションに高分解能質量分析が装備されていないため、さまざまな成分が検出されることです?...

ビデオ: 注目の著者:自然医学分析における 2D-HPLC-MS と分子ネットワーキングの統合(英語)

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant APB. Through the implementation of 2D-HPLC, enhanced separation of complex mixtures was achieved, enabling the isolation of individual compounds for subsequent analysis. The molecular network approach further aided in elucidating structural relationships among these compounds, contributing to the determination of potential bioactive molecules. This integrated strategy efficiently identified a wide array of chemical components present within the plant. The findings revealed a diverse spectrum of chemical constituents within APB, including alkaloids, among others. This research not only advances understanding of the phytochemical profile of this traditional Tibetan medicine but also provides valuable insights into its potential therapeutic properties. The integration of 2D-HPLC-MS and molecular network proves to be a powerful tool for systematically exploring and identifying complex chemical compositions in herbal medicines, paving the way for further research and development in the field of natural product discovery.

This study utilizes two-dimensional high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (2D-HPLC-MS) technology in conjunction with molecular networking to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant Aconitum pendulum Busch (APB). The article provides a detailed protocol for the systematic exploration and identification of complex chemical components of herbal medicines.

医学

Sample Preparation for 2D-HPLC-MS of Aconitum pendulum

Begin sample preparation by weighing the aconitum pendulum bush, or APB. Using a one by 10, 000 sensitivity balance, weigh 0.25 grams of dry APB in a three milliliter micro centrifuge tube. Add 2.5 milliliters of methanol to it and then sonicate for 30 minutes at a power of 240 watts and a frequency of 40 kilohertz.Centrifuge the sonicated sample at 1.2G for five minutes, and collect the supernatant. Filter it through a 0.22 micron membrane filter. Next, prepare the two-dimensional mobile phase by using acetyl nitrile as the organic phase or phase B, and ultra pure water containing 0.1%formic acid as the aqueous phase or phase A.After performing two-phase filtration through the 0.22 micron filter, subject the mobile phases to ultrasonic sonication at 40 kilohertz for 15 minutes.Purge the replaced mobile phase to remove the bubbles. Select a C18 column as the 1D column and a hydrophilic column as the 2D column, and mount them to the instrument. To adjust the appropriate shunt ratio, connect the 2D-LC instrument outline through a T to the mass inlet and the other end of the T to a shunted line.Adjust the flow rate to a suitable value to ensure the appropriate flow rate for the mass spectrum.

トリカブトム振り子の2D-HPLC-MS用試料調製

Implementing 2D-Liquid Chromatography on Aconitum pendulum Samples for Enhanced Compound Separation

To begin the 2D liquid chromatography, or 2DLC, double-click the instrument one online icon, and the chemical workstation will automatically communicate with the 1260LC and enter the workstation. For the 2DLC method parameter setting, click on the Injector module, right-click Method and set the injection volume, flow rate, and mobile phase time gradient of the 1D pump. Enter the sample runtime under Stop Time.Click on the main menu instrument and click 2DLC Method on the dropdown menu. Select Comprehensive in 2DLC mode. Enter two minutes at modulation time and 1.9 minutes at 2D gradient stop time.Set flow settings to two milliliters. Edit 2D gradient and set wavelengths. After editing the method, select Save Method As on the method menu to name the new method, and click OK.

トリカブト振り子サンプルへの2D-液体クロマトグラフィーのインプリメンテーションによる化合物分離の強化

Mass Spectrometry Following the 2D-LC Operation on Aconitum pendulum Samples

To begin, turn on the switch of the vacuum pump. Open the argon cylinder main valve and the pressure divider valve, and adjust the pressure to about 0.3 megapascals. To set up the MS method, enter the runtime in minutes to 93.00 and enter values to configure acquisition time, polarity, mass range, transfer value number, transfer value duration, and more.Set up scan event details according to the values displayed on the screen. To set data dependent settings, use separate polarity settings as disabled. Set neutral loss within top to three, and product mass list within top to three.Save to configure the settings as the instrument method. Click the sequence setup button to open the sequence table. Enter the sample type, file name, path, sample id, instrument method, location, injection amount, and other information in the form.Save the information to record the sequence listing. Then click the start analysis button to set up and start MS acquisition.

トリカブトム振子サンプルに対する2D-LC操作後の質量分析

Integration of Molecular Network Operation to 2D-HPLC-MS for the Analysis of Aconitum pendulum Samples

To begin the data preparation, export 2D HPLC-MS raw mass spectral data. Next to connect to the GNPS FTP server in the WINSCP interface on the Session Configuration page, fill in the connection information. After filling in the information, click the Start button to establish a connection to the GNPS FTP server.Create molecular networks by opening a web browser and visiting the GNPS website. New users need to sign up for an account and then log in. On the main interface of the GNPS website, click Create Molecular Network under Data Analysis.On the Task Creation page, click the select Input Files button, then select and upload the data file. In the Workflow Option tabs, set the various parameters that generate the molecular network or MN.These parameters include the peak extraction algorithm, peak over travel value, similarity calculation method, and so on. After making the appropriate parameter settings as needed, click the Submit button at the bottom of the page to run the task.After the task runs, find the created tasks in the Jobs tab and click the workflow name to view the analysis results. The website provides MN diagrams, substitutes, symbiotic networks, and other related information. Four of the alkaloid components in the APB samples identified by the MN were aconitine, 14-benzoylaconine, 14-O-acetylneoline and hypaconitine.The four compounds had the same parent nucleus. Aconitine, 14-benzyl aconine, 14-benzoylaconine, and hypaconitine were similar, and only the substituents were different.