この研究は、寧波自然科学財団(2022J121、2023J159)、寧波市自然科学財団の主要プロジェクト(2021J256)、復旦大学(復旦大学)の国家高分子工学研究所のオープン財団(K2024-35)、および中国浙江省のアテローム性動脈硬化症の精密医療の主要研究所(2022E10026)の支援を受けました。寧波大学健康科学センターのコア施設による技術サポートに感謝します。

1. κ -カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴の調製
<ol><li>1,000 mLのガラス瓶内の500 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)溶液に1.75 gのκ-カラギーナン粉末を加えて、500 mLのκ-カラギーナン懸濁液浴(0.35%重量/vol)を調製します。</li>
	<li>70 mmのマグネチックスターラーバーをガラス瓶に導入して、水性混合物を攪拌します。ガラス瓶のキャップを締めてから、半回転緩めます。</li>
	<li>ガラス瓶を70°Cのウォーターバスに入れて加熱します。マグネチックスターラーを300rpmの速度でオンにし、ボトルを置き、ポリマーが完全に溶解するまで攪拌します。</li>
	<li>別のガラス瓶をオートクレーブに入れて滅菌し、121°Cで30分間運転します。</li>
	<li>高圧滅菌器が80°Cに冷却されたら、滅菌器からボトルを取り出し、超清潔な作業台に移してさらに取り扱います。</li>
	<li>完全に溶解した κ-カラギーナン溶液を0.22μmフィルターを使用して滅菌ガラス瓶にろ過します。 注:溶液が熱いうちに迅速にろ過を行い、 κ-カラギーナンが冷却されてフィルターを塞ぐのを防ぎます。</li>
	<li>κ-カラギーナン溶液を4°Cで保存し、カチオン架橋ゲル化を12時間誘導します。</li>
	<li>κ-カラギーナンハイドロゲルを、攪拌速度1200rpm、25°Cで60mmマグネチックスターラーを使用して機械的に粉砕し、液体状態に正常に変化するまで約60分かかります。 注: κ-カラギーナンハイドロゲルは、低温でのゲル化や高温での溶解を避けるために、25〜37°Cで保管してください。</li>
</ol>2. ゼラチンメタクリレート/シルクフィブロインメタクリレート複合バイオインクの調製
<ol><li>10%(wt/vol)ゼラチンメタクリレート(GelMA)と6%(wt/vol)シルクフィブロインメタクリレート(SFMA)をPBS溶液(pH 7.4)に組み合わせて、複合バイオインクを調製します。2.0 gのGelMAと1.2 gのSFMA粉末を別々に計量します。</li>
	<li>粉末を2本の50 mL遠心分離チューブにゆっくりと加えます。10 mLのPBS溶液を別々に50 mLの遠心分離チューブに加えます。</li>
	<li>それぞれに10mmのマグネチックスターラーを追加し、45°Cのウォーターバスで常に攪拌し、加熱します。 GelMAおよびSFMA粉末を完全に溶解させ、約30分かかります。</li>
	<li>GelMA溶液とSFMA溶液を等量で混合し、45°Cで連続撹拌します。 100 μmの細孔径フィルターを使用して複合バイオインクをろ過します。</li>
	<li>複合GelMA/SFMAバイオインクをバイオセーフティキャビネット内でUV照射により12時間滅菌します。 注:自己組織化によるSFMAの早期ゲル化を防ぐために、バイオインクをすぐに準備して使用してください。</li>
</ol>3. κ-carrageenanサブマイクロゲル懸濁液浴のレオロジー的特性評価
<ol><li>レオロジー関連機器の立ち上げと準備<ol><li>エアコンプレッサーを30分間オンにし、圧力が30psiに達することを確認します。ベアリングclを取り外しますamp ドローロッドを反時計回りに回して。下の黒いカバーを固定し、機器上部のノブ軸を時計回りに回転させます。</li>
		<li>レオメータの電源を入れ、初期化します。循環水スイッチをオンにし、温度が15°Cに達するのを待ちます。</li>
		<li>レオメータ制御ソフトウェアを開いて、オンライン接続を確立します。</li>
	</ol></li>
	<li>レオメータを校正し、平行プレート形状を取り付けます。<ol><li>制御ソフトウェアで機器のキャリブレーションを実行しますが、これには主にキャリブレーション機器の慣性経路の調整が含まれます。直径40mmの平行プレート形状をドローロッドの端に取り付けます。ロックボタンを3秒間押し続けると、モーターシャフトがホームポジションに移動し、ジオメトリの配置が一定になります。</li>
		<li>制御ソフトウェアでCalibrate Managerを選択し、続いてInertia、Friction Calibration、およびRotational Mappingをクリックして、平行プレート形状をキャリブレーションします。</li>
	</ol></li>
	<li>レオメータのギャップ高さをゼロにするには、標準的なギャップゼロ調整手順を実施して、正確な測定を確保します。</li>
	<li>0.01 から 1000 1/s のせん断速度の範囲のフローランプ、10 rad/s で 0.1% から 100% のひずみ範囲の振幅スイープ、10 rad/s で 1% と 100% の交互ひずみで 60 秒間持続するマルチステップ振動時間スイープ、0.1 1/s と 10 1/s の交互せん断速度で 120 秒間持続するマルチステップピークホールドスイープなどの実験ステップを設定します。</li>
	<li>0.35% κ-カラギーナン懸濁液 2 mL をレオメータのペルチェプレートに滴下します。</li>
	<li>ジオメトリギャップを510μmに配置し、クランプデバイスの端にある余分なオーバーフローを取り除きます。サンプルギャップを500μmに設定して、サンプルがクランプエッジをわずかに超えて伸びるようにします。</li>
	<li>実験計画オプションから フローランプ を選択して、フロー実験を実施します。<ol><li>実験計画で フローランプ 検定を選択します。せん断速度を 25 °C の温度で 0.001 から 10 1/s に設定します。</li>
		<li>ステップ3.5と、追加したサンプルに対してフローランプ実験を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>サイクルピークホールドテストを実施して、材料の回復性能を評価します。<ol><li>実験計画で ピークホールド スイープを選択し、25°Cで120秒の時間で5つの連続した実験を設定します。</li>
		<li>せん断速度を 1 番目、3 番目、5 番目のステップで 0.01 1/s に設定し、2 番目と 4 番目のステップで 10 1/s に設定します。</li>
		<li>2 mLの新しいサンプルを追加します。手順 3.5 と周期的回復テストを実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>粘弾性解析を実施して、 κ-カラギーナン懸濁槽の潜在的なゲルゾル転移を評価します。<ol><li>実験計画で 振幅スイープ 検定を選択します。振動ひずみを25°Cの温度で0.1%から100%に設定します。 [開始 ] をクリックして、追加したサンプルに対して Amplitude Sweep 実験を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>代替ひずみ解析を実行して、材料の弾性回復性能を評価します。<ol><li>実験計画で 「オシレーション・タイム・スイープ 」を選択し、25°Cで60秒の時間で5つの連続した実験を設定します。</li>
		<li>ひずみを 1 番目、3 番目、5 番目のステップで 1% に設定し、2 番目と 4 番目のステップで 100% に設定します。</li>
		<li>2 mLの新しいサンプルを追加します。手順 3.5 と連続循環回復テストを実行します。 注:各実験テストの後にジオメトリプレートとペルチェプレートを清掃し、2mLの新しいサンプルを追加します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. カスタム設計のマイクロ押出バイオプリンターを使用した生体模倣ハイドロゲル足場のプリンティング
<ol><li>3Dグラフィックスソフトウェアを使用してSTL形式のキューブを設計し、3Dデータベースから組織状モデルをダウンロードします(www.thingiverse.com;https://3d.nih.gov/.)。<ol><li>STL形式のモデルをPANGOソフトウェアにインポートし、印刷パラメータを入力します。3D空間でモデルの特定のX、Y、Z座標を設定し、モデルの予想されるスケーリングサイズをミリメートル(mm)で入力し、X、Y、Z軸上のオブジェクトのサイズとスケーリング比を調整し、必要に応じて空間内のモデルの回転角度を調整します。</li>
		<li>推定フィラメント径(ほとんどのバイオインクで通常約200〜500μm)を層の厚さフィールドに入力して、各層のZ軸の厚さを決定します。予想される線の太さ(約10〜90 mm / s)に従って印刷速度を設定し、塗りつぶし密度を30%〜80%に設定します。</li>
		<li>最終パラメータをGコードとしてSDカードにエクスポートします。</li>
	</ol></li>
	<li>バイオプリンターとマイクロ押出ポンプを運転します。<ol><li>マイクロ押出ポンプコントローラーのスイッチを入れ、対応する容量のシリンジ(5 mL)を選択し、押出速度を0.08 mL / minに設定し、ヒドロゲルの容量を押出速度で割った所望の印刷時間に合わせて押出し時間を設定します。</li>
		<li>内径210μmの針でシリンジをバイオプリンターのシリンジスロットに取り付けます。</li>
		<li>シリンジコントローラーを調整して、シリンジのプランジャーがネジに密着していることを確認します。</li>
		<li>35 mmの細胞培養皿に3 mLの懸濁液浴を入れます。コード設定に基づいてディッシュをプラットフォームに配置し、印刷ヘッドがディッシュの底から1mm上にあることを確認します。 注意: 印刷中の印刷プラットフォーム上の皿の位置の精度を確認するために、事前テストを実施します。</li>
		<li>コードが入ったSDカードを3Dバイオプリンターに挿入し、コードをアクティブにします file バイオプリンターを起動し、コントローラーの [開始 ]ボタンをクリックします。</li>
	</ol></li>
	<li>コンストラクトの処理<ol><li>プリントしたコンストラクトを405nmの青色光に1分間さらして、フォトクロスリンクを開始します。</li>
		<li>1 mLピペットを使用して κ-カラギーナンゲルを取り出し、続いて3 mLのPBS(pH 7.4)を添加して洗浄し、その後除去します。このプロセスを繰り返して、徹底的に洗います。 注意: 印刷されたコンストラクトの損傷を避けるために、洗浄プロセスを穏やかに行ってください。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 食道筋層アナログの組み込み3Dバイオプリンティング
<ol><li>ウサギ食道平滑筋細胞(eSMC)を培養します。<ol><li>10% ウシ胎児血清と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した 15 mL の DMEM 培地を使用して、2 x 106 細胞を含む T75 フラスコで培養を開始します。</li>
		<li>5% CO2 と 95% の空気の加湿雰囲気で eSMC を 37 °C に維持し、80% のコンフルエント度に達するまで維持します。</li>
	</ol></li>
	<li>食道筋層バイオインクの調製<ol><li>コンフルエントに達したら培地を吸引し、5 mLの1x PBSでeSMCを洗浄します。</li>
		<li>0.2% Trypsin-EDTAを2 mLフラスコに加え、2分間インキュベートして細胞を消化します。フラスコをタップして、セルを壁から取り外します。</li>
		<li>2 mLのDMEMを添加して消化を終了し、細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移します。細胞懸濁液10μLのセルカウンターを使用して細胞密度を測定します。</li>
		<li>675 x g で3分間遠心分離し、上清を慎重に吸引し、細胞ペレットを複合GelMA/SFMAバイオインクに再懸濁します(ステップ2.1で調製)。バイオインク中の密度が10 x 106 cells/mLになるように最終細胞濃度を調整し、その後の3Dバイオプリンティングアプリケーションの条件を最適化します。</li>
	</ol></li>
	<li>3Dバイオプリンターおよび関連材料の準備<ol><li>シリンジ針、鉗子、マグネチックスターラー、1000mLケイ酸ガラス瓶などの重要な印刷器具を、標準的な滅菌条件(121°Cで30分間)でオートクレーブ処理し、印刷プロセスの無菌環境を確保します。</li>
		<li>バイオプリンターをバイオセーフティキャビネット内に置き、紫外線(UV)で30分間滅菌して無菌性を維持します。</li>
		<li>ステップ1とステップ2でそれぞれ説明したように、50 mLの滅菌 κ-カラギーナンと5 mLの滅菌GelMA/SFMA複合バイオインクを調製します。</li>
		<li>モデルを設計し、必要なパラメーターを設定し、ステップ 4.1 で概説したとおりにバイオプリンターを準備します。</li>
	</ol></li>
	<li>バイオプリンティングプロセスの開始<ol><li>手順4.2および4.3で説明されている手順を実行して、3D食道筋層をバイオプリントし、続いてPBS洗浄と交換を行います。</li>
		<li>印刷プロセス全体を通じて滅菌技術で細胞印刷を行い、印刷構造内の細胞汚染のリスクを最小限に抑えます。</li>
	</ol></li>
	<li>印刷後の細胞培養培地の交換<ol><li>PBSを慎重に吸引し、10%のウシ胎児血清と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを補給した3mLのDMEMと交換します。.最適な細胞増殖条件を提供するために、印刷されたコンストラクトが完全に水没していることを確認してください。</li>
		<li>プリントしたコンストラクトを含む細胞培養皿を、5% CO2で37°Cに設定したインキュベーターでインキュベートします。細胞培養培地を毎日3 mLを使用して新鮮な培地と交換し、光学顕微鏡を使用してコンストラクト内の細胞の状態をモニターします。</li>
	</ol></li>
</ol>6. Live/Deadアッセイ染色によるプリントコンストラクト内のeSMCの生存率の評価
<ol><li>インキュベーションの5時間後に細胞培養培地を取り出し、細胞を含んだコンストラクトをPBSで洗浄します。</li>
	<li>印刷した細胞含んだコンストラクトに、標準的なcalcein-AM/ヨウ化プロピジウム溶液(1:1000)2 mLを加えてインキュベートします。</li>
	<li>45分間のインキュベーション後、コンストラクトをPBSで3回洗浄し、新鮮な細胞培養培地を加えます。</li>
	<li>共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を使用して、生細胞と死細胞を観察し、蛍光画像を撮影します。</li>
</ol>7. FITC-Phalloidin/DAPI染色によるプリンテッドコンストラクト中のeSMCの観察
<ol><li>F-アクチンにはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識ファロイジン(緑)、核には4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、青)を使用して、インキュベーション5日後に印刷したコンストラクトを染色します。</li>
	<li>固定液の調製<ol><li>4 mL の 1x PBS と 0.16 mL のパラホルムアルデヒド(PFA)を 5 mL のポリエチレン(PE)チューブに混合し、最終濃度 4% を達成します。</li>
		<li>バイオプリントされたコンストラクトを含む培養皿を清潔な表面に置きます。培地を取り出し、コンストラクトをPFA溶液で静かに覆い、完全に浸漬させます。溶液を廃棄する前に、室温で20分間固定を進めます。 注:バイオプリントされたコンストラクトの構造的完全性を維持するために、追加および除去プロセス中は液体を慎重に取り扱ってください。</li>
		<li>2.5 mLの1x PBSを培養皿に導入し、コンストラクトを完全に沈めて残留染色試薬を除去します。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞膜の透過化<ol><li>5 mL PEチューブに20 μLのTriton X-100を1x PBS4 mLを加えて、0.5% Triton X-100溶液を調製します。</li>
		<li>Triton X-100溶液をコンストラクトに室温で30分間投与して細胞膜を透過させた後、溶液を除去します。</li>
		<li>2.5 mLの1x PBSを培養皿に導入し、コンストラクトを完全に沈めて残留染色試薬を除去します。</li>
	</ol></li>
	<li>非特異的結合のブロッキング<ol><li>1x PBSの4 mLに0.12 mLのBSAを添加して、5 mLのPEチューブに3%ウシ血清アルブミン(BSA)ブロッキング溶液を作製します。</li>
		<li>BSA溶液を室温で30分間コンストラクトに導入して非特異的部位をブロックし、溶液を廃棄します。</li>
	</ol></li>
	<li>FITC-ファロイジンによるアクチン染色<ol><li>0.2% FITC-ファロイジン溶液を5 mLのPEチューブに調製し、4 mLの1x PBSと8 μLの染色試薬を添加します。</li>
		<li>この溶液に組成物を室温で60分間暗所に浸し、溶液を廃棄します。</li>
		<li>2.5 mLの1x PBSを培養皿に加え、コンストラクトを完全に沈めて残留染色試薬を除去します。</li>
	</ol></li>
	<li>DAPIによる核染色<ol><li>4 mLのDAPI染色溶液をコンストラクトに塗布し、完全にカバーします。</li>
		<li>暗所で室温で20分間インキュベートしてから、DAPI溶液を取り出します。</li>
	</ol></li>
	<li>最終洗浄とPBS浸漬:培養皿に2.5 mLの1x PBSを加え、コンストラクトを完全に浸して残留染色試薬を除去します。 注:染色液はあらかじめ調製し、優しく取り扱ってください。細胞が培養容器内で乾燥してはいけません。</li>
	<li>共焦点顕微鏡による観察:共焦点顕微鏡を使用して染色されたコンストラクトを検査および画像化し、細胞増殖を評価し、結果を包括的に文書化します。</li>
</ol>8. CCK-8アッセイを用いたプリントコンストラクト内のeSMCs増殖の評価
<ol><li>7日目と14日目に培養液をコンストラクトから取り出します。コンストラクトをPBSで洗浄し、残留培地と剥離した細胞を取り除きます。</li>
	<li>製造元の指示に従って、各コンストラクトにCCK-8溶液を追加します。CCK-8溶液の容量が、各コンストラクトを完全に覆うのに十分であることを確認してください。</li>
	<li>コンストラクトをCCK-8溶液と37°Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、上清を新しい96ウェルプレートに慎重に移します。</li>
	<li>マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定します。</li>
</ol>

κ-Carrageenan Sub-Microgel Mediumによる3Dバイオプリンティングの進歩

<ol>
	<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+engineered+fiber+scaffolds+fabricated+by+electrospinning+for+periodontal+tissue+regeneration.">Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration.</a> J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).</li><li>Amann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+graded,+porous+composite+of+natural+biopolymers+and+octacalcium+phosphate+guides+osteochondral+differentiation+of+stem+cells.">A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells.</a> Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692 (2021).</li><li>Afjoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-gelled+alginate/gelatin+scaffolds+for+wound+healing+applications:+An+in+vitro,+in+vivo+study.">Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study.</a> Mater Sci Eng C. 113, 110957 (2020).</li><li>Hasanzadeh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+tissue-engineered+scaffold+polymers+for+3D+printing+and+its+application+for+4D+printing.">Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing.</a> Chem Eng J. 476, 146616 (2023).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage-like+protein+hydrogels+engineered+via+entanglement.">Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement.</a> Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).</li><li>Bertsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+injectable+hydrogels+for+tissue+regeneration.">Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration.</a> Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500758 (2015).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+bioprinting+of+neurovascular+tissue+modeling+with+collagen-based+low-viscosity+composites.">3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites.</a> Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004 (2023).</li><li>Sreepadmanabh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+growth+medium+prepared+by+flash-solidification+of+agarose+for+3d+cell+culture+and+3d+bioprinting.">Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting.</a> Biomed Mater. 18 (4), 045011 (2023).</li><li>Zeng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+residues+of+granular+support+bath+materials+on+printed+structures+in+embedded+extrusion+printing.">Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing.</a> Biofabrication. 15 (3), 035013 (2023).</li><li>Terpstra, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+fluid+gels+formed+by+shear+processing+during+gelation+for+suspended+3d+bioprinting.">Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting.</a> J Vis Exp. (195), e64458 (2023).</li><li>Roche, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=durability,+contractility+and+vascular+network+formation+in+3d+bioprinted+cardiac+endothelial+cells+using+alginate-gelatin+hydrogels.">durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels.</a> Front Bioeng Biotech. 9, 63657 (2021).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bioprinting+of+tough+hydrogel-based+vascular+conduits+for+functional+blood+vessels.">Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels.</a> Sci Adv. 8 (43), (2022).</li><li>Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-shear+bioprinting+of+highly+oriented+porous+hydrogel+microfibers+to+construct+anisotropic+tissues.">Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues.</a> Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).</li></ol>

著者らは、この原稿に記載されている製品に金銭的な利害関係はありません。

バイオプリンティングで使用する κ-カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴の調製は、得られた培地がバイオインクを支えるための望ましい特性を示すことを保証するためのいくつかの重要なステップを含む、慎重に調整されたプロセスです。最初に、 κ-カラギーナン溶液は、 κ-カラギーナン粉末を高温で脱イオン水に溶解するこ?...

電気紡糸繊維、多孔質スポンジ、高分子ハイドロゲルなどの組織工学足場は、細胞増殖、組織再生、臓器機能の回復を支える構造的枠組みを提供することにより、損傷した組織や臓器の修復と再建において極めて重要な役割を果たします1,2,3.しかし、従来のスキャフォールドでは、天然の組織構造を正確に再現するという課題に直面し、人工組織と天然組織との間にミスマッチが生じます。この制限は、欠陥のある組織の効率的な治癒を妨げ、より正確なバイオミミクリーを達成するための足場設計の進歩が緊急に必要であることを強調しています。3次元(3D)バイオプリンティングは、生体材料のインクと細胞4を使用して、複雑な生体組織構造を層ごとに正確に構築する革新的な製造技術です。さまざまな生体材料の中で、高分子ハイドロゲルは、細胞のin situカプセル化を促進し、細胞の成長を決定的にサポートする独特のネットワークを備えた理想的なバイオインクとして浮上しています5,6。それにもかかわらず、多くの柔らかく高水和したハイドロゲルは、バイオインクとして使用すると、印刷プロセス中に印刷された足場構造のぼやけや急速な崩壊を誘発する傾向があります。この課題に対処するために、組み込み型3Dバイオプリンティング技術は、マイクロゲル浴を支持材料として採用し、正確なソフトバイオインクの堆積を可能にしました。ハイドロゲルバイオインクをゲル化すると、マイクロゲル浴を取り外すことにより、複雑な構造を持つ精製されたバイオニックスキャフォールドが得られます。ゼラチン7,8、アガロース9、ジェランガム10,11などの材料は、埋め込み型3Dバイオプリンティング用のマイクロゲルバスの作成に使用されており、組織工学におけるソフトハイドロゲルの応用を大幅に進めています。しかし、これらの粒子状ゲルのミクロンレベルで不均一な粒子サイズは、3Dプリンティング12,13,14の解像度と忠実度に悪影響を及ぼします。小さく均一に分散した粒子を持つゲル状の懸濁液フロートを作製することが急務であり、高忠実度のバイオプリンティングを実現する上での利点があります。
このプロトコルでは、均一なサブミクロンレベルの新しい犠牲顆粒 κ-カラギーナン懸濁槽が埋め込まれた3Dプリンティングのために提示されます。この革新的なサブマイクロゲル浴の急速なジャミング-アンジャミング遷移の挙動は、高い構造忠実度15の生体模倣ヒドロゲル足場の正確な製造を容易にする。この新しい懸濁液媒体を利用して、ゼラチンメタクリレートとシルクファイバーメタクリレートで構成される複合バイオインクを使用して、多層組織構造を特徴とする一連の生体模倣組織および臓器構築物が成功裏に印刷されます。この研究では、食道が多層組織構造を持っているだけでなく、その筋肉層も内部の円形および外部の縦方向の複雑な層構造を示すことを主な理由として、食道を3Dバイオプリンティングバイオミメティックオブジェクトとして選択しました。これらの層の適切な配置と組織化を確保することは、機能的な組織の再生に不可欠です。したがって、食道の多層構造を再現することを強く望んでいます。さらに重要なことに、 κ-カラギーナンサブマイクロゲルを懸濁液浴として、GelMA/SFMAをバイオインクとして利用し、組織工学のための生体模倣足場を設計および構築しました。印刷された食道は、リン酸緩衝生理食塩水洗浄を繰り返すことで簡単に放出できます。さらに、 κ-カラギーナンサブマイクロゲル浴は細胞毒性物質を含まないため、高い細胞適合性が保証されます15。異方性足場内にロードされた平滑筋細胞は、顕著な拡散活動を示します。この均一なサブマイクロゲル懸濁液は、埋め込まれた3Dバイオプリンティングを通じて複雑な組織や臓器を作製するための新しい道を提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D bioprinter</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>C0065</td>
			<td>Ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm UV light</td>
			<td>EFL</td>
			<td>XY-WJ01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cyto smart 6749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>STELLARIS 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C3113-0500</td>
			<td>High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic rotational rheometer</td>
			<td>TA Instrument</td>
			<td>Discovery HR-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esophageal smooth muscle cells</td>
			<td>Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University</td>
			<td></td>
			<td>Primary cells from the rabbit esophagus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>UE</td>
			<td>F9070L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>CA1610</td>
			<td>300T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin methacrylate</td>
			<td>EFL</td>
			<td>EFL-GM-60</td>
			<td>60% substitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>k-carrageenan</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>C121013-100g</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>L157759-1g</td>
			<td>365~405 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Dead kit</td>
			<td>beyotime</td>
			<td>C2015M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Potenov</td>
			<td>PT-3502B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1110&#160;</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>MA0110</td>
			<td>100 &#180;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C3580-0500</td>
			<td>pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk fibroin methacrylate</td>
			<td>EFL</td>
			<td>EFL-SilMA-001</td>
			<td>39% substitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C100C1</td>
			<td>0.25%, without phenol red</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embedded bioprinting of tissue-like structures using &#954;-carrageenan sub-microgel medium

粒状ヒドロゲル支持浴を利用した埋め込み型三次元(3D)バイオプリンティングは、生体模倣スキャフォールドを作成するための重要な技術として浮上しています。しかし、正確なバイオインクの沈着と細胞の生存率および機能のバランスをとる適切なゲル懸濁液培地を設計するには、特に望ましい粘弾性特性を達成する上で複数の課題があります。ここでは、新しい κ-カラギーナンゲル支持浴が、操作が容易な機械的粉砕プロセスを通じて製造され、均質なサブマイクロスケールの粒子を生成します。これらのサブマイクロゲルは、小さな降伏応力と急速なせん断減粘特性を備えた典型的なビンガム流動挙動を示し、バイオインクのスムーズな堆積を促進します。さらに、 κ-カラギーナンマイクロゲルネットワークの可逆的なゲルゾル転移と自己修復能力により、プリントされたコンストラクトの構造的完全性が確保され、明確な建築的特徴を持つ複雑な多層組織構造の作成が可能になります。プリント後、 κ-カラギーナンサブマイクロゲルは、単純なリン酸緩衝生理食塩水洗浄で簡単に除去できます。さらに、細胞を多く含むバイオインクを用いたバイオプリンティングにより、バイオミメティックコンストラクト内の細胞は92%という高い生存率を持ち、偽足を急速に伸ばし、堅固な増殖を維持することが実証されており、このバイオプリンティング戦略が組織や臓器の作製に応用できる可能性が示されています。要約すると、この新しい κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地は、優れた品質の埋め込みバイオプリンティングの有望な手段として浮上しており、人工組織や臓器の in vitro 開発に深い意味を持っています。

Tissue engineering scaffolds, including electro-spun fibers, porous sponges, and polymer hydrogels, play a pivotal role in the repair and reconstruction of damaged tissues and organs by providing a structural framework supporting cell growth, tissue regeneration, and the restoration of organ function1,2,3. However, traditional scaffolds encounter challenges in accurately replicating native tissue structures, leading to a mismatch between the engineered and natural tissues. This limitation hinders the efficient healing of defective tissues, emphasizing the urgent need for scaffold design advancements to achieve more accurate biomimicry. Three-dimensional (3D) bioprinting is an innovative manufacturing technique that precisely constructs complex biological tissue structures layer by layer using biomaterial inks and cells4. Among various biomaterials, polymer hydrogels emerge as ideal bioinks with their distinctive network that facilitates in situ encapsulation of cells and crucially supports their growth5,6. Nevertheless, many soft and highly hydrated hydrogels tend to induce blurring or rapid collapse of printed scaffold structures during the printing process when used as bioinks. To address this challenge, embedded 3D bioprinting technology employs a microgel bath as a support material, allowing precise soft bioink deposition. Upon gelation of the hydrogel bioinks, refined bionic scaffolds with intricate structures are obtained by removing the microgel bath. Materials like gelatin7,8, agarose9, and gellan gum10,11 have been employed to create microgel baths for embedded 3D bioprinting, significantly advancing the application of soft hydrogels in tissue engineering. However, the micron-level and non-uniform particle size of these particulate gels detrimentally impacts the resolution and fidelity of 3D printing12,13,14. There is an urgent need to fabricate a gel-like suspension float with small and uniformly dispersed particles, offering advantages in achieving high-fidelity bioprinting.
In this protocol, a novel sacrificial granulate &#954;-carrageenan suspension bath with a uniform sub-micron level is presented for embedded 3D printing. This innovative sub-microgel bath behavior of rapid jamming-unjamming transition facilitates the precise fabrication of biomimetic hydrogel scaffolds with high structural fidelity15. Utilizing this new suspension medium, a series of biomimetic tissue and organ constructs featuring multi-layer tissue structures are successfully printed, employing a composite bioink composed of gelatin methacrylate and silk fibro methacrylate. In this study, we chose the esophagus as the 3D bioprinting biomimetic object mainly because the esophagus not only has a multi-layered tissue structure but also its muscle layer exhibits an internal circular and external longitudinal complex layering structure. Ensuring proper alignment and organization of these layers is essential for functional tissue regeneration. Therefore, we highly desire to replicate the multilayered architecture of the esophagus. More importantly, we utilized &#954;-carrageenan sub-microgels as the suspension bath and GelMA/SFMA as the bioink to design and construct a biomimetic scaffold for tissue engineering. The printed esophagus can be easily released by repeated phosphate-buffered saline washing. Moreover, the &#954;-carrageenan sub-microgel bath is free of cytotoxic substances, ensuring high cytocompatibility15. The smooth muscle cells loaded within anisotropic scaffolds exhibit a notable spreading activity. This uniform sub-microgel suspension medium offers a new avenue for the fabrication of complex tissues and organs through embedded 3D bioprinting.

著者スポットライト:高解像度3Dバイオプリンティングのための均質な κ-カラギーナンサブマイクロゲルバスの開発

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

3D bioprinting in a microgel-based suspension bath has provided a versatile platform for fabricating complex 3D structures using soft hydrogels, but it is still limited by the low print resolution and accuracy, hindering the practical applications of the printed products in tissue engineering. The present microgel baths often exhibit large sizes and poor dispersions, resulting in a big diameter and irregular morphology of the printed filaments. Therefore, it poses a significant challenge in preparing a microgel bath with a small particle size and uniform morphology.This protocol offers the fabrication of a homogenous and biocompatible cationic cross-linked kappa-carrageenan sub-microgel bath for high-fidelity bioprinting, through an easy-to-operate mechanical grinding strategy, Since kappa-carrageenan sub-microgels exhibit a uniform methodology with a small particle size of 565 nanometer, and a low state of 0.35%enabling precise tissue and organ construction with remarkable fidelity and high resolution.

粒状κ-カラギーナンゲル浴は、バルクハイドロゲルを機械的に分解して粒子状ゲルスラリーにすることによって生成されました。最新の研究では、κ-カラギーナン粒子は、機械的混合15の1000rpmで均一な形態を有する約642±65nmの平均直径を示し、これは以前に文献で報告されたマイクロゲルの寸法よりも有意に小さいことを実証した16,17,18</s...

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この研究では、新しい κ-カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴を導入し、顕著な可逆的なジャミング-アンジャミング遷移特性を示します。これらの特性は、埋め込まれた3Dバイオプリンティングにおける生体模倣組織や臓器の構築に貢献しています。心臓/食道様組織の高解像度と細胞増殖によるプリンティングの成功は、高品質のバイオプリンティングおよび組織工学の応用を示しています。

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic ...

embedded-bioprinting-tissue-like-structures-using-carrageenan-sub

Research

JoVE Journal

Engineering

Embedded Bioprinting of Tissue-like Structures Using &#954;-Carrageenan Sub-Microgel Medium

589 ビュー.  Ningbo University. マイクロゲルベースの懸濁液槽での3Dバイオプリンティングは、ソフトハイドロゲルを使用して複雑な3D構造を作製するための汎用性の高いプラットフォームを提供してきましたが、プリント解像度と精度が低いため、プリント製品の組織工学への実用化が妨げられています。本マイクロゲル浴は、しばしば大きなサイズおよび貧弱な分散性を示...

ビデオ: 著者スポットライト:高解像度3Dバイオプリンティングのための均質な κ-カラギーナンサブマイクロゲルバスの開発

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic scaffolds. However, engineering a suitable gel suspension medium that balances precise bioink deposition with cell viability and function presents multiple challenges, particularly in achieving the desired viscoelastic properties. Here, a novel &#954;-carrageenan gel supporting bath is fabricated through an easy-to-operate mechanical grinding process, producing homogeneous sub-microscale particles. These sub-microgels exhibit typical Bingham flow behavior with small yield stress and rapid shear-thinning properties, which facilitate the smooth deposition of bioinks. Moreover, the reversible gel-sol transition and self-healing capabilities of the &#954;-carrageenan microgel network ensure the structural integrity of printed constructs, enabling the creation of complex, multi-layered tissue structures with defined architectural features. Post-printing, the &#954;-carrageenan sub-microgels can be easily removed by a simple phosphate-buffered saline wash. Further bioprinting with cell-laden bioinks demonstrates that cells within the biomimetic constructs have a high viability of 92% and quickly extend pseudopodia, as well as maintain robust proliferation, indicating the potential of this bioprinting strategy for tissue and organ fabrication. In summary, this novel &#954;-carrageenan sub-microgel medium emerges as a promising avenue for embedded bioprinting of exceptional quality, bearing profound implications for the in vitro development of engineered tissues and organs.

This study introduces a novel &#954;-carrageenan sub-microgel suspension bath, displaying remarkable reversible jamming-unjamming transition properties. These attributes contribute to the construction of biomimetic tissues and organs in embedded 3D bioprinting. The successful printing of heart/esophageal-like tissues with high resolution and cell growth demonstrates high-quality bioprinting and tissue engineering applications.

工学

Preparation of the &#954;-Carrageenan Sub-Microgel Suspension Bath for Embedded 3D Printing

Begin by adding 1.75 grams of Kappa Carrageenan powder to 500 milliliters of PBS in a 1000 milliliter glass bottle to prepare a Kappa Carrageenan suspension bath. Then introduce a 70 millimeter magnetic stir bar into the glass bottle. Tighten the glass bottle cap and then loosen it by half a turn.Heat the glass bottle in a 70 degree Celsius water bath. Then turn on the magnetic stir at 300 RPM. Place the bottle and stir until the polymer is completely dissolved.Using a 0.22 micrometer filter, filter the completely dissolved Kappa Carrageenan solution into the sterilized glass bottle. Store the Kappa Carrageenan solution at four degrees Celsius to induce a cation cross-linked gelation for 12 hours. Then using a 60 millimeter magnetic stir, mechanically grind the Kappa Carrageenan hydrogels until they successfully transform into a liquid state.

埋め込み型3Dプリンティング用κ-Carrageenan Sub-Microgel懸濁液浴の作製

Printing Biomimetic Hydrogel Scaffolds Using a Custom-Designed Micro-Extrusion Bioprinter

To begin, switch on the micro-extrusion pump controller. Select the corresponding volume syringe and set the extrusion rate at 0.08 milliliters per minute. Then divide the hydrogel volume by the extrusion rate and coordinate it with the desired printing time to calculate the duration of extrusion.Next, fit the syringe with a needle featuring an inner diameter of 210 micrometers into the syringe slot of the bioprinter. Adjust the syringe controller to ensure that the plunger of the syringe is in close contact with the screw. Then place three milliliters of the prepared kappa-carrageenan suspension bath into a 35 millimeter cell culture dish.Based on the code settings, position the dish on the platform and confirm that the printing head is one millimeter above the bottom of the dish. After that, insert the SD card containing the code into the 3D bioprinter. Activate the code file, start the bioprinter, and click the Start button on the controller.Then expose the printed construct to 405 nanometers of blue light for one minute to initiate photo-crosslinking. Using a one milliliter pipette, remove the kappa-carrageenan gel, followed by the addition of three milliliters of PBS for washing and subsequent removal.

カスタム設計のマイクロエクストルージョンバイオプリンターを使用した生体模倣ハイドロゲルスキャフォールドのプリンティング

Embedded 3D Bioprinting of Esophageal Muscle-Layer Analogs for Tissue Engineering

To begin, take the cultured esophageal smooth muscle cells once they attain 80%co fluency. Aspirate the medium and wash the endothelial smooth muscle cells with five milliliters of PBS. Then add two milliliters of 0.2%Trypsin-EDTA to the flask and incubate for two minutes to digest the cells.Add two milliliters of DMEM to terminate the digestion process and transfer the cell suspension to a 15 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube at 675G for three minutes. Carefully aspirate the supernatant, and resuspend the cell pellet in the composite gelatin methacrylate and silk fibroin methacryloyl bioinks.After bioprinting and washing the 3D esophageal muscle layer with PBS, carefully aspirate the PBS and replace it with three milliliters of DMEM, supplemented with 10%FBS, and 1%penicillin or streptomycin.