管状構造の作製は血管ネットワークの組織工学への有望なアプローチであり、これはインビトロでの厚い組織の培養における主要な課題の1つです。コア/シェル技術の主な利点は、単一ステップでの中空フィラメントスキャフォールドの簡単な製造であり、製造時間を短縮し、細胞で直接印刷できる可能性があります。適切な粘弾性特性を持つヒドロゲル製剤を調製し、安定した足場の3D印刷にはコア/シェル材料の継続的なバランスのとれた流れを維持することが重要です。
まず、滅菌5 mLシリンジに作りたてのヒドロゲルを充填します。27ゲージの鈍い端の針が装備されている2番目の5 mLのシリンジに、作りたての架橋液を充填する。コア/シェルノズルを組み立てます。
G27の鈍い端の針を中心コンポーネントとして挿入し、ねじを使用して針を固定します。内側の針は、外側のコアシェルノズルから約1mm突出する必要があります。クロスリンク溶液と注射器をノズルのG27針に接続し、エタノール殺菌3Dプリンタの押出機の1つに注射器を積み込みます。
ハイドロゲルを使用してシリンジを第2押出機に取り付け、ノズルに接続します。Luerロックを使用して、短いチューブをコア/シェルノズルのサイドLuer入力に接続します。ノズルが表面に触れるまで、ノズルの位置合わせを慎重に調整してから、ノズルを外側のノズル直径と等しい距離に引き込みます。
生成されたスキャフォールド G コードをインポートし、Play を押して印刷プロセスを開始します。印刷後、印刷された足場で基板を慎重に取り外し、足場全体に二次架橋溶液を注ぎます。スキャフォールドを室温で1分間インキュベートします。
足場を基材から外すには、足場を横に優しく引っ張る。足場が基板に強く付着する場合は、両方の材料の間に鋭いエッジを挿入して分離します。足場を新しい容器に移します。
UVは、側面あたり30分間、足場の両側を殺菌します。その後、スキャフォールドを無色の細胞培養培地に入れ、スキャフォールドを摂氏37度で5%の二酸化炭素を少なくとも24時間インキュベートします。翌日、摂氏37度で5分間0.25%トリプシンの体外培養物からハベックスを収穫する。
細胞が剥離したら、3mLの新鮮な細胞培養培地で酵素反応を停止し、遠心分離により細胞を採取する。ペレットをフェノールレッドを含む新鮮な培地に再懸濁し、ミリリットル濃度あたり5番目の内皮細胞の3.4倍から5番目の内皮細胞に希釈した。27ゲージ針を装備した無菌5 mLシリンジに細胞をロードし、足場のエントリポイントを見つけます。
針を足場フィラメントの直線部分に合わせ、足場を低角度で慎重に穿刺する。針がチャネルの中空フィラメント内であることを確認し、軽くプランジャーを押し下げて、約1〜2mLの細胞懸濁液を足場に注入します。サスペンションの流れは半透明の足場を通して見えるべきである。
足場全体を細胞懸濁液で満たしたら、スキャフォールドを新鮮な細胞培養培地に沈め、最大10日間、スキャフォールドを細胞培養インキュベーターに戻す。インキュベーションの終わりに生き生き/死んだ画像化のために、PBSで足場をすすいで、慎重に足場に生きている/死んだ溶液を注入するために鈍い端の針を使用する。溶液が足場全体を満たしていることを確認し、足場を37°Cで30分間置きます。
インキュベーションの最後に、スキャフォールドをPBSですすいで、慎重に足場をガラススライドに移します。染色した細胞は、その後、蛍光顕微鏡下で足場で観察することができる。印刷され、後処理された足場のこの断面では、フィラメント内ではっきりと見える中空のチャネルが観察される。
示されているように、37°Cの細胞培養培地中で72時間の培養後も、フィラメントは足場全体の長さ全体にわたって中空構造を保持する。ここでは、足場内で48時間培養した後の内皮細胞の代表的な生きた/死んだアッセイが示されている。生細胞は、その明るい緑色蛍光シグナルによって同定することができる。
この技術は、中空の管状足場のワンステップ製作の基礎であり、バイオインクに組み込まれた細胞を使用して直接印刷することによってアップグレードすることができる。
