Questa ricerca è stata supportata dalla Ningbo Natural Science Foundation (2022J121, 2023J159), dal progetto chiave della Natural Science Foundation della città di Ningbo (2021J256), dalla Open Foundation dello State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers (Fudan University) (K2024-35) e dal Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases della provincia di Zhejiang, Cina (2022E10026). Grazie per il supporto tecnico da parte delle strutture principali, Centro di scienze della salute dell'Università di Ningbo.

1. Preparazione del bagno di sospensione sub-microgel κ -carragenina
<ol><li>Preparare 500 mL di bagno di sospensione di κ-carragenina (0,35% in peso/vol) aggiungendo 1,75 g di polvere di κ-carragenina in 500 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) in un flacone di vetro da 1.000 mL.</li>
	<li>Introdurre una barra di agitazione magnetica da 70 mm nella bottiglia di vetro per mescolare la miscela acquosa. Stringere il tappo della bottiglia di vetro e poi allentarlo di mezzo giro.</li>
	<li>Mettere la bottiglia di vetro a bagnomaria a 70 °C e scaldarla. Accendere l'agitatore magnetico a una velocità di 300 giri/min, posizionare la bottiglia e mescolare fino a quando il polimero non è completamente sciolto.</li>
	<li>Prendere un'altra bottiglia di vetro e metterla in autoclave per la sterilizzazione, funzionando a 121 °C per 30 minuti.</li>
	<li>Dopo che lo sterilizzatore ad alta pressione si è raffreddato a 80 °C, rimuovere la bottiglia dallo sterilizzatore e trasferirla sul banco di lavoro ultra-pulito per un'ulteriore manipolazione.</li>
	<li>Filtrare la soluzione di κ-carragenina completamente disciolta nel flacone di vetro sterilizzato utilizzando un filtro da 0,22 μm. NOTA: Eseguire rapidamente la filtrazione mentre la soluzione è calda per evitare che la κ-carragenina si raffreddi e ostruisca il filtro.</li>
	<li>Conservare la soluzione di κ-carragenina a 4 °C per indurre una gelificazione reticolata cationica per 12 ore.</li>
	<li>Macinare meccanicamente gli idrogel di κ-carragenina utilizzando un agitatore magnetico da 60 mm con una velocità di agitazione di 1200 giri/min a 25 °C fino a quando non si trasforma con successo in uno stato liquido, impiegando circa 60 minuti. NOTA: Conservare gli idrogel di κ-carragenina a una temperatura compresa tra 25 e 37 °C per evitare la gelificazione a basse temperature o la dissoluzione ad alte temperature.</li>
</ol>2. Preparazione di bioink compositi di gelatina metacrilato/fibroina di seta
<ol><li>Preparare bioink compositi combinando il 10% (wt/vol) di metacrilato di gelatina (GelMA) e il 6% (wt/vol) di metacrilato di fibroina di seta (SFMA) in soluzione PBS (pH 7,4). Pesare separatamente 2,0 g di GelMA e 1,2 g di SFMA in polvere.</li>
	<li>Aggiungere lentamente le polveri in due provette da centrifuga da 50 mL. Aggiungere 10 mL di soluzione PBS separatamente nelle provette da centrifuga da 50 mL.</li>
	<li>Aggiungere un agitatore magnetico da 10 mm a ciascuno e mescolare e scaldare costantemente a bagnomaria a 45 °C. Lasciare sciogliere completamente le polveri GelMA e SFMA, impiegando circa 30 minuti.</li>
	<li>Miscelare le soluzioni GelMA e SFMA in un volume uguale agitando continuamente a 45 °C. Filtrare i bioink compositi utilizzando un filtro con dimensioni dei pori di 100 μm.</li>
	<li>Sterilizzare i bioink compositi GelMA/SFMA mediante irradiazione UV in una cabina di biosicurezza per 12 ore. NOTA: Preparare e utilizzare immediatamente i bioink per prevenire la gelificazione prematura dell'SFMA attraverso l'autoassemblaggio.</li>
</ol>3. Caratterizzazione reologica del bagno di sospensione sub-microgel κ-carragenina
<ol><li>Avviare e preparare le apparecchiature relative alla reologia.<ol><li>Accendere il compressore d'aria per 30 minuti e assicurarsi che la pressione raggiunga i 30 psi. Rimuovere il cuscinetto clamp ruotando l'asta di trazione in senso antiorario. Fissare il coperchio nero sottostante e ruotare l'asse della manopola sulla parte superiore dello strumento in senso orario.</li>
		<li>Accendere il reometro e lasciarlo inizializzare. Accendere l'interruttore dell'acqua di circolazione e lasciare che la temperatura raggiunga i 15 °C.</li>
		<li>Aprire il software di controllo del reometro per stabilire la connessione online.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibrare il reometro e installare la geometria della piastra parallela.<ol><li>Eseguire la calibrazione dello strumento nel software di controllo, che comporta principalmente la regolazione del percorso di inerzia dello strumento di calibrazione. Montare una piastra parallela di 40 mm di diametro all'estremità dell'asta di trazione. Tenere premuto il pulsante di blocco per 3 s per spostare l'albero motore nella posizione iniziale per un posizionamento coerente della geometria.</li>
		<li>Selezionare il Calibrate Manager nel software di controllo e successivamente fare clic su Inerzia, Calibrazione attrito e Mappatura rotazionale per calibrare la geometria della piastra parallela.</li>
	</ol></li>
	<li>Azzerare l'altezza della fessura del reometro eseguendo una procedura standard di azzeramento della fessura per garantire una misurazione precisa.</li>
	<li>Impostare le fasi sperimentali, tra cui una rampa di flusso che va da 0,01 a 1000 1/s di velocità di taglio, una spazzata di ampiezza che va da 0,1% a 100% di deformazione a 10 rad/s, una scansione del tempo di oscillazione a più fasi della durata di 60 s con deformazioni alternate dell'1% e del 100% a 10 rad/s e una scansione Peak Hold a più fasi della durata di 120 s con velocità di taglio alternata di 0,1 1/s e 10 1/s.</li>
	<li>Far cadere 2 mL di sospensioni di κ-carragenina allo 0,35% sulla piastra di Peltier del reometro. </li>
	<li>Posizionare la distanza geometrica a 510 μm e rimuovere l'eventuale trabocco in eccesso sul bordo del dispositivo di bloccaggio. Impostare la distanza tra i campioni a 500 μm per consentire al campione di estendersi leggermente oltre il bordo del morsetto.</li>
	<li>Condurre un esperimento di flusso selezionando la rampa di flusso dalle opzioni di progettazione sperimentale.<ol><li>Scegliere il test Flow Ramp nel disegno sperimentale. Impostare le velocità di taglio da 0,001 a 10 1/s a una temperatura di 25 °C.</li>
		<li>Eseguire il passaggio 3.5 e l'esperimento Flow Ramp sul campione aggiunto.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire un test ciclico di Peak Hold per valutare le prestazioni di recupero del materiale.<ol><li>Scegli Peak Hold sweep nel disegno sperimentale e imposta 5 esperimenti consecutivi con un tempo di 120 s a 25 °C.</li>
		<li>Impostare la velocità di taglio su 0,01 1/s per il primo, terzo e quinto passaggio e su 10 1/s per il secondo e il quarto passaggio.</li>
		<li>Aggiungere un nuovo campione di 2 mL. Eseguire il passaggio 3.5 e il test di recupero ciclico.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire l'analisi della viscoelasticità per valutare la potenziale transizione gel-sol del bagno di sospensione di κ-carragenina.<ol><li>Scegliere il test Amplitude Sweep nella progettazione sperimentale. Impostare la deformazione di oscillazione da 0,1% a 100% a una temperatura di 25 °C. Fare clic su Avvia per eseguire l'esperimento di scansione dell'ampiezza sul campione aggiunto.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire analisi di deformazione alternative per valutare le prestazioni di recupero elastico del materiale.<ol><li>Scegli Oscillation Time Sweep nel disegno sperimentale e imposta 5 esperimenti consecutivi con un tempo di 60 s a 25 °C.</li>
		<li>Impostare la tensione su 1% per il primo, terzo e quinto passaggio e su 100% per il secondo e il quarto passaggio.</li>
		<li>Aggiungere un nuovo campione di 2 mL. Eseguire il passaggio 3.5 e il test di recupero ciclico continuo. NOTA: Pulire la piastra geometrica e la piastra Peltier dopo ogni test dell'esperimento e aggiungere un nuovo campione di 2 ml.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Stampa di scaffold biomimetici in idrogel utilizzando una biostampante per microestrusione progettata su misura
<ol><li>Progetta cubi in formato STL utilizzando un software di grafica 3D e scarica modelli simili a tessuti dal database 3D (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.).<ol><li>Importare i modelli in formato STL nel software PANGO e inserire i parametri di stampa. Imposta le coordinate X, Y e Z specifiche del modello nello spazio 3D, inserisci le dimensioni di scala previste del modello in millimetri (mm), regola le dimensioni e il rapporto di scala dell'oggetto sugli assi X, Y e Z e regola l'angolo di rotazione del modello nello spazio secondo necessità.</li>
		<li>Inserire il diametro stimato del filamento (in genere circa 200-500 μm per la maggior parte dei bioink) nel campo dello spessore dello strato per determinare lo spessore dell'asse Z di ogni strato. Impostare la velocità di stampa in base allo spessore della linea previsto (circa 10-90 mm/s) e impostare la densità di riempimento al 30%-80%.</li>
		<li>Esporta i parametri finali come G-code su una scheda SD.</li>
	</ol></li>
	<li>Far funzionare la biostampante e la pompa di microestrusione.<ol><li>Accendere il controller della pompa di microestrusione, selezionare la siringa del volume corrispondente (5 mL) e impostare la velocità di estrusione a 0,08 mL/min e la durata dell'estrusione in coordinamento con il tempo di stampa desiderato ottenuto dividendo il volume dell'idrogel per la velocità di estrusione.</li>
		<li>Inserire la siringa con un ago con un diametro interno di 210 μm nella fessura della siringa della biostampante.</li>
		<li>Regolare il controller della siringa per assicurarsi che lo stantuffo della siringa sia a stretto contatto con la vite.</li>
		<li>Introdurre 3 mL di bagno di sospensione in una piastra per colture cellulari da 35 mm. Posizionare la parabola sulla piattaforma in base alle impostazioni del codice e verificare che la testina di stampa si trovi 1 mm sopra il fondo della parabola. NOTA: Eseguire un test preliminare per garantire l'accuratezza delle posizioni delle parabole sulla piattaforma di stampa durante la stampa.</li>
		<li>Inserisci la scheda SD contenente il codice nella bioprinter 3D, attiva il file di codice, avvia la bioprinter e fai clic sul pulsante Start sul controller.</li>
	</ol></li>
	<li>Elaborazione dei costrutti<ol><li>Esporre il costrutto stampato a una luce blu a 405 nm per 1 minuto per avviare la fotoreticolazione.</li>
		<li>Rimuovere il gel di κ-carragenina utilizzando una pipetta da 1 mL, seguito dall'aggiunta di 3 mL di PBS (pH 7,4) per il lavaggio e la successiva rimozione. Ripetere questo processo per un lavaggio accurato. NOTA: Eseguire il processo di lavaggio delicatamente per evitare di danneggiare i costrutti stampati.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Bioprinting 3D incorporato di analoghi dello strato muscolare esofageo
<ol><li>Coltura di cellule muscolari lisce esofagee di coniglio (eSMC).<ol><li>Iniziare la coltura in fiasche T75 con 2 x 106 cellule utilizzando 15 mL di terreno DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina.</li>
		<li>Mantenere le eSMC a 37 °C in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 e il 95% di aria fino a raggiungere l'80% di confluenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dello strato muscolare esofageo bioink<ol><li>Aspirare il terreno al raggiungimento della confluenza e lavare le eSMC con 5 ml di 1x PBS.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,2% al pallone e incubare per 2 minuti per digerire le cellule. Tocca il pallone per staccare le celle dal muro.</li>
		<li>Terminare la digestione aggiungendo 2 mL di DMEM e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL. Misurare la densità cellulare utilizzando un contatore di cellule con 10 μL di sospensione cellulare.</li>
		<li>Centrifugare a 675 x g per 3 minuti, aspirare con cura il surnatante e risospendere il pellet cellulare nei bioink compositi GelMA/SFMA (come preparato al punto 2.1). Regolare la concentrazione finale delle cellule per ottenere una densità di 10 x 106 cellule/mL nel bioink, ottimizzando così le condizioni per le successive applicazioni di bioprinting 3D.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della biostampante 3D e dei materiali associati<ol><li>Autoclavare gli strumenti di stampa essenziali, tra cui aghi per siringa, pinze, un agitatore magnetico e un flacone di vetro silicato da 1000 ml, in condizioni di sterilizzazione standard (121 °C per 30 minuti) per garantire un ambiente asettico per il processo di stampa.</li>
		<li>Posizionare la biostampante all'interno di una cabina di biosicurezza e sterilizzarla con luce ultravioletta (UV) per una durata di 30 minuti per mantenere la sterilità.</li>
		<li>Preparare 50 mL di κ-carragenina sterile e 5 mL di bioink compositi sterili GelMA/SFMA, come descritto rispettivamente nella fase 1 e nella fase 2.</li>
		<li>Progetta il modello, imposta i parametri desiderati e prepara la bioprinter come descritto nel passaggio 4.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Avvio del processo di bioprinting<ol><li>Eseguire le procedure descritte nei passaggi 4.2 e 4.3 per la biostampa dello strato muscolare esofageo 3D, seguite dal lavaggio e dalla sostituzione del PBS.</li>
		<li>Eseguire la stampa cellulare con tecniche sterili durante tutto il processo di stampa per ridurre al minimo il rischio di contaminazione cellulare nella struttura stampata.</li>
	</ol></li>
	<li>Sostituzione post-stampa del terreno di coltura cellulare<ol><li>Aspirare con cura il PBS e sostituirlo con 3 ml di DMEM integrati con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina. Assicurarsi che i costrutti stampati siano completamente immersi per fornire condizioni ottimali di crescita cellulare.</li>
		<li>Incubare la piastra di coltura cellulare contenente i costrutti stampati in un incubatore impostato a 37 °C con il 5% di CO2. Sostituire il terreno di coltura cellulare con terreno fresco ogni giorno, utilizzando 3 ml ogni volta, e monitorare lo stato delle cellule all'interno dei costrutti utilizzando la microscopia ottica.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Valutazione della vitalità delle eSMC all'interno dei costrutti stampati tramite colorazione con saggio vivo/morto
<ol><li>Rimuovere il terreno di coltura cellulare dopo 5 ore di incubazione e lavare i costrutti carichi di cellule con PBS.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL della soluzione standard di calceina-AM/ioduro di propidio (1:1000) ai costrutti carichi di cellule stampate e incubare.</li>
	<li>Lavare i costrutti 3 volte con PBS dopo un'incubazione di 45 minuti e quindi aggiungere un terreno di coltura cellulare fresco.</li>
	<li>Osserva le cellule vive e morte e acquisisci immagini fluorescenti utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (CLSM).</li>
</ol>7. Osservazione delle eSMC all'interno dei costrutti stampati tramite colorazione FITC-Falloidina/DAPI
<ol><li>Colorare i costrutti stampati utilizzando l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) marcato con falloidina (verde) per la F-actina e il 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, blu) per il nucleare dopo 5 giorni di incubazione.</li>
	<li>Preparazione della soluzione di fissazione<ol><li>Combinare 4 mL di 1x PBS con 0,16 mL di paraformaldeide (PFA) in una provetta di polietilene (PE) da 5 mL, raggiungendo una concentrazione finale del 4%.</li>
		<li>Posizionare la capsula di coltura contenente i costrutti biostampati su una superficie pulita. Rimuovere il terreno e coprire delicatamente i costrutti con la soluzione di PFA, assicurandone la completa immersione. Lasciare procedere la fissazione a temperatura ambiente per 20 minuti prima di scartare la soluzione. NOTA: Maneggiare i liquidi con cura durante i processi di aggiunta e rimozione per preservare l'integrità strutturale dei costrutti biostampati.</li>
		<li>Introdurre 2,5 mL di 1x PBS nel piatto di coltura, immergendo completamente i costrutti per rimuovere eventuali reagenti residui di colorazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Permeabilizzazione della membrana cellulare<ol><li>Formulare una soluzione di Triton X-100 allo 0,5% aggiungendo 20 μl di Triton X-100 a 4 mL di 1x PBS in una provetta in PE da 5 mL.</li>
		<li>Somministrare la soluzione di Triton X-100 ai costrutti per 30 minuti a temperatura ambiente per permeare le membrane cellulari, quindi rimuovere la soluzione.</li>
		<li>Introdurre 2,5 mL di 1x PBS nel piatto di coltura, immergendo completamente i costrutti per rimuovere eventuali reagenti residui di colorazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Blocco dell'associazione non specifica<ol><li>Creare una soluzione bloccante l'albumina sierica bovina (BSA) al 3% in una provetta in PE da 5 mL aggiungendo 0,12 mL di BSA a 4 mL di 1x PBS.</li>
		<li>Introdurre la soluzione BSA ai costrutti per 30 minuti a temperatura ambiente per bloccare siti non specifici, quindi scartare la soluzione.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione dell'actina con FITC-falloidina<ol><li>Preparare una soluzione di FITC-falloidina allo 0,2% in una provetta in PE da 5 mL con 4 mL di 1x PBS e 8 μL di reagente colorante.</li>
		<li>Immergere i costrutti in questa soluzione per 60 minuti a temperatura ambiente al buio, quindi scartare la soluzione.</li>
		<li>Aggiungere 2,5 mL di PBS 1x al piatto di coltura, immergendo completamente i costrutti per rimuovere i reagenti residui di colorazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione nucleare con DAPI<ol><li>Applicare 4 mL di soluzione colorante DAPI sui costrutti, garantendo una copertura completa.</li>
		<li>Incubare al buio a temperatura ambiente per 20 minuti prima di rimuovere la soluzione DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavaggio finale e immersione del PBS: aggiungere 2,5 mL di PBS 1x al piatto di coltura, immergendo completamente i costrutti per rimuovere i reagenti di colorazione residui. NOTA: Preparare in anticipo le soluzioni coloranti e maneggiarle delicatamente. In nessun momento le cellule devono essere sottoposte a essiccazione all'interno del recipiente di coltura.</li>
	<li>Osservare utilizzando un microscopio confocale: ispezionare e visualizzare i costrutti colorati utilizzando la microscopia confocale per valutare la crescita cellulare, garantendo una documentazione completa dei risultati.</li>
</ol>8. Valutazione della proliferazione di eSMC all'interno dei costrutti stampati utilizzando il saggio CCK-8
<ol><li>Rimuovere il terreno di coltura dai costrutti nei giorni 7 e 14. Lavare i costrutti con PBS per rimuovere il terreno residuo e le cellule staccate.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione CCK-8 a ciascun costrutto seguendo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che il volume della soluzione CCK-8 sia adeguato a coprire completamente ogni costrutto.</li>
	<li>Incubare i costrutti con la soluzione di CCK-8 a 37 °C per 2 ore. Dopo l'incubazione, trasferire con cura il surnatante in una nuova piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
</ol>

Avanzamento del bioprinting 3D con il sub-microgel di κ-carragenina

<ol>
	<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+engineered+fiber+scaffolds+fabricated+by+electrospinning+for+periodontal+tissue+regeneration.">Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration.</a> J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).</li><li>Amann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+graded,+porous+composite+of+natural+biopolymers+and+octacalcium+phosphate+guides+osteochondral+differentiation+of+stem+cells.">A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells.</a> Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692 (2021).</li><li>Afjoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-gelled+alginate/gelatin+scaffolds+for+wound+healing+applications:+An+in+vitro,+in+vivo+study.">Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study.</a> Mater Sci Eng C. 113, 110957 (2020).</li><li>Hasanzadeh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+tissue-engineered+scaffold+polymers+for+3D+printing+and+its+application+for+4D+printing.">Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing.</a> Chem Eng J. 476, 146616 (2023).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage-like+protein+hydrogels+engineered+via+entanglement.">Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement.</a> Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).</li><li>Bertsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+injectable+hydrogels+for+tissue+regeneration.">Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration.</a> Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500758 (2015).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+bioprinting+of+neurovascular+tissue+modeling+with+collagen-based+low-viscosity+composites.">3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites.</a> Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004 (2023).</li><li>Sreepadmanabh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+growth+medium+prepared+by+flash-solidification+of+agarose+for+3d+cell+culture+and+3d+bioprinting.">Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting.</a> Biomed Mater. 18 (4), 045011 (2023).</li><li>Zeng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+residues+of+granular+support+bath+materials+on+printed+structures+in+embedded+extrusion+printing.">Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing.</a> Biofabrication. 15 (3), 035013 (2023).</li><li>Terpstra, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioink+with+cartilage-derived+extracellular+matrix+microfibers+enables+spatial+control+of+vascular+capillary+formation+in+bioprinted+constructs.">Bioink with cartilage-derived extracellular matrix microfibers enables spatial control of vascular capillary formation in bioprinted constructs.</a> Biofabrication. 14 (3), 034104 (2022).</li><li>Compaan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gellan+fluid+gel+as+a+versatile+support+bath+material+for+fluid+extrusion+bioprinting.">Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting.</a> ACS Appl Mater Inter. 11 (6), 5714-5726 (2019).</li><li>Compaan, A. M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linkable+microgel+composite+matrix+bath+for+embedded+bioprinting+of+perfusable+tissue+constructs+and+sculpting+of+solid+objects.">Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects.</a> ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+3D+printed+biomimetic+scaffolds+based+on+hydrogel+microparticles+for+cell+spheroid+growth.">Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth.</a> Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cation-crosslinked+&#954;-carrageenan+sub-microgel+medium+for+high-quality+embedded+bioprinting.">Cation-crosslinked &#954;-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting.</a> Biofabrication. 16, 025009 (2024).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>Yao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slightly+photo-crosslinked+chitosan/silk+fibroin+hydrogel+adhesives+with+hemostasis+and+anti-inflammation+for+pro-healing+cyclophosphamide-induced+hemorrhagic+cystitis.">Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis.</a> Mater Today Bio. 25, 100947 (2024).</li><li>Senior, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+fluid+gels+formed+by+shear+processing+during+gelation+for+suspended+3d+bioprinting.">Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting.</a> J Vis Exp. (195), e64458 (2023).</li><li>Roche, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=durability,+contractility+and+vascular+network+formation+in+3d+bioprinted+cardiac+endothelial+cells+using+alginate-gelatin+hydrogels.">durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels.</a> Front Bioeng Biotech. 9, 63657 (2021).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bioprinting+of+tough+hydrogel-based+vascular+conduits+for+functional+blood+vessels.">Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels.</a> Sci Adv. 8 (43), (2022).</li><li>Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-shear+bioprinting+of+highly+oriented+porous+hydrogel+microfibers+to+construct+anisotropic+tissues.">Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues.</a> Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).</li></ol>

Gli autori non hanno alcun interesse finanziario nei prodotti descritti in questo manoscritto.

La preparazione di bagni di sospensione sub-microgel di κ-carragenina per l'uso nel bioprinting è un processo attentamente orchestrato che prevede diversi passaggi critici per garantire che il mezzo risultante mostri le proprietà desiderate per supportare i bioink. Inizialmente, viene preparata una soluzione di κ-carragenina sciogliendo la polvere di κ-carragenina in acqua deionizzata a temperature elevate, creando una miscela omogenea. La...

Gli scaffold di ingegneria tissutale, tra cui fibre elettrofilate, spugne porose e idrogel polimerici, svolgono un ruolo fondamentale nella riparazione e ricostruzione di tessuti e organi danneggiati, fornendo una struttura strutturale che supporta la crescita cellulare, la rigenerazione dei tessuti e il ripristino della funzione degli organi 1,2,3. Tuttavia, gli scaffold tradizionali incontrano sfide nel replicare accuratamente le strutture tissutali native, portando a una discrepanza tra i tessuti ingegnerizzati e quelli naturali. Questa limitazione ostacola l'efficiente guarigione dei tessuti difettosi, sottolineando l'urgente necessità di progressi nella progettazione di scaffold per ottenere una biomimetica più accurata. Il bioprinting tridimensionale (3D) è una tecnica di produzione innovativa che costruisce con precisione strutture di tessuti biologici complessi strato per strato utilizzando inchiostri e cellule di biomateriali4. Tra i vari biomateriali, gli idrogel polimerici emergono come bioink ideali con la loro rete distintiva che facilita l'incapsulamento in situ delle cellule e ne supporta in modo crucialela crescita 5,6. Tuttavia, molti idrogel morbidi e altamente idratati tendono a indurre sfocatura o rapido collasso delle strutture di scaffold stampate durante il processo di stampa quando vengono utilizzati come bioink. Per affrontare questa sfida, la tecnologia di bioprinting 3D incorporata impiega un bagno di microgel come materiale di supporto, consentendo una precisa deposizione di bioink morbido. Dopo la gelificazione dei bioink idrogel, rimuovendo il bagno di microgel si ottengono raffinati scaffold bionici con strutture intricate. Materiali come la gelatina 7,8, l'agarosio9 e la gomma di gellano10,11 sono stati impiegati per creare bagni di microgel per la biostampa 3D incorporata, facendo progredire in modo significativo l'applicazione di idrogel morbidi nell'ingegneria tissutale. Tuttavia, la dimensione delle particelle a livello di micron e non uniforme di questi gel di particolato influisce negativamente sulla risoluzione e sulla fedeltà della stampa 3D 12,13,14. C'è un urgente bisogno di fabbricare un galleggiante di sospensione simile al gel con particelle piccole e uniformemente disperse, che offra vantaggi nel raggiungimento di un bioprinting ad alta fedeltà.
In questo protocollo, viene presentato un nuovo bagno di sospensione sacrificale granulato κ-carragenina con un livello uniforme inferiore al micron per la stampa 3D incorporata. Questo innovativo comportamento del bagno sub-microgel di rapida transizione inceppamento-sblocco facilita la fabbricazione precisa di scaffold biomimetici in idrogel con un'elevata fedeltà strutturale15. Utilizzando questo nuovo mezzo di sospensione, una serie di costrutti di tessuti e organi biomimetici caratterizzati da strutture tissutali multistrato vengono stampati con successo, impiegando un bioink composito composto da metacrilato di gelatina e metacrilato di fibro di seta. In questo studio, abbiamo scelto l'esofago come oggetto biomimetico per il bioprinting 3D principalmente perché l'esofago non solo ha una struttura tissutale multistrato, ma anche il suo strato muscolare mostra una struttura di stratificazione complessa circolare interna ed esterna longitudinale. Garantire il corretto allineamento e organizzazione di questi strati è essenziale per la rigenerazione funzionale dei tessuti. Pertanto, desideriamo fortemente replicare l'architettura multistrato dell'esofago. Ancora più importante, abbiamo utilizzato sub-microgel di κ-carragenina come bagno di sospensione e GelMA/SFMA come bioink per progettare e costruire un'impalcatura biomimetica per l'ingegneria tissutale. L'esofago stampato può essere facilmente rilasciato mediante ripetuti lavaggi salini tamponati con fosfato. Inoltre, il bagno sub-microgel di κ-carragenina è privo di sostanze citotossiche, garantendo un'elevata citocompatibilità15. Le cellule muscolari lisce caricate all'interno di scaffold anisotropi mostrano una notevole attività di diffusione. Questo mezzo di sospensione sub-microgel uniforme offre una nuova strada per la fabbricazione di tessuti e organi complessi attraverso la biostampa 3D incorporata.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D bioprinter</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>C0065</td>
			<td>Ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm UV light</td>
			<td>EFL</td>
			<td>XY-WJ01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cyto smart 6749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>STELLARIS 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C3113-0500</td>
			<td>High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic rotational rheometer</td>
			<td>TA Instrument</td>
			<td>Discovery HR-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esophageal smooth muscle cells</td>
			<td>Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University</td>
			<td></td>
			<td>Primary cells from the rabbit esophagus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>UE</td>
			<td>F9070L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>CA1610</td>
			<td>300T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin methacrylate</td>
			<td>EFL</td>
			<td>EFL-GM-60</td>
			<td>60% substitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>k-carrageenan</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>C121013-100g</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>L157759-1g</td>
			<td>365~405 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Dead kit</td>
			<td>beyotime</td>
			<td>C2015M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Potenov</td>
			<td>PT-3502B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1110&#160;</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>MA0110</td>
			<td>100 &#180;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C3580-0500</td>
			<td>pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk fibroin methacrylate</td>
			<td>EFL</td>
			<td>EFL-SilMA-001</td>
			<td>39% substitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C100C1</td>
			<td>0.25%, without phenol red</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embedded bioprinting of tissue-like structures using &#954;-carrageenan sub-microgel medium

La biostampa tridimensionale (3D) incorporata che utilizza un bagno di supporto in idrogel granulare è emersa come una tecnica fondamentale per la creazione di scaffold biomimetici. Tuttavia, l'ingegnerizzazione di un mezzo di sospensione in gel adatto che bilanci la precisa deposizione di bioink con la vitalità e la funzione cellulare presenta molteplici sfide, in particolare per ottenere le proprietà viscoelastiche desiderate. Qui, un nuovo bagno di supporto in gel di κ-carragenina viene fabbricato attraverso un processo di macinazione meccanica facile da usare, producendo particelle omogenee su scala sub-micrometrica. Questi sub-microgel mostrano il tipico comportamento del flusso di Bingham con un piccolo stress di snervamento e proprietà di assottigliamento rapido del taglio, che facilitano la deposizione regolare dei bioink. Inoltre, la transizione reversibile gel-sol e le capacità di autoguarigione della rete di microgel κ-carragenina garantiscono l'integrità strutturale dei costrutti stampati, consentendo la creazione di strutture tissutali complesse e multistrato con caratteristiche architettoniche definite. Dopo la stampa, i sub-microgel di κ-carragenina possono essere facilmente rimossi con un semplice lavaggio salino tamponato con fosfato. Un'ulteriore biostampa con bioink carichi di cellule dimostra che le cellule all'interno dei costrutti biomimetici hanno un'elevata vitalità del 92% e si estendono rapidamente agli pseudopodi, oltre a mantenere una robusta proliferazione, indicando il potenziale di questa strategia di bioprinting per la fabbricazione di tessuti e organi. In sintesi, questo nuovo sub-microgel di κ-carragenina emerge come una strada promettente per la biostampa incorporata di qualità eccezionale, con profonde implicazioni per lo sviluppo in vitro di tessuti e organi ingegnerizzati.

Tissue engineering scaffolds, including electro-spun fibers, porous sponges, and polymer hydrogels, play a pivotal role in the repair and reconstruction of damaged tissues and organs by providing a structural framework supporting cell growth, tissue regeneration, and the restoration of organ function1,2,3. However, traditional scaffolds encounter challenges in accurately replicating native tissue structures, leading to a mismatch between the engineered and natural tissues. This limitation hinders the efficient healing of defective tissues, emphasizing the urgent need for scaffold design advancements to achieve more accurate biomimicry. Three-dimensional (3D) bioprinting is an innovative manufacturing technique that precisely constructs complex biological tissue structures layer by layer using biomaterial inks and cells4. Among various biomaterials, polymer hydrogels emerge as ideal bioinks with their distinctive network that facilitates in situ encapsulation of cells and crucially supports their growth5,6. Nevertheless, many soft and highly hydrated hydrogels tend to induce blurring or rapid collapse of printed scaffold structures during the printing process when used as bioinks. To address this challenge, embedded 3D bioprinting technology employs a microgel bath as a support material, allowing precise soft bioink deposition. Upon gelation of the hydrogel bioinks, refined bionic scaffolds with intricate structures are obtained by removing the microgel bath. Materials like gelatin7,8, agarose9, and gellan gum10,11 have been employed to create microgel baths for embedded 3D bioprinting, significantly advancing the application of soft hydrogels in tissue engineering. However, the micron-level and non-uniform particle size of these particulate gels detrimentally impacts the resolution and fidelity of 3D printing12,13,14. There is an urgent need to fabricate a gel-like suspension float with small and uniformly dispersed particles, offering advantages in achieving high-fidelity bioprinting.
In this protocol, a novel sacrificial granulate &#954;-carrageenan suspension bath with a uniform sub-micron level is presented for embedded 3D printing. This innovative sub-microgel bath behavior of rapid jamming-unjamming transition facilitates the precise fabrication of biomimetic hydrogel scaffolds with high structural fidelity15. Utilizing this new suspension medium, a series of biomimetic tissue and organ constructs featuring multi-layer tissue structures are successfully printed, employing a composite bioink composed of gelatin methacrylate and silk fibro methacrylate. In this study, we chose the esophagus as the 3D bioprinting biomimetic object mainly because the esophagus not only has a multi-layered tissue structure but also its muscle layer exhibits an internal circular and external longitudinal complex layering structure. Ensuring proper alignment and organization of these layers is essential for functional tissue regeneration. Therefore, we highly desire to replicate the multilayered architecture of the esophagus. More importantly, we utilized &#954;-carrageenan sub-microgels as the suspension bath and GelMA/SFMA as the bioink to design and construct a biomimetic scaffold for tissue engineering. The printed esophagus can be easily released by repeated phosphate-buffered saline washing. Moreover, the &#954;-carrageenan sub-microgel bath is free of cytotoxic substances, ensuring high cytocompatibility15. The smooth muscle cells loaded within anisotropic scaffolds exhibit a notable spreading activity. This uniform sub-microgel suspension medium offers a new avenue for the fabrication of complex tissues and organs through embedded 3D bioprinting.

Autore in primo piano: Sviluppo di bagni omogenei di sub-microgel di κ-carragenina per il bioprinting 3D ad alta risoluzione

Bioprinting incorporato di strutture simili a tessuti utilizzando il terreno sub-microgel di κ-carragenina

3D bioprinting in a microgel-based suspension bath has provided a versatile platform for fabricating complex 3D structures using soft hydrogels, but it is still limited by the low print resolution and accuracy, hindering the practical applications of the printed products in tissue engineering. The present microgel baths often exhibit large sizes and poor dispersions, resulting in a big diameter and irregular morphology of the printed filaments. Therefore, it poses a significant challenge in preparing a microgel bath with a small particle size and uniform morphology.This protocol offers the fabrication of a homogenous and biocompatible cationic cross-linked kappa-carrageenan sub-microgel bath for high-fidelity bioprinting, through an easy-to-operate mechanical grinding strategy, Since kappa-carrageenan sub-microgels exhibit a uniform methodology with a small particle size of 565 nanometer, and a low state of 0.35%enabling precise tissue and organ construction with remarkable fidelity and high resolution.

Il bagno granulare di gel di κ-carragenina è stato generato rompendo meccanicamente gli idrogel sfusi in un impasto di gel di particolato. Lo studio più recente ha dimostrato che le particelle di κ-carragenina esibivano un diametro medio di circa 642 ± 65 nm con morfologie uniformi a 1000 rpm di miscelazione meccanica15, significativamente più piccole rispetto alle dimensioni dei microgel precedentemente riportate in letteratura 16,17,18<s...

Read this Scientific Article Protocol about Embedded Bioprinting of Tissue-like Structures Using κ-Carrageenan Sub-microgel Medium at JoVE.com

Questo studio introduce un nuovo bagno di sospensione sub-microgel di κ-carragenina, che mostra notevoli proprietà di transizione reversibile di inceppamento-sbloccaggio. Questi attributi contribuiscono alla costruzione di tessuti e organi biomimetici nel bioprinting 3D incorporato. La stampa di successo di tessuti simili al cuore/all'esofago con alta risoluzione e crescita cellulare dimostra applicazioni di bioprinting e ingegneria tissutale di alta qualità.

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic ...

embedded-bioprinting-tissue-like-structures-using-carrageenan-sub

Research

JoVE Journal

Engineering

Embedded Bioprinting of Tissue-like Structures Using &#954;-Carrageenan Sub-Microgel Medium

557 Views.  Ningbo University. La biostampa 3D in un bagno di sospensione a base di microgel ha fornito una piattaforma versatile per la fabbricazione di strutture 3D complesse utilizzando idrogel morbidi, ma è ancora limitata dalla bassa risoluzione e precisione di stampa, ostacolando le applicazioni pratiche dei prodotti stampati nell'ingegneria tissutale. Gli attuali bagni di microgel presentano spesso grandi dimensioni e scarse dispersioni, con conseguente grande diametro e morfologia...