私たちは、細胞内膜の融合機構の研究に取り組んでいます。このプロトコールでは、小胞体膜融合タンパク質atlastinのGTP加水分解サイクル中のコンフォメーションダイナミクスをsmFRETにより実現することを目指しています。アトラスチンは、GTP加水分解サイクルにおいてモノマーまたはダイマーとして存在する可能性があります。
1分子実験では、適切なタンパク質標識および固定化戦略を見つけることは困難であり、以下ではGTP加水分解サイクル全体にわたるアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスを示します。バルクFRETと比較して、smFRETはさまざまなヌクレオチド負荷状態でタンパク質の立体配座を正確に監視できるため、モジュレーター分子の挙動を直接把握することができます。smFRETを使用して、さまざまなポジション戦略におけるアトラスチンのGTP加水分解サイクルを完全に解決しました。
私たちの発見は、GTP加水分解タンパク質の研究においてよりコンフォメーションダイナミクスを促進し、まれな生物学的プロセスの新しい解釈を提供すると信じています。カバーガラスの表面を清掃するには、ピンセットを使用して8枚のカバーガラスを拾い上げ、染色瓶に入れます。50ミリリットルのアセトンをカバーガラスに覆い、染色ジャーを超音波洗浄機に30分間置きます。
カバーガラスを二重蒸留水で3回すすぎ、超音波洗浄機でメタノールで洗います。次に、染色瓶にピラニア溶液を加え、95°Cの水浴釜で2時間加熱します。ジャーを室温に冷却した後、カバースリップを二重蒸留水で6回すすいでください。
ナトリウムメトキシド溶液を染色ジャーに加え、超音波洗浄機に15分間入れます。カバーガラスを水ですすいだ後、染色ジャーに二重蒸留水を加え、超音波洗浄機に15分間入れます。カバースリップを染色ジャーにクランプし、窒素で乾燥させます。
乾燥させたカバースリップを別の染色瓶に移し、120°Cの乾燥オーブンで30分間焼きます。次に、デシケーターで瓶を室温に冷却します。ビーカーにメタノール47.5ミリリットル、酢酸2.5ミリリットル、トリエトキシシラン0.5ミリリットルを加え、均一に混ぜます。
混合物を染色ジャーに移し、10分間インキュベートします。カバースリップを染色ジャー内の二重蒸留水で3回すすぎ、5分間超音波処理します。図のようにカバーガラスを水ですすぎ、窒素で乾燥させた後、直径10cmのシャーレに入れます。
SVA-mPEGとSVA-mPEG-ビオチンを高塩溶液に1:100の割合で溶解します。準備したミックスをカバースリップに落とし、別のカバースリップで覆います。カバーガラスを適切な湿度で2時間または一晩インキュベートします。
改質後、カバーガラスを分離し、脱イオン水ですすぎ、窒素でブロードライします。修正したカバースリップを50ミリリットルのチューブに慎重に入れます。Rosetta E.coli細胞で発現するダイナミン様タンパク質アトラスチンまたはATLのGTPaseドメインを精製した後、10キロダルトン遠心フィルターを使用して、タンパク質バッファーをタンパク質ビオチン化バッファーに変更します。
タンパク質のビオチン化には、100ミリモルATP、100ミリモルの酢酸マグネシウム、500マイクロモルのD-ビオチン、100マイクロリットルのBirAビオチンリガーゼ10マイクロリットル、および50マイクロモルのタンパク質をそれぞれ100マイクロリットル混合して、最終容量を1ミリリットルにします。混合物を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、分子量10キロダルトンのカットオフ遠心フィルターを使用して遊離D-ビオチンを除去します。
20マイクロリットルのビオチン化タンパク質と20マイクロリットルの15マイクロモルストレプトアビジンを氷上で20分間インキュベートします。SDS-PAGEを使用してタンパク質のビオチン化の効率を検出します。LD555およびLD655フルオロフォアをジメチルスルホキシドに溶解し、最終濃度5ミリモルにします。
標識緩衝液を調製するには、25ミリモルのHEPES、150ミリモルの塩化カリウム、および5ミリモルの塩化マグネシウムを混合します。タンパク質バッファーを標識バッファーに交換するには、10キロダルトンの遠心フィルターを使用します。分子内smFRETアッセイでは、ATL1cyto-TKをLD555およびLD655と1:1.2:1.2の比率で混合し、最終容量を100マイクロリットルにします。
混合物を摂氏4度で5時間インキュベートします。分子間smFRETアッセイでは、ATL1cyto-KをLD555とインキュベートし、ビオチン化ATL1cyto-KをLD655とインキュベートし、摂氏4度で5時間インキュベートします。タンパク質固定化チャンバーを準備するには、改変したカバースリップと顕微鏡スライドをカスタマイズされた両面テープで慎重に貼り付けます。
ホースとチップを取り付けて、6つのチャネルを持つマイクロ流体チャンバーを形成します。マッピング補正には、顕微鏡スライドに10マイクロリットルの10%ポリスチレン粒子を追加し、カバースリップで覆います。次に、全反射蛍光顕微鏡で、ポリスチレン粒子を含む視野を選択し、明視野モードでビデオを撮影します。
カスタムスクリプトを使用して、ドナーチャネルとアクセプターチャネルの両方で同じポリスチレン粒子の中心位置を揃えます。マップファイルをTXTファイルとして保存します。分子間smFRET実験では、LD555標識ATL1cyto-KとLD655標識ATL1cyto-K-ビオチンを1対1の比率で混合し、最終濃度はGTP-γ-Sの1ミリモルです。
混合物を氷上で1時間インキュベートして、タンパク質を二量体化します。ATL1cyto-TおよびATL1cyto-K分子間smFRET実験では、LD555標識ATL1cyto-TとLD655標識ATL1cyto-K-ビオチンを1ミリモルのGTP-γ-Sと1対1の比率で混合します。混合物を氷上で1時間インキュベートして、二量体化タンパク質を得ます。
次に、分子内smFRETアッセイのために、LD555およびLD655標識ATL1cyto-TKを1ミリモルのGDPと氷上で1時間インキュベートします。分子間実験では、ストレプトアビジン1ミリリットルあたり10マイクログラムを10分間インキュベートしてタンパク質を固定化します。分子内アッセイでは、1ミリリットルあたり10 μgのビオチン化抗His抗体を添加し、10分間インキュベートしてタンパク質を固定化します。
インキュベーション後、希釈したATL1二量体をチャネル内のタンパク質に加え、10分間固定化します。チャンネルをインキュベーションバッファーで2回フラッシュします。安息香酸とPCDを最終濃度2.5ミリモルでチャネルに添加します。
励起光源として532ナノメートルレーザーを選択します。30 ミリ秒のフレーム間隔でデータを記録するように EMCCD カメラを設定します。撮影した動画を16ビットTIFF形式で保存します。
データ取得後、録画した動画からFRETトラックを抽出します。FRETトラックをTXT形式で選択して保存します。TXTファイルからデータを抽出し、MATLABの自作スクリプトを使用してFRET値を計算します。
OriginのGaussAmpでsmFRETデータをフィットし、分布ヒストグラムを取得します。
