私たちは、多孔弾性活性物質として振る舞うことが示されている細胞骨格、より一般的には細胞質のモデル系として、多孔弾性アクトミオシンゲルのメカニズムを特徴付けるためのin vitroアプローチを開発しました。この方法は、ミオシンの収縮性が流体の流れの出現にどのように寄与するか、およびネットワークと細胞質ゾル速度が時間と空間でどのように相関しているかについての洞察を提供します。このシンプルなアプローチにより、AFIMのような従来のツールでは使用できない高度な機器や技術を使用せずに、動的に進化するシステムの機械的特性を抽出することができます。
この方法は、活性ゲルと包埋流体の特異性に関係なく、多孔弾性活物質のレオロジーに関する洞察を提供することができます。まず、自家製のポリテトラフルオロエチレンホルダーに10〜12個の1.5番のガラスカバーガラスを置き、400ミリリットルのビーカーにピラニア溶液を準備します。化学フードで氷の上で溶液を準備します。
ホルダーをピラニア充填ビーカーに移します。3時間後、カバーガラスから余分なピラニアを洗い流すために新鮮な二重蒸留水で満たされたきれいなビーカーにホルダーを移し、ビーカーを80ヘルツの超音波処理浴に移し、摂氏25度で10分間フルパワーします。新鮮な二重蒸留水でこの手順をさらに2回繰り返します。
塩類化のために、ホルダーを300ミリリットルの純粋なメタノールで満たされたきれいなビーカーに移し、次いで30分間超音波処理浴に移す。次に、ホルダーをシラン溶液に移します。ビーカーをパラフィルムで密封し、摂氏4度の冷蔵庫に一晩保管します。
翌日、ホルダーを300ミリリットルの純粋なメタノールで満たされたきれいなビーカーに15秒間移します。ホルダーの底を乾かして余分なメタノールを取り除き、きれいなビーカーに移します。次に、ビーカーをオーブンに移して、ガラスのカバーガラスを摂氏120度で5分間乾燥させます。
表面不動態化を実現するには、実験ごとに2つのカバースリップを取り、最初にエタノールで洗浄したパラフィルム層でコーティングされたペトリ皿に入れます。各カバーガラスを1ミリリットルのメトキシポリエチレングリコールマレイミドと1X PBSで摂氏22度で1時間インキュベートします。インキュベーションプロセスの最後に、ペトリ皿を傾けて取り外し、ペグします。
各カバーガラスを5ミリリットルの二重蒸留水ですすぎ、窒素ガスの流れで乾かします。カバーガラスは不動態化後も濡れたままにしておく必要があるため、すぐに1ミリリットルの10ミリモルのトリスをペグ化面に置き、カバーガラスを2時間使用します。大きなミオシン凝集体を形成するには、ミオシンストック溶液を10ミリモルのトリスで希釈して、最終濃度の25ミリモルの塩化カリウムにします。
希釈したミオシン溶液を室温で10分間保持してから、使用するまで氷に移します。モーターは最大2時間完全にアクティブです。ゲル細孔を横切る溶媒の流れを追跡するには、不動態化蛍光ビーズを調製し、1マイクロリットルのビーズを5マイクロモルのG-アクチンと20分間インキュベートすることにより、ビーズとアクトミオシンネットワーク間の相互作用を低減します。
遠心分離により余分なG-アクチンを除去します。残りのコーティングされていない表面をブロックするために、1ミリリットル当たり10ミリグラムのウシ血清アルブミンでこのステップを繰り返し、実験において1〜10, 000の最終希釈でビーズを使用する。アクトミオシン溶液を調製するには、マイナス80°Cで保存されたタンパク質アリコートを解凍し、氷の上に置きます。
次に、10ミリモルのトリス、5マイクロモルのGアクチン、280ナノモルのGSTファシン、および1.67ナノモルのミオシンIIの最終濃度に達するように溶液を調製します。グリースを塗ったパラフォームスペーサーをその上に置き、サンプルホルダーに入れます。ホルダーに取り付けられたカバーガラスに1.1マイクロリットルのアクトミオシン溶液を追加し、2番目のカバーガラスを上に置きます。
ホルダーをねじ込んでサンプルを密封します。サンプルホルダーを顕微鏡に置き、取得を開始します。初期取得時間を短縮するために、事前に顕微鏡を準備してください。
倒立蛍光顕微鏡でサンプルを画像化するには、2.5倍の低倍率対物レンズを使用してゲル領域全体を視覚化し、その巨視的な収縮を経時的に追跡します。10倍対物レンズを使用して、ネットワークの多孔性と構造を特徴付け、ネットワークの自己組織化と収縮を時間とともに追跡します。2色同時イメージングでは、アクチンを488ナノメートル、ミオシンIIモーターを561ナノメートルで励起し、デュアル発光装置を使用してEMCCDカメラに同時に画像を記録します。
同じイメージングシステムを使用して、アクチンゲルと蛍光ミオシンIIモーターを同時にイメージングします。同時2色イメージングのために、アクチンを488ナノメートルで、そして2, 300ナノメートルビーズを561ナノメートルで励起する。そして、デュアルエミッション装置を使用してEMCCDカメラで同時に画像を記録します。
同じイメージングシステムを使用して、アクチンゲルと蛍光ビーズを同時にイメージングします。初日は、アクトミオシンネットワークが弾性材料として振る舞うことを実証することを含みます。アクトミオシンネットワークの概略図をここに描く。
蛍光顕微鏡画像は、アクチンフィラメントが自発的に核形成して等方性の相互連結ネットワークに重合し、時間とともに粗大化し、最終的には巨視的に収縮することを示しています。ネットワーク誘引はゲル周辺で始まり、ゲルバルク内に内向きに伝播します。ゲルの中心はC.アクチンフィラメントバンドルでマークされています ネットワーク収縮中もまっすぐなままです。
T316秒とT327秒における輪郭長と端から端までの距離の比率の分布をここに示します。第2の目的は、ミオシンの収縮性によって外向きの溶媒流が生成されることを実証することです。収縮の中間段階での低倍率でのゲルの画像がここにあります。
これらの円は4つのビーズの位置を示します。矢印はビードモーションのグローバル方向を示します。選択された9つのビーズの軌跡がここに描かれています。
ネットワークの多孔性と、収縮の進行段階でのゲル細孔を横切る溶媒の移動を分解することがここに描かれています。第3の目的は、応力緩和が有効な多孔弾性拡散定数によって特徴付けられることを実証することである。混合時間から定常状態までの低倍率での収縮アクトミオシンゲルの蛍光画像を上面図に示します。
アクトミオシンネットワークは多孔弾性活物質として振る舞う。この手順を試みるときは、迅速かつ正確に作業し、表面保存の重要性を念頭に置いてください。
