機械的な微小環境が細胞シグナル伝達と移動に及ぼす影響に対する評価が高まっています。個々の細胞に機械的刺激を与えるために独特な、実験的なアプローチの使用を必要とする。この技術により、細胞の下にある機械的なマイクロ環境をリアルタイムで動的に操作できます。
細胞移動行動の機械的に調節された変化、および細胞下シグナル伝達イベントの観察を可能にする。私と一緒に手順を実証することは、ポストドクターのナイラ・ナイムと、私たちの研究室の技術者であるジョナサン・パターソンです。Chorono-1を使用して各底カバースリップのガラス表面を20秒間活性化し、すぐに各カバースリップに50マイクロリットルのバインドシラン作業溶液をオーバーレイする。
蓋を95%エタノールで2回、イソプロパノールで2回すがる前に、溶液を10分間乾燥させます。その後、カバースリップを約20分間空気乾燥させます。蛍光マイクロビーズの堆積物の場合、最初に働くマイクロビーズ溶液を1時間超音波処理します。
超音波処理の終了の15分前に、アクティブ化されたカバースリップをセラミックカバースリップホルダーに垂直に入れ、ホルダーをテーブルトッププラズマクリーナーに移して3分間部屋空気プラズマ処理を行います。次に、パラフィンフィルムの破片を60ミリリットルのペトリ皿蓋に入れ、カバースリップをフィルムに置き、各カバースリップを軽くタップしてフィルムとカバースリップの間に良好な接触を確保する。次に、各カバースリップの上部に150マイクロリットルの働くビーズ溶液を加え、すぐにカバースリップの側面からエタノール溶液を吸引し、ビーズをカバースリップに残します。
調製直後にヒドロゲルをキャストするには、各底カバースリップの活性化側にハイドロゲル溶液の25マイクロリットルの液滴を加え、ビーズトップカバーリップをビーズ側を下に、ドロップレットに直ちに反転させます。鉗子を使用してカバーリップを静かに取り外す前に、ゲルを30分間重合させます。その後、洗浄ごとに新鮮な50ミリモラーヘップで3、5分の洗浄でゲルを洗います。
ヒドロゲル表面を活性化するには、0.4ミリモルスルフォサンパーを補った新鮮な50ミリモラーヘペスでゲルをインキュベートし、すぐに90秒間密閉された領域の紫外線アーチランプにゲルを露出させます。活性化の終わりに、新鮮なヘペスで3、5分の洗浄でゲルを洗浄し、37°Cで1時間フィブロネクチンあたり20マイクログラムで活性化ハイドロゲルを治療します。インキュベーションの終了時に、過剰なフィブロネクチン溶液を吸引し、1回の洗浄につき5分間PBSでゲルを3回洗浄する。
最後の洗浄後、少量のPBSにヒドロゲルを入れ、組織培養フードの紫外光の下で15分間ゲルを殺菌します。次いで、新鮮なPBSでゲルを1回洗います。細胞メッキの場合、ヒドロゲル当たりの培地3ミリリットルの対象となる4つの細胞の種子2.1倍10を、細胞が4〜18時間摂氏37度で接着することを可能にする。
細胞が平衡している間、マイクロピペットプーラーを使用して直径1ミリメートル×100ミリメートルのホウケイ酸ガラスマイクロピペットを引き、最初のミリメートルで直径約50マイクロメートルに減少し、最後のミリメートルで直径10マイクロメートルの長い平行に伸びる2ミリメートル以上のテーパーを得る。次に、ピペットをマイクロフォージに積み込み、ピペットを250マイクロメートルのセクションの最後に囲まれた15マイクロメートルの鈍い先端を有するようにピペットを形作り、ピペットの残りの部分から約35度の天使に曲がった。ベンドでの近似直径は、先端に強度を与えるために約30マイクロメートルでなければなりません。
次に、ヒドロゲルを反転した顕微鏡のステージに置きます。ミネラルオイルで媒体を覆い、10倍の目的を選択します。調製したマイクロピペットを70%アルコールで殺菌します。
次に、フックを皿に向けてマイクロピペットホルダーに挿入し、フックが液体の表面に触れるまでピペットを下げるためにコースマニピュレータを使用します。ゲルの上部に付着した細胞に顕微鏡を合わせ、目的がサンプルまたはステージに当たる危険がないことを注意し、ゲルの上に焦点を当ててマイクロピペットの先端を見つける。ピペットを焦点面に垂直に回転させ、マイクロピペットの鈍い先端が下を向くようにし、必要に応じてピペットの先端に再び焦点を合わせます。
細胞層に焦点を合わせ、ピペットがゲル表面からどれくらい離れているかを測定し、ゲルとピペットの先端の間の途中にある平面に焦点を合わせます。次に、ピペットをゆっくりと下げて中間焦点面に到達し、実験に使用される倍率を上げてから、ヒドロゲルの表面のすぐ上にホバリングするまでピペットを下げる。マイクロマニピュレーターキャリブレーションの場合、細胞を欠いた領域、ビーズを含む領域、操作なし、ピペットがゲルを引き付け、係合ピペットがゲルを引っ張って画像化します。
次に、画像Jを使用して、ノービーズフィールドを関与のないビードフィールドと比較し、ビードフィールドをゲルが関与し、引っ張られたゲルを使用して、ゲルに適用される相対的なビーズの変位と力を計算する。デュロタシスアッセイを行う場合は、細胞群を30分間監視し、方向に向けて移動している細胞を特定します。一方向に安定して動いているセルを選択し、目的のフレームレートのセルをさらに 30 分間監視します。
次に、選択したセルの先端の近辺の前に約50マイクロメートルのピペットを配置し、ゲルが細胞の進行方向に直交するようにマイクロマニピュレータを移動します。次に、ヒドロゲルの剛性の急性の局所勾配に反応する細胞を時間をかけて観察します。この手法を用いて、ラット胚性線維芽細胞は、ガラスマイクロピペットによって適用される勾配の増加した剛性に向かって移動する。
ラット胚性線維芽細胞は、125キロパスカルポリアクリルアミドゲル上で一過性に発現するビンクリンテンションセンサを、40分間にわたってストレッチの方向に焦点付着の形成を示す。フォースター共鳴エネルギー伝達分析は、焦点接着に局在するビンクリンが、急性の神経刺激を与えると、緊張の即時変化を経験することを明らかにする。このアッセイの有用性を、従属細胞シグナル伝達事象の観察に拡大し、デューロチック刺激に応答する。
細胞を伸ばす試みを複数回行う場合、またはマイクロニードルがアッセイ中にスリップした場合は、新しいセルからやり直して、複数の可変的な機械的刺激を与えないようにしてください。デュロタクシスをアッセグする有用性を超えて、この技術は、メカノトランスダクションに関与する分子メカニズムを引き出すために、バイオセンサー、RNAI、または遺伝子編集などの遺伝的アプローチと組み合わせることができます。
