私たちの研究は、粒状ハイドロゲルのユニークな特性を利用して、細胞の動きと組織再生の機能を調べることに焦点を当てています。微小環境に対する細胞応答は、トランスレーショナルインパクトへの影響を理解するためにモデル化することが重要です。3Dポートスキャフォールドの使用が増加するにつれて、創傷治癒環境での細胞の挙動をよりよく再現する包括的な3D移動アッセイの必要性も高まっています。
私たちは、足場の開発からイメージング、解析まで、in vitroでの細胞の移動と遊走を調べるための3次元的な2つのパイプラインを開発しました。これら2つの新しいアッセイにより、創傷治癒の2つの異なる段階で応答性細胞を追跡する能力を獲得しました:バルク組織からの最初の足場浸潤と、複雑な足場に囲まれた後の細胞移動。まず、96ウェルプレートの少なくとも6つのウェルで平方センチメートルあたり120,000個のヒト真皮線維芽細胞をプレート化します。
一晩インキュベートした後、アスピレーターまたはピペットを使用して細胞ウェルから培地を取り出します。ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、各ゲル条件の20マイクロリットルの染料をウェルに加えます。25°Cに設定したプレート回転ローター遠心分離機アタッチメントを使用して、プレートを100gで15秒間回転させ、加速と減速を8に設定してゲルを平らにします。
プレートを180度反転させ、再度回転させて、ウェル底全体に均一なゲル分布を確保します。ゲルを無菌的にフォトクロスリンクするには、365ナノメートルの集光を30秒間印加して、足場をアニールします。すべての足場を形成した後、各ウェルに200マイクロリットルの培地を加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。
共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化し、その移動挙動を捕捉します。画像分析の場合は、Imaris Image Conversion Softwareを開いてバッチ変換を行います。顕微鏡画像を変換ソフトウェアにドラッグアンドドロップし、ソフトウェアアリーナ内のフォルダーを選択してファイルをインポートします。
各ファイルを個別に選択して、ボクセル サイズ(Voxel Size)を設定します。[すべて開始] を押して、変換を開始します。次に、Imaris Arena Softwareで、アリーナから画像を選択して処理を開始します。
メインツールバーの「Image Pros」タブをクリックします。次に、チャネル1のドロップダウンメニューをクリックし、[バックグラウンド減算]を選択します。[OK] を押して 3D ビューに戻ります。
小さなツールバーで、「新規サーフェスを追加」というラベルの付いた丸みを帯びた青色の形状のアイコンをクリックして、「サーフェス 1」という名前の編集可能オブジェクトタブを作成します。青い矢印ボタンを使用して、すべての反復のパラメータを手動で生成します。サーフェスの詳細を 0.7 マイクロメートルに設定し、[Background Subtraction]、[Local Contrast] を選択します。
オブジェクトボックスに収まる最大の球の直径に平均セル長を入力します。しきい値処理では、最も明るいセルのみをセグメント化するための強度ヒストグラムを決定します。[Split Touching Objects]、[Region Growing] を有効にし、シード ポイントの直径を以前に使用した直径と一致するように設定します。
バッチ分析用に作成パラメータを保存するには、「作成」というラベルの付いたワンドアイコンをクリックします。「バッチのストア・パラメーター」をクリックし、ファイルに名前を付けて、「OK」をクリックします。すべてのセルの高さを収集するには、[詳細] タブをクリックします。特定の値を選択し、ドロップダウンメニューから[位置Z]を選択します。
「保存」アイコンをクリックして、すべての Z 位置と分類を XLS ファイルにエクスポートします。まず、PBSを層流フードの下のペトリ皿に注ぎ、細胞培地溶液の20マイクロリットルの液滴をペトリ皿の逆蓋にピペットで移します。蓋を皿に戻し、プレートをインキュベートして、液滴培養した3Dスフェロイドを吊るします。
PLOSMAをセットアップするには、容積式ピペットを使用して、透明な96ウェルプレートのウェルに15マイクロリットルのゲルを無菌で追加します。プレートスピニングローター遠心分離機アタッチメントを使用して、プレートを1, 000gで10秒間回転させ、ゲルを平らにします。プレートを180度反転させ、再度回転させて、ゲルが均一に分布するようにします。
次に、365ナノメートルで集光光を30秒間照射して足場をアニールし、ゲルを上からフォトクロスリンクします。吊り下げられた液滴のペトリ皿を無菌的に組織培養フードに移し、蓋を反転させます。20マイクロリットルのピペットを使用して、回転楕円体がピペットの先端に入るまで液滴をゆっくりと吸引し、液滴をウェルの中央にある足場に排出します。
ウェルプレートを摂氏37度で2時間インキュベートし、スフェロイドが足場に付着できるようにします。インキュベーション後、各スフェロイドの上にさらに15マイクロリットルのゲルをピペットで移します。プレートを300gで各方向に15秒間遠心分離し、ゲルが均一に分布するようにします。
先に示したように、紫外線を使用するためにゲルの最上層をアニールします。プレートを共焦点顕微鏡の下に置き、最も低いZ面と最も高いZ面を選択した後、スフェロイドを画像化します。画像をImaris Arenaソフトウェアにインポートした後、Channel 1のドロップダウンメニューをクリックし、[Background Subtraction]を選択します。
パネルの下部にある[OK]を押します。3Dビューで、Display AdjustmentポップアップウィンドウでAuto Adjust All Channelsを押し、必要に応じて修正します。小さいツールバーで、「新規参照フレームを追加」アイコンをクリックして、「参照フレーム 1」というラベルのタブを作成します。
3 つの平面すべてで原点を回転楕円体の中心に移動します。同じツールバーで、オレンジ色の球のアイコンをクリックして新しいスポットを追加し、[スポット 1] という名前のタブを作成し、青い矢印ボタンを押して続行します。しきい値処理では、強度ヒストグラムを調整して、最も明るい部分のみをセグメント化します。
スライサーを使用して、画像スタック内を移動し、精度を確保します。青い[次へ]矢印を3回押します。[スライサーでレンダリング]のチェックを外すか、セットアップパネルの黄色の四角いアイコンをクリックします。
[統計]タブをクリックします。ドロップダウンメニューで、特定の値と原点参照フレームからの距離を選択します。「保存」アイコンをクリックします。
すべての変更と分析を保存するには、メインツールバーの「保存」アイコンをクリックします。この方法は、組織界面での細胞浸潤を評価するために利用されました。移動する細胞のZ軸の中央値の位置は、0時間から24時間にかけて有意に増加し、細胞の垂直方向の顕著な動きを示しています。
Z軸に沿った細胞移動の倍率変化は、24時間後に2倍になりました。PLOSMA法を用いて播種した細胞は、24時間後にスフェロイドコアからの有意な拡散と移動を示しました。3次元レンダリングでは、24時間後にPLOSMA足場に広範な細胞が広がり、目に見える突起が外側に広がっていることが示されました。
Spots関数を用いて処理された3D画像では、足場内の細胞位置が分散していることが明らかになり、広範囲にわたる移動が明らかになりました。細胞は平均200マイクロメートル以上の距離を移動し、サンプル間で一貫した結果が得られました。PLOSMA足場の細胞のZ高さの倍率変化は約4であり、かなり上向きに動いていることを示しています。
