私たちは、キャベツが低酸素に対してどのように反応するかを分子レベルで研究しています。キャベツは入手が難しいため、キャベツの細胞を単離したシステムを開発しています。これらのスペア細胞(プロトプラストとも呼ばれる)を低酸素条件にさらすことで、ストレス応答を容易に調べることができます。
溶液中に懸濁したプロトプラストを使用して低酸素応答を研究するのは難しいです。大きな課題は、コントロールサンプルに十分な酸素を維持することです。私たちは、液体中の酸素を送り出す方法を見つけました。
この方法は、低酸素マーカーのレポーターアッセイを通じてバリデーションされています。低酸素を処理するためのさまざまな方法を調べたところ、脱酸素パックが最も効果的であることがわかりました。使いやすく効果的であるため、低酸素条件下でのプロトプラストの挙動を研究するのに最適です。
低酸素条件下での葉物作物の分子メカニズムの研究は、利用可能なツールが限られているため困難でしたが、近年の進歩により、低酸素処理を施したキャベツプロトプラストシステムを使用することで大きな進歩を遂げました。この新しい方法は、低酸素がこれらの植物に分子レベルでどのように影響するかを理解するのに役立ちます。将来的には、プロトプラスト系を免疫沈降法やレポーターアッセイと組み合わせて、フラッディングストレス時のキャベツの分子制御経路を明らかにする予定です。
私たちの目標は、洪水耐性の主要な規制当局を特定することであり、洪水耐性が向上した新しいキャベツ品種の育種に役立つことを願っています。まず、48ウェルプラグトレイの丸い正方形の穴に市販の植物基板を埋め、フユドリと228個のキャベツの種を約1cmの深さまで蒔きます。12.5ミリリットルの酵素溶液を調製するには、10ミリモルのMESと0.6モルのマンニトールを含む溶液を摂氏55度で予熱します。
次に、1.5%セルラーゼR-10と0.75%マセロチームR-10を追加します。溶液を攪拌し、摂氏55度で10分間温め続けます。酵素溶液を室温まで冷まします。
次に、10ミリモルの塩化カルシウムと0.1%ウシ血清アルブミンを加えます。0.22μmのシリンジフィルターを使用して、酵素溶液を9cmのシャーレに滅菌します。成長の2〜3週間後、葉肉プロトプラストの分離のために、2番目の葉の段階でキャベツの苗を集めます。
5〜8本のキャベツの苗から2番目に新しく拡張された本葉を収集します。鋭利なカミソリの刃を使用して、葉を0.5〜1.0ミリメートルのストリップにスライスします。すぐに葉のストリップを新しく調製した酵素溶液に移します。
キャベツの葉のストリップを暗闇の中で30分間真空浸透させます。真空浸透後、葉片を暗所の酵素溶液に4〜16時間浸しておきます。翌日、プロトプラスト含有溶液を等量のW5溶液で希釈して、酵素消化を停止します。
プロトプラストの懸濁液を放出するには、オービタルシェーカーで混合物を静かに渦巻かせます。次に、70マイクロメートルの細胞ストレーナーを介して細胞懸濁液をろ過し、50ミリリットルの円錐管に入れます。プロトプラスト溶液を150Gで摂氏4度で2分間遠心分離します。
チューブの壁に沿って10ミリリットルのW5溶液を毎秒約1ミリリットルの流量で加え、ペレット化されたプロトプラストを洗浄します。最後の遠心分離後、プロトプラストをW5溶液に再懸濁し、チューブを氷上に30分間置きます。次に、すべての上清が除去されるまで、一度に1ミリリットルの上清を取り除きます。
プロトプラストを氷で事前に冷却したMMG溶液に再懸濁します。血球計算盤を使用してプロトプラスト濃度を測定します。MMG溶液を使用して、最終濃度を10の4倍に5プロトプラスト/ミリリットルの累乗に調整します。
単離と一晩の消化後、プロトプラストの収量は、冬鳥で10の1.04倍7乗、228の新鮮重量で10の4.00倍6乗でした。GFPレポーター遺伝子が示すように、プロトプラストトランスフェクション効率は、フユドリと228の栽培品種の両方で40%を超えていました。キャベツのプロトプラストを単離した後、100マイクロリットルの4×10を4つのプロトプラストの累乗で10マイクロリットルのプラスミドと混合し、混合物を氷上に10分間置きます。
調製したばかりのPEG溶液を等量プロトプラスト溶液に加え、穏やかに混合します。プロトプラスト混合物を室温で暗所で10分間インキュベートします。次に、440マイクロリットルのW5溶液を加えて反応を終了します。
トランスフェクションしたプロトプラストを150 Gで4°Cで2分間遠心分離します。ペレットを750マイクロリットルの酸素富化W5溶液に再懸濁します。再懸濁したプロトプラストを、1%ウシ血清アルブミンであらかじめコード化された6ウェル組織培養プレートに移します。
酸素を消費するバッグ誘発性低酸素症の場合は、W5プロトプラスト溶液を含むプレートを3.5リットルの嫌気性ジャーに入れます。.次に、ジャーに2つの脱酸素パックを追加して、低酸素環境を作り出します。処理後、プロトプラストを150 Gで摂氏4度で2分間遠心分離します。
上清を捨て、採取したプロトプラストを液体窒素中で凍結してから、デュアルルシフェラーゼアッセイに進みます。脱酸素パックは、対照群と比較してBoADH1プロモーター活性が7.0倍に増加し、最も高い低酸素反応を示しました。BoSUS1Lプロモーター活性は5.6倍以上に増加し、脱酸素剤パック処理は治療中最大の誘導を示しました。
