の研究 スパニョーリラボ。ヘルムホルツ協会、FP7-IRG-2008-ENDOPANC助成とERC-2009-開始HEPATOPANCREATIC助成金によって賄われています。

ここで説明されたプロトコルは、もともとパーシバルとスラック9に記載されており、共焦点顕微鏡検査用に最適化手法から適応されています。 1。グラスボトム培養皿のコーティング次の手順は、層流フード内の無菌条件下で行われるべきである。 <ol><li>膵臓外植片を直径20mmガラス底マイクロウェル（ 例えばマテック株式会社）と35mmのペトリ皿で培養される。片培養当たりと文化の全期間1ガラスボトムディッシュを使用しています。膵芽の解剖と分離前日に、フィブロネクチンでコートガラス底マイクロウェル。 </li><li> 50μg/ mlの最終濃度になるように細胞培養グレードの水で滅菌フィブロネクチンを希釈し、全体のガラスの表面を覆うマテックプレートの20mmのマイクロウェル（ 図1E）にそれ（〜150μL）の最小ボリュームを追加します。皿を置き一晩インキュベーションし、4℃の冷蔵庫インチ</li><li>解剖当日、フィブロネクチンを吸引し、細胞培養グレードの水でウェルを洗浄し、ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）を補充BME（イーグル基礎培地）培地150μlの最低限のボリュームを追加、グルタミン（1％ ）、50μg/ mlのゲンタマイシン[解剖ミディアム]。プレート外植片をする準備ができるまで、層流フードでコーティングされた料理を残す。 </li></ol>すべてではないフィブロネクチンコートディッシュが使用されている場合、それらは4℃で1週間用に保存することができます料理は、乾燥解剖ミディアムを埋めて、冷蔵庫にそれらを配置させてはいけない。 フィブロネクチンに加えて、膵臓の外植片は正常ラミニン9、マトリゲル10,11または微多孔膜12として、様々な基板上に培養されている。なぜなら分岐への影響のため、我々は、基板としてフィブロネクチン9を使用します 。 2。 Dの解剖E11.5からorsal膵原 - E12.5マウス胚<ol><li>胎生（E）は11.5または12.5にtimed妊娠雌マウスを屠殺し、胚は、以前の70％エタノールで洗浄解剖器具を使用して収集されます。 50μg/ mlのゲンタマイシンを補充した氷冷PBSを含む10cmのプレートで子宮切開を置きます。 </li><li>そっとはがし、小さなハサミやデュモン鉗子を使用して、個々の胚セグメントに上記、個別子宮、子宮の筋肉からの照明付き実体顕微鏡下と脱落膜に囲まれている個々の胚を、削除してください。胚を露出させ、卵黄嚢と羊膜を除去するために13個の標準胚の解剖技術を使用しています。その後、胚の上体（肝臓上）とテール領域を削除します。これは、内部器官（ 図1B）の露出をできるようになります。氷のように冷たいBME郭清培地を含む10cmのプレートに胚の中間体を転送します。 </li><li>今可視化し、実体顕微鏡下で背膵原を解剖するために下からのみ透視を使用しています。優しく、鉗子で横切開を行うことによって、胚の半ば身体を開きます。胃と脾臓の位置を確認します。背膵原は、胃の後方領域（ 図1C）に横方向に取り付けられている。デュモンピンセットを用いて、例えば胃、脾臓などの隣接する構造から、背側膵原を離れて解剖したが、（ 図1D）上皮間葉の周りにいくつかを残す。ガラスパスツールピペットを用いて、10％ウシ胎児血清を添加した冷たいBME郭清培地[培地]を含む35mmのペトリ皿に孤立したつぼみを転送します。すべての膵臓が隔離されるまで、これらのステップを繰り返します。異なる遺伝子型の膵臓が分離されている場合は、ヌンク4ウェルプレートを用いて分離し、それらを保つ。 </li></ol> 3。膵臓外植片のめっきと文化ファイナルプラットフォーム外植片のINGは文化の物理的な動きを最小限にするために組織培養室および/または組織培養インキュベーターに近接して行われる。 <ol><li>層流フード内で無菌条件下でBME培地の〜150μlを37℃に予め温め℃でフィブロネクチンコートマテック皿のBME解剖媒体を交換</li><li>慎重に、ガラスパスツールピペットを用いて長期培養用の被覆マテック皿（皿当たり1外植片）に膵臓外植片を移す。培養中に拡散を保証するために、外植片を取り囲む間葉が若干細い針で、必要に応じて、リッピングすることができます。 </li><li>数時間外植片は、ガラス底マイクロウェルにアタッチできるように、静かに、インキュベーター（5％CO 2、37℃）、組織培養において培養を置く。一度、それらが結合している、BME培地2mlの37℃予め温め℃に1.5mlでマテック料理を埋める解剖の日を0日目とも呼ばれます。 </li><li>マン膵臓外植培養のipulationは、層流フード内の無菌条件下で行われる。実験的な要件が異なるタイミングを（化学剤による外植片の例インキュベーション）を指示しない限り、BME培地は、一日おきに変更されます。外植片は最大一週間に5日間、この状態で培養することができる。 </li></ol> 4。膵臓外植片のためのホールマウント蛍光免疫染色プロトコール免疫プロトコルの全ての工程は（イメージングへの固定​​から）プラスチックボトムディッシュよりも優れた画像が得られ、同じマテック皿、中で行われる。固定後、膵臓外植培養は、無菌条件下で維持する必要はありません。 <ol><li> BME培地を吸引除去し、2ミリリットル1X PBSで一回外植片を洗う。 </li><li>植固定に2ミリリットル氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）を含むPBSを交換し、氷上で20分間皿を置きます。時間からプレートを静かに回し時間が、外植片を切り離す可能性があるので、ロッキングプラットフォームを避ける。 </li><li> PFAを取り外し、室温（RT）で10分ごとに、1×PBS 2mlを植3回洗浄する。 </li><li>室温で少なくとも30分間、2ミリリットルブロッキング溶液（1×PBS +0.1％トリトン-X + 3％ロバ血清）でブロック。 </li><li>ブロッキング溶液中で一次抗体を希釈し、4℃で一晩インキュベーション全体植体表面を覆うマテックプレートの20mmのマイクロウェルに直接希釈の〜150μlを加える℃まで物理的な動きを最小限に抑えるために、直接、寒い部屋（4℃）で外植片に一次抗体を加える。蒸発を防ぐために、抗体を添加する前に、湿潤チャンバーにマテックプレートを配置します。 </li><li>翌日は、抗体溶液を除去し、室温で30分ごとに+0.1％のTween-20（PBT）を2ミリリットル1X PBSで3回洗浄する。 </li><li>ブロッキング溶液中で二次抗体を希釈し、[製造元の推奨に従って、私たちはロバのAlexa Fluor染料の二次抗を使用する1:750希釈で体]、暗所で室温で1〜2時間のインキュベーションのための全体の外植片表面を覆うマテックプレート、20 mmのマイクロウェルに希釈するの〜150μlを直接追加します。核の対比については、二次抗体の希釈と共にヘキストが含まれています。蒸発を防ぐために、抗体を添加する前に、湿潤チャンバーにマテックプレートを配置します。 </li><li>室温で30分ごとに2ミリリットルの1X PBS +0.1％のTween-20（PBT）で3回洗浄する。 </li><li>マウントする前に、Tween-20を除去するために1×PBSで1回洗浄します。マテックプレートの20mmのマイクロウェルに水性封入剤（抗退色付き）1滴を加えることによって、マウントします。優しく、カバーガラスとの外植片をカバーしています。気泡を避けてください。 </li><li>マテックプレート上の外植片は、実験の目的に応じて、標準的な位相差顕微鏡や共焦点顕微鏡下で観察することができます。共焦点顕微鏡分析のために私達はツァイスLSM 700反転設定を使用します。私たちは、フルオロフォアの適切なレーザーを設定エド。画像膵臓外植片の所望の領域を務める目標を選択します。 10Xの水浸対物レンズは、視野内全体外植片を保持するのに適しています。 40X水または油浸目標は高い分解能を持つ膵臓外植片の特定の領域に焦点を当てるのに適している。外植片は、光学的に区分された後、取得したZ-スタックが適切なソフトウェアを使用して、3Dで再構築することができます。 </li></ol> 5。膵臓外植片の生細胞イメージングプロトコル<ol><li>環境室の設定：環境エンクロージャと小さなインキュベーションチャンバーを使用する顕微鏡ステージ上に座っている[温度とCO 2制御で]。胎児の膵臓の適切な培養は37℃、加湿した5％CO 2の制御された雰囲気の安定した温度を必要とします。適当なチャンバーはいくつかのベンダから提供されています （ 例えば 、ツァイス、ニコン、オリンパス）。ヒーターボックスを組み立て、それをオンにイメージングの前にトン少なくとも1時間は、機器のウォームアップと5％CO 2含有量を平衡化することができますを開 ​​始します。 </li><li>膵臓外植培養のタイムラプスイメージングのために、私たちはツァイスLSM 700倒立顕微鏡を使用しています。レーザーと客観の選択についてポイント4.10を参照してください。 </li><li>膵臓外植片は、ライブイメージングを開始する前に、よくガラスボトムディッシュに付着してみましょう。 [私たちは通常、1日目に始まるライブイメージングを行う]。 層流フードでは、最適な栄養条件で開始するために新鮮なBME培地に植培地を吸引し、交換してください。 </li><li>優しく顕微鏡室に外植片を転送し、共焦点顕微鏡の試料ホルダーにインキュベーションチャンバー内にマテック皿を置きます。 </li><li>目的を準備（ 例えば浸対物レンズの選択に応じて油または水培地を追加）し、外植片の関心領域に焦点を当てる。適切に環境室を閉じます。タイムラプス中の蒸発を防ぐために水の代わりに水浸目標と買収は、それが（ 例えばツァイスImmersol W）が市販されている粘性の液浸の液体を使用することをお勧めします。 </li><li>レーザー強度、Zスタック取得パラメータと時間間隔（これもトラブルシューティングのための議論を参照）を設定します。実験を開始します。 </li><li>イメージング、輸出Zスタックおよびすべての時点の後にして、適切なソフトウェア（ 例えば ImageJは、Volocity、Imaris、ホイヘンス）を使用してそれらを分析する。 </li></ol> 6。代表的な結果背側膵芽は（一緒に周囲の間葉付き）E11.5およびE12.5間のマウス胚から解剖し、ガラス底培養皿（ 図1）に直接播種した。血管が上皮を取り巻く間充織に存在し、血管内皮マーカーPECAM 12（データは示さず）に対する免疫染色により可視化することができる。培養の2日後、膵臓外植ウント飛躍的な成長をerwentとその核膵転写因子陽性であった分枝上皮構造、PDX1（ 図2A-C）に自分自身を整理し始めた。文化の3日目の膵外植片の平均Z-厚さは60〜80μmである。外植片の表面とボリュームが適切なソフトウェア（ 例えばホイヘンス）を用いて測定することができます。形態および免疫蛍光分析は、膵臓外植片は 、in vivo早期膵臓分化と形態形成イベント5,10,11,14（ 図2） で再現 、このプロトコルを使用して培養することを示した。培養4日に膵臓外植片は、典型的な&quot;チップとトランク&quot; CPA1を表示上皮8の分離、+トランク内部クラスタとして編成上皮枝（ 図2C）と差別化されたインスリン+およびグルカゴン+細胞の先端の前駆細胞（ 図2Dを受け）。さらに、pancreatiex vivoで培養中のc上皮は基底膜（赤図2E）で頂端F-アクチンの局在（ 図2E、緑）およびb1インテグリンと共に、適切な細胞骨格の組織と細胞極性を示した。 （ 図3）、リアルタイムで分岐膵臓を研究するために、胚性膵臓外植片は、デュアルカラー蛍光レポーターマウス系統membrane-Tomato/membrane-Green 15（マウス系統は、ジャクソン研究所で利用可能ですMT / mg）を単離した。まだ培養で増殖させたMT /ミリガウス膵臓外植片のタイムラプスムービーからフレームは図3に示します。膜構造をMT蛍光タンパク質の局在は、細胞の形態の概要を説明し、時間をかけて細胞のリモデリングおよび移行を追跡できるように、微細な細胞プロセスの解決が可能になります。 12時間タイムラプス実験後mTの蛍光シグナルは、生存可能とし、VIのまま光損傷（ 図3）に起因する可能性が最も高い、その強度が減少しているにもかかわらず、CTableの。光損傷と光毒性を回避または低減するための技術的な解決策が議論のセクションで説明します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> 図1 E12.5マウス胚から背側膵臓芽解剖の模式図。 E12.5マウス胚の（A）の明視野像。胚（肝臓上）と尾部の上体は、中間体（B）を分離するために削除されます。切開は赤の点線で示されている。胃や十二指腸領域の露光（点線のボックスで示されている）の（C）さらに解剖の結果。背膵原（赤点線の丸で囲んだ部分）、胃と脾臓原基の隣の基地である。解剖背側膵臓芽（D）は、BME培地（Eを含有するガラスボトムディッシュのマイクロウェルにパスツールピペットを用いて転送されます、F）。略語：STO（胃）、SP（脾臓）、DP（背膵原）、デュオ（十二指腸）。スケールバー、1000μmの（A、C）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> 図2：膵臓外植培養のホールマウント共焦点免疫蛍光分析。 1日目および ex vivo培養の2日目に膵臓外植片の（A）の明視野像。赤い点線は、上皮の分岐の開始を示します。 （B）はホールマウントの3D再構成は、3日目の膵文化にPDX1に対する免疫染色。膵臓外植培養の48時間で広範な分岐を受けPDX1 +細胞の細管を示した。側底膜マーカーE-カドヘリン（ECAD）、先端の前駆マーカー、カルボキシペプチダーゼ1（CPA1）およびホスホ - ヒストンH3（pHH3）に対する抗体を用いた3日目の膵外植片の（C）はホールマウント免疫染色。活発な細胞分裂pHH3 +細胞のほとんどはCPA1 +細胞による末梢先端に局在。破線リットルINESは、枝の先端を示す。内分泌系統マーカー、インスリン（INS）と3日目にグルカゴン（Gluca）の（D）のホールマウント免疫染色。黄色の矢印は、INS +とGluca +細胞のクラスターを示す。内分泌細胞クラスタのいずれかの高倍率、（D &#39;）をはめ込み。 PDX1、β1インテグリン（β1int）とF-アクチン（ファクト）の3日目膵臓外植片の（E）ホールマウント免疫染色。 PDX1陽性上皮細胞間に散在間葉系細胞（アスタリスク）。 C、D、およびEに示されている画像は、Zシリーズの単焦点光学セクションです。スケールバーは100μmを（A、B）は、50ミクロン（CE）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> 図3 のex vivo培養膵臓外植片の代表的なライブセルイメージング。 MT /ミリガウストランスジェニックマウス胚から膵臓外植片のタイムラプスムービーから（AD）のフレーム。分：撮影時は時間単位で表示されます。外植片は、1日目から始まる画像化した。 Zスタック画像40X油浸対物レンズと15時間の合計ごとに12分を取得した。破線は、上皮と間充織間の分岐と境界の一角を示す。スケールバーは、50μmである。

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特別な利害関係は宣言されません。

膵臓運命が指定されると、膵臓前駆細胞は、最終的に成熟しており、機能的な臓器2,4を形成するために大規模な増殖、分化、形態形成を受ける。現時点では、分岐方法は、膵臓で行われ、それがどのように前駆細胞の増殖と分化に接続されているほとんど知られていない。膵臓外植培養は 、ex vivo 5,9,11、これらのプロセスを解明するための理想的なシステムを表します...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>抗体： カルボキシペプチダーゼ E-カドヘリン F-アクチン グルカゴン インスリン β1-インテグリン PDX1 PDX1 ホスホヒストンH3 </td><td> ABD Serotec社 インビトロジェン 分子プローブ ImmunoStar ミリポア ミリポア アブカム ハイブリドーマ銀行 細胞シグナリング</td><td> 1810-0006 13から1900 - 12373 20076 4011から01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td>基礎培地イーグル（BME） </td><td>シグマ</td><td> B1522-500ML </td><td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td>細胞培養グレードの水</td><td> PAA </td><td> S15-012 </tD&gt; <td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td>培養皿（ガラス底）、35 mmの</td><td>マテック株式会社</td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>ケミコン</td><td> S30-100ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清ゴールド</td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>インビトロジェン</td><td> 330100から8 </td><td>株式ゾル。細胞培養グレードの水に1 mg / mlの</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15750-037 </td><td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030-024 </td><td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td> 4ウェルMultidishes </td><td>ヌンク</td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡： 倒立共焦点顕微鏡（LSM 700） 実体顕微鏡（ディスカバリーV12） </td><td>ツァイス ツァイス</td><td></td><td>目的： C-アポクロマート0.45 / 10X W M27（work. DIST 1.8ミリメートル;撮像深度〜100ミリメートル）、C-アポクロマート1.2 WコアーM27（work. distの0.28ミリメートル。〜撮像深さ50μm）/ 40X 上から下および光ファイバ照明から透視</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>ロート</td><td> 0335.3 </td><td>原液20パーセント</td></tr><tr><td>パスツールピペット（ガラス）、150ミリメートル</td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td>無菌Cに保たonditions </td></tr><tr><td>ペトリ皿、60ミリメートル</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿、35ミリメートル</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1×PBS、pH7.4の</td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td>春はさみ8ミリメートルブレードが湾曲</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15023から10 </td><td></td></tr><tr><td>トリトン-X100 </td><td>ロート</td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td>時計職人のforecepsデュモン5位</td><td>ロート</td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas

膵臓は消化酵素の生産と血糖値1の規制を含め、私たちの体の重要な機能を制御します。過去10年間に多くの研究では、膵臓の器官形成を理解するための強固な基盤に貢献してきたが、重要なギャップが早期膵臓形成の2の我々の知識に固執する。これらの初期のイベントの完全な理解は、この臓器の開発への洞察を提供するだけでなく、糖尿病や膵臓癌などの膵臓をターゲット難病、になります。最後に、この情報は、糖尿病との関連で、細胞補充療法を開発するための青写真を生成します。 胚発生時、膵臓はマウス胚における3,4日胚（E）は9.5で、背側と腹側前腸内胚葉の異なる胚の増生に由来する。両方の派生物は、固体として周囲の上皮間葉に裏返しにする完全に成熟した器官2,5,6を生成するために、分岐や分化、増殖を受けるリットルの芽、。最近の証拠は、インスリン産生β細胞を含む膵臓細胞系譜、の成長や分化、分岐膵臓上皮7,8内の適切な組織アーキテクチャ、上皮リモデリングと細胞の位置に依存していることを示唆している。しかし、分枝形態形成方法と発生し、膵臓の増殖と分化との間で調整されているほとんど知られていない。これは、形態形成のイベントは非常に動的でありながら、これらの発達過程に関する現在の知識は、固定された試料の分析にほぼ独占的に依存してきたという事実のために一部になっています。 ここでは、開発膵臓（ 図1）の直接可視化を可能にするガラスボトムディッシュ上でex vivoで解剖し、培養マウス胚膵芽する方法について検討する。このカルトUREシステムは、理想的には、特に、ライブセルイメージング共焦点レーザー走査顕微鏡と、ために考案されています。膵臓外植片だけでなく、野生型マウスの胚から調製しただけでなく、遺伝子組み換えマウス系統（ 例えば、トランスジェニックやノックアウト）から、変異体の表現型のリアルタイムの研究を可能にすることができます。また、このex vivoで培養系は 、増殖、成長、伸長、分岐、細管形成と分化に関する定量的なデータを取得できるように、膵臓の開発に化学化合物の効果を研究するために貴重なものです。結論として、高分解能イメージングを組み合わせるex vivoでの膵臓移植片培養法の開発は、彼らが開発したマウス胚の中で発生した形態形成と分化のイベントを観察するための強力なプラットフォームを提供します。

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A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

ここでは、マウス胚性膵臓の分離、培養および操作のための方法を説明します。これは、優れたを表し<em&gt; ex vivoで</em形態形成、分化、成長を含む膵臓開発のさまざまな側面を研究するための&gt;システム。膵原外植片は、数日間培養し、ホールマウント蛍光免疫とライブイメージングなど、さまざまなアプリケーションの範囲で使用することができます。

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

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Research

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Biology

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

13.5K ビュー.  Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine. ここでは、マウス胚性膵臓の分離、培養および操作のための方法を説明します。これは、優れたを表し ex vivoでシステム。膵原外植片は、数日間培養し、ホールマウント蛍光免疫とライブイメージングなど、さまざまなアプリケーションの範囲で使用することができます...

ビデオ: A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

アン EX - OVO</emイメージングとマイクロサーアプリケーションに適して>ニワトリ胚培養システム

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

イモリのレンズ再生を研究するために培養虹彩色素上皮細胞のためのシステム

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

滑液における培養ヒト関節軟骨細胞用の3Dシステム

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

小説<em&gt;エクスビボ</emマウス胎児ハート&gt;文化法

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

ex vivoで培養マウス胚の皮膚およびメラノブラストの移行のライブイメージング

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

アン<em&gt;生体外</em甲状腺の開発を研究する&gt;文化システム

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...