このプロトコルの重要性は、ヒューマンエラーと微生物学の汚染を減らすことに依存しています。さらに、3Dバイオプリンティングアプローチのための何千ものスフェロイドを製造する責任があります。しかし、この問題の主な利点は、労働時間が最適化されていることです。
ソフトウェアパラメータは、回転楕円体の最終的な品質に影響を与える可能性があるため、非常に重要です。そして、最善のアドバイスは、細胞培養培地でのみ試験を行うことです。この方法の視覚的実証は、10ミリリットルの血清学的ピペットで幹細胞懸濁液を採取し、それを50ミリリットルの遠心チューブに移すことから始めることに基づく古い伝統的な3D細胞培養方法であるため、非常に重要です。
その後、400RCFで5分間遠心分離し、ASCペレットを得た。10%FBSを含むDMEM-Lowを用いて細胞ペレットを再懸濁する。細胞カウントを行った後、ASCsを別々の15ミリリットル遠沈管に取り、非付着性ヒドロゲルでマイクロ成形された81および256後退を播種する。
使用されるセルの数の詳細については、テキスト原稿を参照してください。81または256個の円形凹部を含むシリコーンモールドの中央に500マイクロリットルの滅菌2%超高純度アガロース溶液を加える。40分後、シリコーン型から超高純度アガロースを型外し、12ウェルプラスチックプレートのウェルに入れます。
マイクロモールドアガロースとともにウェルに2ミリリットルのDMEM-Lowを加え、ASCを播種する前に少なくとも12時間、5%の大気中二酸化炭素供給で摂氏37度でインキュベートします。層流がオンになっていて、キャビネットのエアフローが正しく機能していることを確認します。機器が正しい電圧に接続され、タブレットが機器に接続されていることを確認します。
キャビネット保護ガラスの高さが、機器のセンサーマーキングと同じレベルにあるかどうかを確認します。機器の左側にあるオン/オフボタンを押します。次に、タブレットと機器が起動するのを待ちます。
チップボックス、遠沈管用ラック、およびマイクロモールドアガロースヒドロゲルを含むプレートを装置のワークスペースに配置します。タブレットで開いたソフトウェアで、[LabWare エディタ]をクリックします。仮想ワークテーブルをセットアップし、ピペット、チップボックス、プラスチックチューブ用のラック、プレートの位置を選択します。
手順に切り替える"ボタンをクリックして、実験中に装置によって実行されるすべてのパラメータとコマンドを含めます。ツールバーとプロシージャリストがソフトウェアで開くのを待ちます。最初に、コマンドを示すために、ピペット化するサンプルの数を組み込み、それをプロシージャー・リストにドラッグします。
次に、ソフトウェアの試薬移送コマンドボタンをクリックして、ASC懸濁液をマイクロモールドを含む12ウェルプレートのウェルに移し、手順リストにドラッグします。プロパティをクリックして、サンプルを転送する機器の開始位置と終了位置を設定します。ソフトウェアが[作業テーブル]ページに戻るのを待ちます。
テキスト原稿の説明に従って、ASC の自動シード用のパラメータを設定します。標準液体タイプとして水を選択します。オプション"ボタンをクリックしてパラメータを設定し、テキスト原稿に記載されているようにASCの均質なサスペンションを作成します。
ソフトウェアのトップバーにあるチェック記号の付いたボタンをクリックして、プログラミングエラーがないことを確認します。ソフトウェアのトップバーにある再生ボタンをクリックしてプログラムを起動します。プログラムどおりに機器を起動します。
そして、それが終わったことを示す音を出すのを待ちます。12ウェルプレートを収集し、5%の大気中の二酸化炭素供給で摂氏37度で少なくとも18時間インキュベートし、完全でコンパクトなスフェロイド形成を可能にします。分析のために、1 日、3 日、および 7 日間の培養後にスフェロイドを手動で収穫します。
マイクロピペットで培地を洗い流し、マイクロモールド非付着性アガロースヒドロゲルからスフェロイドを放出する。マイクロピペットを使用して手動でスフェロイドを収集し、15ミリリットルの遠心管に移します。合計85および160個のスフェロイドを、それぞれ81個および256個の円形後退を有するマイクロ成形非接着ヒドロゲルから測定した。
自動ピペットシステムは、ASC細胞懸濁液を15分で単一の12ウェルプレートの12ウェルに播種した。81マイクロモールド非接着ヒドロゲルを用いて、本研究において972個のスフェロイドを作製した。256マイクロモールド非付着性ヒドロゲルを作製しながら、3072スフェロイドを製造した。
ASCスフェロイドを、そのサイズおよび形状の均質性について分析した。81回の後退を伴うマイクロカビからのASCステロイドは、培養期間中に均質な直径を示した。256の不況を有するマイクロ型からのASCステロイドとは対照的に、最小および最大の直径比は、81および256後退を有するマイクロ型からのASCスフェロイドの1に近かった。
生存率、形態および力の分析は、ASC回転楕円体の成功した大規模生産の証拠を提供しました。ほとんどの場合、問題がエラーなしで突然解決されたことを確認することです。
