私たちの研究室では、細胞内のpHダイナミクスが細胞の挙動をどのように調節するかを理解することに興味を持っています。私たちは、ほとんどのがんで細胞内pHが上昇することがわかっているため、がんの進行に寄与する行動に興味を持っています。私たちは多くの顕微鏡検査を行い、これらの画像からデータを定量化するためのプロトコルを開発しています。
私たちは、pHによって制御される細胞経路とプロセスについてさらに学んでいます。ほとんどのがん細胞株は細胞内pHが高く、多くの細胞株がオートファジーのレベルが上昇していますが、これが関連しているとは思っていませんでした。私たちは最近、遺伝的に正常な細胞の細胞内pHが高いほど、オートファジーを増加させるのに十分であることを示しました。
私たちの研究室は、細胞内pHまたはPHIが全動物モデルで細胞の挙動をどのように制御するかを研究している数少ない研究室の1つです。PHIの増加は、細胞増殖の増加、浸潤性細胞の移動、および組織の混乱を促進することを発見しました。最近では、PHIが高いほど、細胞の共食いの一種であるオートファジーが促進されることを発見しました。
私たちは、SEM用のサンプル調製に高いコストと複雑さが生じ、多くのラボでそのアクセスが制限されることによって生じるギャップに取り組んでいます。サンノゼ州立大学では、SEMのリソースが不足しています。そこで、高価な機器を必要とせずに高解像度の画像をキャプチャできるように、よりアクセスしやすく手頃な価格のプロトコルを開発しました。
このプロトコルは、昆虫学で使用される従来の技術を組み合わせ、走査型電子顕微鏡に代わる費用対効果が高くユーザーフレンドリーな代替手段を提供します。フライのさまざまな部分やさまざまな標本の高解像度画像をキャプチャするために簡単に適応させることができます。まず、目的のショウジョウバエ株を選択し、フライフードが入ったバイアルに入れます。
ハエが成長し、成虫が近づくまで、バイアルを摂氏25度でインキュベートします。次に、成虫のハエに二酸化炭素を麻酔し、二酸化炭素パッドの上に置きます。1ミリリットルの血清ピペットの先細りの端に合うようにガチョウの羽をトリミングして、フェザーフライソーターを準備します。
羽でハエを並べ替え、まっすぐな翼を持つ個体を選択します。次に、1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに70%エタノール1ミリリットルを追加します。選択したフライをチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。
専用のポイントパンチを使用。65ポンドのアーカイブカードストックから小さな三角形のポイントを切り取ります。次に、デュモンの5番の細い先端鉗子を使用して、各ポイントの先端を90度の角度に曲げます。
マイクロ遠心分離管からハエを取り出し、デュモンの5番細い先端鉗子を使用します。糸くずの出ないティッシュでハエをやさしく吸い取り、余分なエタノールを取り除きます。各フライをインデックスカードの左側に、解剖顕微鏡で置きます。
トランスファーピペットを使用して、インデックスカードに1〜2滴の皮接着剤と1〜2滴の脱イオン水を混ぜます。鉗子で幅の広い端にある準備されたカードポイントを拾い上げ、曲げた先端を接着剤の水混合物に軽くたたいて少量の接着剤を塗布します。カードポイントの曲がった先端を、腹部セグメント2と3の周りのフライの右腹部の前面に当てます。
接着剤が乾く前に、フライの前後軸がカードポイントの曲がった先端に垂直になるようにフライを調整します。カードポイントの幅の広い端に3番の取り付けピンを挿入し、昆虫ピン留めブロックに固定します。各ピンまたはピンの行に対応する遺伝子型にラベルを付けます。
ポイントマウントされたショウジョウバエの高解像度写真を取得するには、目はスタッキングイメージングシステムをオンにします。次に、70〜200ミリメートルの望遠レンズを77ミリメートルレンズアダプターを介して20倍Apo顕微鏡対物レンズに取り付けたデジタル一眼レフカメラ本体をセットアップします。試料がディフューザーを通してフラッシュで照らされていることを確認してください。
StackShot コントローラーとマクロ レールを使用して、カメラの Z 位置を制御します。ポイントマウントされたフライをユニバーサルステージジンバルに配置し、目をレンズに向けています。最適な位置合わせのために鉗子を慎重に使用して、頭の位置を調整します。
カメラをラップトップにテザリングし、取得設定を調整します。倍率を20倍、シャッタースピード、1/200秒、絞りF2.8、ISO400に設定します。次に、結果の画像スタックを保存する場所を目的のファイルフォルダに設定します。
次に、StackShotコントロールユニットのフォーカススタック設定を自動距離モードで調整します。ステップサイズを5マイクロメートルに設定し、フォーカススタックの開始位置と停止位置を設定してステップ数を計算します。ライブビューモードで試料を view カメラを自動撮影モードで表示します。
試験片の最も近い部分にピントが合うようにレールを動かします。次に、関心のある最も遠いフィーチャに移動し、フォーカスを調整します。カメラをマニュアル撮影モードに戻し、StackShotコントロールユニットから画像取得を開始します。
イメージング後、取得した画像ファイルを参照先のフォーカススタッキングソフトウェアで開きます。[スタック] を選択し、次に [整列してすべてスタック] または [Pmax] を選択してスタック イメージを生成します。次に、をクリックします フィレット 出力画像を保存して、最終的なスタック画像をtifファイルとして保存します。
ピンマウントされたショウジョウバエの眼をイメージングした後、眼が中央に配置され、適切な照明と最小限の周辺ぼかしで整列している場所で、分析用の重ねられた画像を選択します。フィジーソフトウェアで500マイクロメートルのスケールバー画像を開きます。直線ツールを使用してスケールバーの長さを測定します。
[解析と計測] をクリックして、500 マイクロメートルに対応するピクセル距離を記録します。次に、ミクロンあたりのピクセル数を計算し、これを使用してピクセル測定値をマイクロメートル測定値に変換します。積み重ねられた画像ファイルをフィジーで開きます。
ツールバーから虫眼鏡を選択して、フォーカス領域を拡大します。目と周囲の頭のキューティクルで画面を埋めます。次に、ツールバーからフリーハンド選択ツールを選択し、オマチディアの最も外側の列に続く網膜領域の輪郭を描きます。
選択範囲の一部を削除するには、オプションボタンを押したまま、削除するピクセルを選択します。選択に追加するには、optionボタンとshiftボタンを押したまま、追加するピクセルを選択します。面積を計算するには、「分析と測定」を選択します。
新しいウィンドウに、面積、平均、最小、最大パラメータが表示されます。データをコピーしてスプレッドシートに貼り付け、文書化し、ピクセル単位からマイクロメートル単位に変換します。GMR-DNhe2ハエにおけるDNhe2の過剰発現は、野生型の成虫ハエと比較して、成虫の眼が有意に小さくなりました。
GMR-DNhe2ハエは、野生型のハエと比較して眼面積が41%減少しGMRGAL4ヘテロ接合型のハエと比較して48%減少しました。GMR-DNhe2はAtg1対立遺伝子3のヘテロ接合体で眼のサイズを回復し、74.28平方メートルから129.9平方メートルにしました。
