Il nostro laboratorio è interessato a capire come le dinamiche del pH intracellulare modulano i comportamenti cellulari. Siamo interessati ai comportamenti che contribuiscono alla progressione del cancro perché sappiamo che il pH intracellulare è aumentato nella maggior parte dei tumori. Facciamo molta microscopia e sviluppiamo protocolli per quantificare i dati di queste immagini.
Stiamo imparando di più sui percorsi e sui processi cellulari che sono regolati dal pH. La maggior parte delle linee cellulari tumorali ha un pH intracellulare più elevato e molte mostrano un aumento dei livelli di autofagia, ma non sapevamo che questo fosse collegato. Recentemente abbiamo dimostrato che un pH intracellulare più elevato in cellule geneticamente normali è sufficiente per aumentare l'autofagia.
Il nostro laboratorio è uno dei pochi laboratori che studiano come il pH intracellulare o PHI regola i comportamenti cellulari in un intero modello animale. Abbiamo scoperto che l'aumento delle PHI promuove una maggiore proliferazione cellulare, la migrazione cellulare invasiva e la disorganizzazione dei tessuti. Più recentemente, abbiamo scoperto che un PHI più elevato promuove l'autofagia, che è una forma di cannibalismo cellulare.
Stiamo affrontando il divario creato dall'alto costo e dalla complessità della preparazione dei campioni per il SEM, che ne limita l'accessibilità per molti laboratori. Alla San Jose State, ci mancano le risorse per il SEM. Così abbiamo sviluppato un protocollo più accessibile e conveniente che ci permette di catturare le immagini ad alta risoluzione senza la necessità di costose apparecchiature.
Questo protocollo combina le tecniche tradizionali utilizzate in entomologia e offre un'alternativa economica e facile da usare alla microscopia elettronica a scansione. Può essere facilmente adattato per catturare immagini ad alta risoluzione di diverse parti della mosca o di diversi esemplari. Per iniziare, seleziona il ceppo di drosophila desiderato e mettilo in una fiala contenente cibo per mosche.
Incubare la fiala a 25 gradi Celsius fino a quando le mosche sono cresciute e gli adulti sono vicini. Successivamente, anestetizzare le mosche adulte con anidride carbonica e posizionarle su un cuscinetto di anidride carbonica. Preparare una selezionatrice per mosche di piume tagliando una piuma d'oca per adattarla all'estremità affusolata di una pipetta sierologica da un millilitro.
Ordina le mosche con una piuma e seleziona gli individui con le ali dritte. Quindi, aggiungi un millilitro di etanolo al 70% in una provetta per microcentrifuga da 1,7 millilitri. Trasferisci le mosche selezionate nel tubo e posiziona il tubo sul ghiaccio.
Utilizzando un punzone specializzato. Taglia piccole punte triangolari da cartoncino d'archivio da 65 libbre. Quindi usa una pinza a punta fine numero cinque di Dumont per piegare la punta di ciascun punto a un angolo di 90 gradi.
Rimuovere le mosche dalla provetta della microcentrifuga utilizzando una pinza a punta fine Dumont numero cinque. Tampona delicatamente le mosche con un panno privo di lanugine per rimuovere l'etanolo in eccesso. Posiziona ogni mosca sul lato sinistro su una scheda sotto un microscopio da dissezione.
Utilizzando una pipetta di trasferimento, mescolare una o due gocce di colla per pelli con una o due gocce di acqua deionizzata su una scheda. Raccogli una punta di carta preparata all'estremità larga con una pinza e tampona la punta piegata nella miscela di colla e acqua per applicare una piccola quantità di colla. Applicare la punta piegata della punta della carta sul lato anteriore dell'addome destro della mosca attorno ai segmenti addominali due e tre.
Prima che la colla si asciughi, regola la mosca in modo che il suo asse posteriore anteriore sia perpendicolare alla punta piegata della punta della carta. Inserire un perno di montaggio numero tre nell'estremità larga della punta della carta e fissarlo a un blocco di fissaggio per insetti. Etichetta ogni spillo o fila di spilli con il genotipo corrispondente.
Per acquisire fotografie ad alta risoluzione degli occhi di drosofila montati in modo puntiforme, accendere il sistema di imaging impilabile. Quindi configura un corpo macchina DSLR con un teleobiettivo da 70 a 200 millimetri collegato a un obiettivo per microscopio Apo 20x tramite un adattatore per obiettivo da 77 millimetri. Assicurarsi che il campione sia illuminato con un flash attraverso un diffusore.
Controlla il posizionamento Z della fotocamera utilizzando un controller StackShot e una guida macro. Posizionare la mosca montata sul giunto cardanico universale con l'occhio rivolto verso l'obiettivo. Regolare la posizione della testa, utilizzando attentamente le pinze per un allineamento ottimale.
Collega la fotocamera a un laptop e regola le impostazioni di acquisizione. Impostare l'ingrandimento su 20x, la velocità dell'otturatore, 1/200 di secondo, l'apertura f/2.8 e ISO 400. Quindi, impostare la posizione per il salvataggio della pila di immagini risultante nella cartella di file desiderata.
A questo punto, regolare le impostazioni dello stack di messa a fuoco sull'unità di controllo StackShot in modalità distanza automatica. Impostare la dimensione del passo su cinque micrometri e calcolare il numero di passi impostando le posizioni di avvio e fine della pila di messa a fuoco. Visualizzare il campione in modalità live view con la fotocamera in modalità di scatto automatico.
Spostare la rotaia in modo che la parte più vicina del campione sia a fuoco. Quindi, passare alla funzione più lontana di interesse e regolare la messa a fuoco. Riportare la fotocamera alla modalità di scatto manuale e avviare l'acquisizione dell'immagine dall'unità di controllo StackShot.
Dopo l'imaging, aprire i file di immagine acquisiti nel software di focus stacking di riferimento. Seleziona Impila, quindi allinea e impila tutto o Pmax per generare un'immagine impilata. Quindi fare clic su File e salva immagine di output per salvare l'immagine impilata finale come file tif.
Dopo aver eseguito l'imaging degli occhi di drosofila montati su perno, selezionare l'immagine impilata per l'analisi in cui l'occhio è centrato e allineato con un'illuminazione adeguata e una sfocatura periferica minima. Apri l'immagine della barra della scala da 500 micrometri nel software Fiji. Misura la lunghezza della barra della scala usando lo strumento linea retta.
Fare clic su Analizza e misura per registrare la distanza dei pixel, che corrisponde a 500 micrometri. Quindi, calcola i pixel per micron e utilizzali per convertire le misurazioni dei pixel in misurazioni micrometriche. Apri il file immagine impilato nelle Fiji.
Seleziona la lente di ingrandimento dalla barra degli strumenti per ingrandire l'area di messa a fuoco. Riempi lo schermo con l'occhio e la cuticola della testa circostante. Successivamente, dalla barra degli strumenti, selezionare lo strumento di selezione a mano libera e delineare l'area retinica seguendo la riga più esterna degli ommatidi.
Per rimuovere parte della selezione, tieni premuto il pulsante di opzione e seleziona i pixel da rimuovere. Per aggiungere alla selezione, tieni premuti i pulsanti opzione e Maiusc e seleziona i pixel da aggiungere. Per calcolare l'area, selezionare Analizza e misura.
Una nuova finestra mostrerà i parametri dell'area, della media, del minimo e del massimo. Copia e incolla i dati in un foglio di calcolo per la documentazione e la conversione da pixel a misurazioni micrometriche. La sovraespressione di DNhe2 nei moscerini GMR-DNhe2 ha portato a occhi adulti significativamente più piccoli rispetto ai moscerini adulti di tipo selvatico.
Le mosche GMR-DNhe2 hanno mostrato una riduzione del 41% della zona oculare rispetto alle mosche di tipo selvatico e una riduzione del 48% rispetto alle mosche eterozigoti GMRGAL4. La dimensione dell'occhio è stata ripristinata nelle mosche GMR-DNhe2 eterozigoti per l'allele Atg1 3, portandolo a 129,9 micrometri quadrati da 74,28 micrometri quadrati.
