당사의 실험실은 세포 내 pH 역학이 세포 행동을 조절하는 방법을 이해하는 데 관심이 있습니다. 우리는 대부분의 암에서 세포 내 pH가 증가한다는 것을 알고 있기 때문에 암 진행에 기여하는 행동에 관심이 있습니다. 우리는 많은 현미경 검사를 수행하고 이러한 이미지의 데이터를 정량화하기 위한 프로토콜을 개발합니다.
우리는 pH에 의해 조절되는 세포 경로와 과정에 대해 더 많이 배우고 있습니다. 대부분의 암세포주는 세포 내 pH가 더 높고 많은 세포주가 자가포식 수치가 증가하지만 이것이 연결되어 있는지 몰랐습니다. 우리는 최근에 유전적으로 정상인 세포에서 더 높은 세포 내 pH가 자가포식을 증가시키기에 충분하다는 것을 보여주었습니다.
당사의 실험실은 세포 내 pH 또는 PHI가 전체 동물 모델에서 세포 행동을 조절하는 방법을 연구하는 몇 안 되는 실험실 중 하나입니다. 우리는 증가된 PHI가 세포 증식, 침습적 세포 이동 및 조직 분열을 촉진한다는 것을 발견했습니다. 가장 최근에는 PHI가 높을수록 세포 식인 풍습의 한 형태인 자가포식을 촉진한다는 사실을 발견했습니다.
우리는 SEM을 위한 시료 준비의 높은 비용과 복잡성으로 인해 발생하는 격차를 해결하고 있으며, 이로 인해 많은 실험실에서 접근성을 제한하고 있습니다. 산호세 주립대에서는 SEM을 위한 자원이 부족합니다. 그래서 우리는 값비싼 장비 없이도 고해상도 이미지를 캡처할 수 있는 보다 접근하기 쉽고 저렴한 프로토콜을 개발했습니다.
이 프로토콜은 곤충학에 사용되는 기존 기술을 결합하고 주사 전자 현미경에 대한 비용 효율적이고 사용자 친화적인 대안을 제공합니다. 파리의 다른 부분 또는 다른 표본의 고해상도 이미지를 캡처하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 시작하려면 원하는 초파리 균주를 선택하고 플라이 푸드가 들어있는 바이알에 넣으십시오.
파리가 자라고 성충이 가까이 올 때까지 섭씨 25도에서 바이알을 배양합니다. 다음으로, 성충 파리를 이산화탄소로 마취하고 이산화탄소 패드에 놓습니다. 1밀리리터 혈청학적 피펫의 가늘어진 끝 부분에 맞게 거위 깃털을 다듬어 깃털 파리 분류기를 준비합니다.
깃털로 파리를 분류하고 곧은 날개를 가진 개체를 선택하십시오. 다음으로, 1.7 밀리리터의 마이크로 원심 분리기 튜브에 70 % 에탄올 1 밀리리터를 첨가합니다. 선택한 파리를 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
특수 포인트 펀치를 사용합니다. 65파운드 보관 카드 스톡에서 작은 삼각형 점을 자릅니다. 그런 다음 Dumont 넘버 파이브 파인 팁 핀셋을 사용하여 각 포인트의 팁을 90도 각도로 구부립니다.
Dumont 넘버 파이브 파인 팁 겸자를 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에서 파리를 제거합니다. 과도한 에탄올을 제거하기 위해 보푸라기가 없는 조직으로 파리를 부드럽게 닦아냅니다. 해부 현미경 아래의 인덱스 카드에 각 파리를 왼쪽에 놓습니다.
전사 피펫을 사용하여 인덱스 카드에 가죽 접착제 1-2방울과 탈이온수 1-2방울을 섞습니다. 집게로 넓은 끝에서 준비된 카드 끝을 잡고 구부러진 끝을 접착제 물 혼합물에 두드려 소량의 접착제를 바릅니다. 카드 포인트의 구부러진 끝을 복부 분절 2와 3 주위의 파리의 오른쪽 복부 앞쪽에 적용합니다.
접착제가 마르기 전에 전방 후방 축이 카드 포인트의 구부러진 끝 부분에 수직이 되도록 플라이를 조정하십시오. 숫자 3 장착 핀을 카드 포인트의 넓은 끝에 삽입하고 곤충 고정 블록에 고정합니다. 각 핀 또는 핀의 행에 해당 유전자형을 레이블을 지정합니다.
포인트 마운트 초파리의 고해상도 사진을 획득하려면 눈은 적층 이미징 시스템을 켭니다. 그런 다음 77mm 렌즈 어댑터를 통해 70-200mm 망원 렌즈를 20x Apo 현미경 대물렌즈에 부착한 DSLR 카메라 본체를 설정합니다. 시편이 디퓨저를 통해 플래시로 조명되는지 확인하십시오.
StackShot 컨트롤러와 매크로 레일을 사용하여 카메라의 Z 위치를 제어합니다. 유니버설에 포인트 마운트 플라이를 배치합니다.tage 눈은 렌즈를 향하게 하여 짐벌. 최적의 정렬을 위해 집게를 사용하여 조심스럽게 머리 위치를 조정하십시오.
카메라를 노트북에 테더링하고 획득 설정을 조정합니다. 배율을 20x, 셔터 속도, 1/200초, 조리개 f/2.8 및 ISO 400으로 설정합니다. 그런 다음 결과 이미지 스택을 원하는 파일 폴더에 저장할 위치를 설정합니다.
이제 자동 거리 모드에서 StackShot 제어 장치의 초점 스택 설정을 조정합니다. 스텝 크기를 5마이크로미터로 설정하고 포커스 스택의 시작 및 중지 위치를 설정하여 스텝 수를 계산합니다. 카메라가 자동 촬영 모드에 있는 상태에서 라이브 뷰 모드에서 표본을 봅니다.
표본의 가장 가까운 부분에 초점이 맞춰지도록 레일을 움직입니다. 그런 다음 관심 있는 가장 먼 부분으로 이동하여 초점을 조정합니다. 카메라를 수동 촬영 모드로 되돌리고 StackShot 제어 유닛에서 이미지 획득을 시작합니다.
이미징 후 참조된 초점 스태킹 소프트웨어에서 획득한 이미지 파일을 엽니다. 스택을 선택한 다음 정렬 및 스택 모두 또는 Pmax를 선택하여 스택 이미지를 생성합니다. 그런 다음 파일을 클릭하고 출력 이미지를 저장하여 최종 스택 이미지를 tif 파일로 저장합니다.
핀에 장착된 초파리 눈을 이미징한 후, 눈이 중앙에 있고 적절한 조명과 최소한의 주변 흐림으로 정렬된 분석을 위해 적층된 이미지를 선택합니다. 피지 소프트웨어에서 500마이크로미터 스케일 막대 이미지를 엽니다. 직선 도구를 사용하여 눈금 막대의 길이를 측정합니다.
Analyze and Measure(분석 및 측정)를 클릭하여 500마이크로미터에 해당하는 픽셀 거리를 기록합니다. 그런 다음 미크론당 픽셀을 계산하고 이를 사용하여 픽셀 측정값을 마이크로미터 측정값으로 변환합니다. 피지에서 스택된 이미지 파일을 엽니다.
도구 모음에서 돋보기를 선택하여 초점 영역을 확대합니다. 눈과 주변 머리 큐티클로 화면을 채웁니다. 그런 다음 도구 모음에서 자유형 선택 도구를 선택하고 ommatidia의 가장 바깥쪽 행 다음에 나오는 망막 영역의 윤곽을 그립니다.
선택 영역의 일부를 제거하려면 옵션 버튼을 누른 상태에서 제거할 픽셀을 선택합니다. 선택 영역에 추가하려면 option 버튼과 shift 버튼을 누른 상태에서 추가할 픽셀을 선택합니다. 면적을 계산하려면 분석 및 측정을 선택합니다.
새 창에 면적, 평균, 최소 및 최대 매개변수가 표시됩니다. 데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣어 문서화하고 픽셀에서 마이크로미터 측정으로 변환할 수 있습니다. GMR-DNhe2 파리에서 DNhe2의 과발현은 야생형 성충 파리에 비해 성체 눈이 현저히 작아지는 결과를 낳았다.
GMR-DNhe2 파리는 야생형 파리에 비해 눈 면적이 41% 감소했으며 이형접합 파리에 비해 48% 감소GMRGAL4 나타났습니다. GMR-DNhe2 파리에서 Atg1 대립유전자 3에 대한 이형접합 파리에서 눈 크기가 복원되어 74.28 평방 마이크로미터에서 129.9 평방 마이크로미터로 증가했습니다.
