Наша лаборатория заинтересована в понимании того, как внутриклеточная динамика pH модулирует клеточное поведение. Нас интересуют модели поведения, способствующие прогрессированию рака, потому что мы знаем, что внутриклеточный pH повышен при большинстве видов рака. Мы проводим много микроскопии и разрабатываем протоколы для количественной оценки данных по этим изображениям.
Мы узнаем больше о клеточных путях и процессах, которые регулируются pH. Большинство линий раковых клеток имеют более высокий внутриклеточный pH, и многие из них демонстрируют повышенный уровень аутофагии, но мы не знали, что это связано. Недавно мы показали, что более высокий внутриклеточный pH в генетически нормальных клетках достаточен для увеличения аутофагии.
Наша лаборатория является одной из немногих лабораторий, изучающих, как внутриклеточный pH или PHI регулирует поведение клеток в целой животной модели. Мы обнаружили, что повышенная PHI способствует усилению пролиферации клеток, инвазивной миграции клеток и дезорганизации тканей. Совсем недавно мы обнаружили, что более высокий уровень PHI способствует аутофагии, которая является формой клеточного каннибализма.
Мы устраняем пробел, созданный высокой стоимостью и сложностью подготовки образцов для SEM, что ограничивает его доступность для многих лабораторий. В штате Сан-Хосе нам не хватает ресурсов для SEM. Поэтому мы разработали более доступный и недорогой протокол, позволяющий нам получать изображения с высоким разрешением без необходимости использования дорогостоящего оборудования.
Этот протокол сочетает в себе традиционные методы, используемые в энтомологии, и предлагает экономичную и удобную для пользователя альтернативу сканирующей электронной микроскопии. Его можно легко адаптировать для получения изображений с высоким разрешением различных частей мухи или разных экземпляров. Для начала выберите нужный штамм дрозофилы и поместите его во флакон с кормом для мух.
Инкубируйте флакон при температуре 25 градусов Цельсия, пока мухи не вырастут и взрослые особи не приблизятся. Далее обезболите взрослых мух углекислым газом и положите их на подушечку с углекислым газом. Подготовьте сортировщик перьевых мух, обрезав гусиное перо по размеру конического конца серологической пипетки объемом в один миллилитр.
Отсортируйте мух с помощью пера и выберите особей с прямыми крыльями. Затем добавьте один миллилитр 70%-ного этанола в микроцентрифугу объемом 1,7 миллилитров. Переложите выбранные мушки в трубку и поместите трубку на лед.
С помощью специализированного точечного пробойника. Вырежьте маленькие треугольные точки из архивных карточек весом 65 фунтов. Затем используйте щипцы Дюмона номер пять, чтобы согнуть кончик каждой точки под углом 90 градусов.
Удалите мух из микроцентрифужной пробирки с помощью щипцов с тонким наконечником Dumont номер пять. Аккуратно промокните мух безворсовой тканью, чтобы удалить излишки этанола. Поместите каждую муху с левой стороны на картотеку под микроскопом для препарирования.
С помощью переводной пипетки смешайте одну-две капли клея для кожи с одной-двумя каплями деионизированной воды на карточке. Возьмите подготовленную точку карты на широком конце щипцами и промокните согнутый кончик в клеевой воде, чтобы нанести небольшое количество клея. Приложите согнутый кончик точки карты к передней стороне правого брюшка мухи вокруг второго и третьего сегментов брюшной полости.
Прежде чем клей высохнет, отрегулируйте ширинку так, чтобы ее передняя задняя ось была перпендикулярна изогнутому кончику точки карты. Вставьте монтажный штифт номер три в широкий конец точки для карты и закрепите его на блоке для прикалывания насекомых. Пометьте каждый контакт или ряд контактов соответствующим генотипом.
Для получения фотографий с высоким разрешением глаз дрозофилы с точечным креплением включите систему формирования изображений. Затем установите корпус цифровой зеркальной камеры с телеобъективом от 70 до 200 мм, прикрепленным к объективу микроскопа Apo с 20-кратным увеличением с помощью адаптера для объектива 77 мм. Убедитесь, что образец освещен вспышкой через рассеиватель.
Управляйте позиционированием камеры по оси Z с помощью контроллера StackShot и макрорельса. Расположите острую навесной мушку на универсальном сценическом подвесе глазом к объективу. Отрегулируйте положение головы, осторожно используя щипцы для оптимального выравнивания.
Привяжите камеру к ноутбуку и отрегулируйте параметры съемки. Установите увеличение на 20x, выдержку 1/200 секунды, диафрагму f/2.8 и ISO 400. Затем установите место для сохранения полученного стека изображений в нужную папку с файлами.
Теперь отрегулируйте настройки стека фокусировки на блоке управления StackShot в режиме автоматического определения расстояния. Установите размер шага равным пяти микрометрам и рассчитайте количество шагов, установив начальное и конечное положения стека фокусировки. Просмотрите образец в режиме live view с камерой в режиме автоматической съемки.
Переместите рельс так, чтобы ближайшая часть образца оказалась в фокусе. Затем перейдите к самому дальнему интересующему объекту и отрегулируйте фокус. Верните камеру в режим ручной съемки и начните получение изображения с блока управления StackShot.
После создания изображения откройте полученные файлы изображений в указанном программном обеспечении для совмещения фокуса. Выберите «Выровнять», затем выровнять и сложить все или Pmax для создания наложенного изображения. Затем нажмите «Файл» и «Сохранить выходное изображение», чтобы сохранить окончательное изображение в виде файла tif.
После визуализации глаз дрозофилы, закрепленных на булавке, выберите для анализа сложенное изображение, где глаз центрирован и выровнен с достаточным освещением и минимальным размытием периферии. Откройте изображение масштабной линейки 500 микрометров в программе Fiji. Измерьте длину масштабной линейки с помощью инструмента «Прямая линия».
Нажмите «Анализ и измерение», чтобы записать расстояние в пикселях, которое соответствует 500 микрометрам. Затем вычислите количество пикселей на микрон и используйте это для преобразования измерений в пикселях в микрометрические измерения. Откройте файл изображения в стопке на Фиджи.
Выберите увеличительное стекло на панели инструментов, чтобы увеличить область фокусировки. Заполните экран глазом и окружающей его кутикулой головы. Затем на панели инструментов выберите инструмент «Выбор от руки» и обведите контуром область сетчатки по крайнему ряду омматидий.
Чтобы удалить часть выделенной области, удерживайте нажатой кнопку выбора и выберите пиксели для удаления. Чтобы добавить к выделению, удерживайте нажатыми кнопки Option и Shift и выберите пиксели для добавления. Чтобы вычислить площадь, выберите Анализ и измерение.
В новом окне отобразится площадь, средние, минимальные и максимальные параметры. Скопируйте и вставьте данные в электронную таблицу для документирования и преобразования из пикселей в микрометрические измерения. Чрезмерная экспрессия DNhe2 у мух GMR-DNhe2 привела к значительному уменьшению взрослых глаз по сравнению со взрослыми мухами дикого типа.
У мух GMR-DNhe2 наблюдалось уменьшение площади глаз на 41% по сравнению с мухами дикого типа и на 48% по сравнению с GMRGAL4 гетерозиготными мухами. У гетерозиготных по аллелю Atg1 аллею 3 у GMR-DNhe2 был восстановлен размер глаз, доведя его с 74,28 квадратных метров до 129,9 квадратных микрометров.
