この研究では、慢性的なアルコールの誤用がミトコンドリア代謝を変化させることにより、肺胞マクロファージの免疫機能にどのように影響するかを調査します。全体として、私たちの研究は、アルコールの使用、代謝、免疫機能の交差点を強調しており、免疫学、薬理学、公衆衛生などの分野に関連しています。アルコールの使用は有害な影響を与えることが知られていますが、特定の代謝メカニズム、特に肺胞マクロファージにおけるグルタミン酸化の役割は完全には理解されていません。
さらに、このプロトコルは、方法論的にギャップを埋め、将来の研究での再現性を可能にします。このプロトコルにより、複数の技術的および生物学的複製の高感度ミトコンドリア呼吸をリアルタイムで測定できます。他の細胞タイプに合わせて調整でき、時間がかかる、またはより大きなサンプルサイズを必要とする他の技術よりも代謝機能のアッセイに信頼性があります。
これらの結果は、エタノール曝露が肺胞マクロファージのグルタミン代謝に及ぼす影響を明らかにしており、これは将来の研究における治療的介入に影響を与える可能性がある。一般的に、細胞のグルタミン代謝やその他の疾患モデルを理解する方向にシフトすると予想されます。私たちの研究は、肺マクロファージがエネルギーの燃料源をどのように代謝するかを理解することに焦点を当てています。
マクロファージは、他の免疫細胞へのシグナル伝達や病原体の食作用やクリアランスなど、免疫機能のために多くのエネルギーを必要とするため、次のステップでは、エネルギー代謝の変化をマクロファージの免疫機能と結びつけることに焦点を当てます。まず、エタノールで72時間処理し、T75フラスコで少なくとも50%のコンフルエントまで増殖させたMHS細胞を培養します。BPTES比較のための培地コントロールを含む、制御下およびエタノール処理された各生物学的複製について、5〜6回のテクニカルレプリケートを含むプレートマップを作成します。
細胞を新しい培地またはPBSですすいで、破片や浮遊細胞を取り除きます。次に、T75フラスコに6ミリリットルの血清含有培地を加えて、細胞に栄養を与えます。セルスクレーパーを使用して、フラスコの底が透明になるまでセルを取り外します。
分離した細胞を血清学的ピペットまたは1ミリリットルピペットを使用してピペッティングすることにより分離します。懸濁した細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、200Gで6分間遠心分離して細胞をペレット化します。次に、遠心分離機の細胞ペレットから上清を吸引します。
ペレットに1ミリリットルの培地を加え、細胞を完全に再懸濁します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を微量遠心チューブに移します。10マイクロリットルのトリパンブルーを加え、溶液をよく混ぜます。
次に、10マイクロリットルの細胞トリパンブルー混合物を血球計算盤またはセルカウンターの片側に移し、細胞をカウントします。ここに示す式を使用して、必要なウェルとセルの数に基づいて必要な希釈を計算します。次に、再懸濁した細胞の80マイクロリットルを、96ウェルの細胞外フラックスマイクロカルチャープレートの必要なウェルに適用します。
細胞を摂氏37度の加湿インキュベーターで一晩インキュベートし、5%二酸化炭素で細胞をインキュベートし、プレート内で接着して平衡化させます。処理後、細胞外フラックスパックの上部を取り外し、フラックスパックのプローブ部分を上向きにしてベンチに置きます。200 マイクロリットルの細胞外フラックスキャリブラント溶液を、細胞外フラックスパックカートリッジの底部の各ウェルに適用します。
細胞外フラックスパックカートリッジをセクションを再度取り付けてパラフィルムで包んで組み立てます。カートリッジを摂氏37度、非二酸化炭素、加湿インキュベーター、またはビーズバスに入れて平衡化します。最後に、アッセイ設計のコンピュータの電源を入れ、細胞外フラックスバイオアナライザー装置に接続された分析ソフトウェアを開きます。
まず、コントロール細胞とエタノール処理したMHS細胞をチェックして、顕微鏡下で単層に健康に付着していることを確認します。細胞外フラックスベース培地を調製するには、35ミリリットルを50ミリリットルのチューブに分注します。100ミリモルのピルビン酸ナトリウム、D-グルコース、GlutaMAXをそれぞれ350マイクロリットル加えて安定性を確保します。
準備した溶液を摂氏37度に温めます。次に、細胞外フラックスマイクロカルチャープレートから増殖培地を穏やかに吸引し、細胞を乱すことなく最小限の残留培地を残します。ウェルを最大50マイクロリットルの細胞外フラックスベース培地で洗浄します。
次に、180マイクロリットルの細胞外フラックスベース培地を各ウェルに加えます。細胞外マイクロカルチャープレートを摂氏37度の非二酸化炭素加湿インキュベーターで30分から1時間インキュベートし、平衡化させます。700マイクロリットルの細胞外フラックスベース培地をBPTESチューブに加えて、120ミリモルのストック溶液を調製します。
溶液をピペットで動かして、適切に可溶化します。次に、オリゴマイシンチューブに630マイクロリットルの細胞外フラックスベース培地を加えて100ミリモルの原液を調製し、十分に混合します。次に、720マイクロリットルの細胞外フラックスベース培地をFCCPチューブに加えて、100ミリモルのストック溶液を調製します。
溶液を10回上下にピペットで動かし、化合物を適切に可溶化します。RAチューブに540マイクロリットルの細胞外フラックスベース培地を加えて50ミリモルのストック溶液を調製し、ピペッティングで混合します。30マイクロモルBPTESワーキング溶液を調製するには、1, 500マイクロリットルの細胞外フラックスベース培地と500マイクロリットルの120ミリモルBPTESストック溶液を混合します。
2, 520マイクロリットルの細胞外フラックスベース培地と480マイクロリットルの100ミリモルオリゴマイシンストック溶液を混合して、16ミリモルの作業溶液を作成します。次に、2, 865マイクロリットルの細胞外フラックス補充ベース培地と135マイクロリットルの100ミリモルFCCPストック溶液を混合して、FCCPワーキング溶液を調製します。RAワーキング溶液を調製するには、2, 700マイクロリットルの細胞外フラックス補給ベース培地と300マイクロリットルの50ミリモルRAストック溶液を混合します。
バックグラウンドウェル、メディアコントロールウェル、および細胞含有ウェルに、ここに示す試薬をロードします。エタノール細胞およびBPTES-MHS細胞は、対照細胞と比較して、グルタミン依存性基礎酸素消費率およびグルタミンからのATP結合ミトコンドリア呼吸が低かった。エタノール細胞およびBPTES細胞は、対照細胞と比較して、最大呼吸の損失が少なく、グルタミン依存性の予備呼吸能力が減少しました。
