私たちの研究では、トゥレット症候群患者で観察されたGABARAP欠損をモデル化するために、RNAiを介したAtg8aノックダウン後のショウジョウバエメラノガスターのグルーミング行動を評価しています。私たちは、行動発達におけるaAtg8aの役割を理解し、神経行動プロセスにおけるヒトの対応物の調節機能についての洞察を提供することを目指しています。手動アノテーション法における現在の実験課題には、映像のアノテーションやレビューなどの複雑な分析プロセスや、手動アノテーションに伴う主観性などがあります。
自動化された手法は、効果的に実装および実行するために、コンピューターサイエンスの専門知識が十分に必要になるなどの課題にも直面しています。私たちは、Atg8a遺伝子がショウジョウバエの行動の発達に、これまで確立されてきた以上の役割を果たしていることを発見しました。具体的には、グルーミングと学習の両方を制御していることを発見し、Atg8aオルソログが他の生物でも同様の役割を果たしている可能性があることを示唆しています。
この技術により、ショウジョウバエのグルーミングの頻度と分布を直接定量化できます。これは、自動化されたメソッドを利用できないラボで特に有用であり、間接的な色素ベースのメソッドよりも詳細な分析を可能にします。全体として、私たちの研究は、トゥレット症候群などの強迫行動を示す神経発達障害を研究するためのモデル生物としてのショウジョウバエの使用を進めています。
また、オートファジー関連タンパク質が行動発達に関与しているという証拠が増えています。まず、4つの3ウェル皿を白い面に並べて置き、各皿をスライドガラスで覆います。カメラを皿の上に置きます。
皿の中のハエの視認性を制限する可能性のあるスライドにまぶしさがないことを確認し、プレートの位置を調整するか、必要に応じてライトを暗くしてまぶしさを排除します。次に、録画が行われているベンチの皿とカメラの位置をマークします。生後4〜9日のハエをパラフィルムとペーパータオルで覆われた氷の塊の上に置き、軽く麻酔をかけます。
麻酔をかけたら、ペイントブラシを使用してハエをできるだけ早く観察室に移動します。3ウェルディッシュの各ウェルに1匹ずつハエを入れ、ストレスによる行動変化を引き起こさないように、乱れを最小限に抑えます。麻酔後30分でハエを順応させた後、カメラでハエを記録し、端末を開いてcd PiSpyと入力します。
「python3 PiSpy」と入力します。py を入力し、目的の録画時間とフレームレートを入力します。目的の解像度を選択し、[クイックキャプチャ]をクリックします。
次に、Pi Spyのプレビューカメラ機能を使用して、ハエにピントが合っていて、十分に見えることを確認します。ハエを 10 分間、推奨フレーム レート 24 フレーム/秒で記録し、ファイルを保存します。ビデオを分析するには、ファイルをELAN 6.8ソフトウェアにインポートして、グルーミング動作の詳細な注釈と詳細な分析を行います。
「Tier」を選択し、「Add New Tier」を選択し、ディッシュに「Tier」に「location」と入力し、「add to assign each row」で個人の映像に手動で注釈を付けます。ビヘイビアにアノテーションを付けるには、アノテーションを付けるティアをダブルクリックし、右クリックして、選択したティアに沿ってカーソルをドラッグし、その間に 1 回のグルーミング バウトが見られるようにします。左クリックして新しい注釈を選択し、新しく強調表示された期間をダブルクリックして、その時点で観察された動作の省略形を入力します。
ビデオに完全に注釈が付けられたら、[表示] をクリックしてから [注釈統計] をクリックして、各動作の内訳を取得します。前方グルーミングを、フライ本体の前部で行われるグルーミングと特定します。後部グルーミングを、フライ本体の前後端で行われるグルーミングと特定します。
グルーミング発作は、対照群と比較してAtg8a RNAi変異体で有意に増加しました。グルーミングに費やす時間も、Atg8a RNAi変異体では対照群と比較して有意に増加しました。前方と後方のグルーミング行動の分布に有意差は観察されませんでした。
