受容体チロシンキナーゼと哺乳類の原形質膜との相互作用を研究しています。脂質ラフトと脂質非対称性が受容体の局在、活性化、シグナル伝達をどのように駆動するのかを知りたいと考えています。脂質ラフトは小さく、動的で、温度条件に敏感であるため、直接研究することは困難です。
研究者は、相互作用を研究するために、大きな次数ドメインを持つモデルシステムを使用しなければならないことがよくあります。合成膜小胞および原形質膜小胞は、脂質の非対称性および細胞小器官を欠く細胞膜の不完全な表現である。生細胞を用いて、原形質膜の正確な表現を実現します。
彼らは、生細胞の文脈における受容体シグナル伝達の開始を強調しています。これにより、膜環境が受容体とその下流のシグナル伝達経路に及ぼす影響についての洞察が得られます。まず、ガラスチップ付きのポジティブディスプレイスメント式ピペットを使用して、脂質ストックをホウケイ酸チューブに分注します。
ホウケイ酸チューブを摂氏約50度に設定された加熱ブロックに置き、すべての見かけのクロロホルムが蒸発するまで窒素ガスの流れをチューブに印加します。チューブを真空チャンバーに移し、高真空に1時間さらして、残っている溶媒を取り除きます。次に、無血清ハムのF-12培地を乾燥脂質フィルムに添加して、最終濃度20ミリモルに到達します。
チューブを蓋またはテフロンテープで覆い、摂氏70度の水浴で5分間加熱します。次に、溶液をボルテックスして脂質を懸濁し、マルチラメラベシクルまたはMLVを形成します。メディアが曇った後、全量をマイクロ遠心チューブに移し、摂氏4度で最大3日間保管します。
調製したMLVをメチルαシクロデキストリンと混合し、最終濃度40ミリモルにします。脂質混合物を摂氏37度または摂氏55度の水浴中で30分間インキュベートします。メディアが曇りから晴れに移行するのを観察します。
次に、脂質交換培地を室温まで30〜60分間冷却します。摂氏37度で増殖したチャイニーズハムスター卵巣インスリン受容体細胞と、グルコース1リットルあたり4.5グラムを含む補充されたDMEMで5%二酸化炭素を入手します。60ミリメートルプレートに1.5倍の10のパワーで6細胞の累乗を播種し、それらをインキュベートして80〜90%のコンフルエンシーを得る。
次に、1ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄します。2ミリリットルの無血清ハムのF-12培地で細胞を一晩飢餓状態にします。PBSで細胞を3回洗浄した後、調製した交換培地を1ミリリットル加えます。
細胞を室温で1時間インキュベートし、交換培地に均一に曝露するために15分ごとに渦巻かせます。次に、1ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄します。PBSを細胞培養プレートから完全に取り出し、プレートを45度の角度で10分間、または完全に乾くまでセットします。
残留バッファーを除去した後、乾燥細胞にヘキサンイソプロパノール溶液1ミリリットルを加え、室温のシェーカーで10分間インキュベートします。次に、溶液をホウケイ酸チューブに移します。チューブを覆った後、マイナス20°Cで保管してください。
次に、500マイクロリットルの1つの正常水酸化ナトリウムを使用して、残りの細胞破片を溶解します。容器を室温で10分間振とうし、完全に溶解させます。交換効率を確認するには、100ミリリットルのクロロホルムメタノール30%水酸化アンモニウム溶液をガラス薄層クロマトグラフィータンクに注ぎます。
タンクをしっかりと覆い、蒸気を少なくとも1時間平衡化させます。脂質抽出物サンプルを、有機溶媒が蒸発するまで、窒素ガスの流れの下で低温設定の加熱ブロックで乾燥させます。次に、脂質フィルムを50マイクロリットルの1対1のクロロホルムメタノール溶液に溶解します。
10マイクロリットルのハミルトンシリンジを使用して、サンプルの1〜10マイクロリットルをシリカ高性能TLCプレートにロードします。サンプルを1センチメートルのバンドに適用し、20センチメートルのプレートあたり最大10のバンドをロードします。TLCプレートをTLCタンクに立てて置き、溶媒の前面が8cm移動してリン脂質種を分離します。
次に、プレートを10分間乾燥させ、3%酢酸第二銅と8%リン酸の水溶液を噴霧します。プレートを室温またはヒートガンで30分間再度乾燥させます。プレートが半透明の青から不透明な白に変わります。
次に、180〜200°Cでテンパリングしたオーブンで5〜10分間、または黒い脂質帯が見えるまでプレートを焦がします。処理した細胞を500マイクロリットルの100ナノモルインスリンと無血清培地で室温で5分間インキュベートします。氷冷したPBSで細胞を洗浄した後、氷の上に置いて刺激を止めます。
次に、氷冷したPBSを1ミリリットル加え、セルスクレーパーを使用して細胞を採取します。細胞を3000Gで摂氏4度で5分間ペレット化します。次に、100〜200マイクロリットルの完全RIPA溶解バッファーを細胞ペレットに加え、30〜40回再懸濁して細胞を溶解します。
ライセートを氷上で10分間インキュベートした後、16, 000Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、破片を分離します。上清を新しいチューブに集めます。タンパク質濃度を決定した後、ライセートを5倍のlaemmliバッファーと混合し、摂氏95度で5分間加熱します。
サンプルあたり等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにロードして電気泳動します。タンパク質が100〜250キロダルトンの間で十分に分解されるまで、ランニングバッファーでゲルを100〜150ボルトで泳がせます。次に、分離したタンパク質をトランスファーバッファーを使用してポリフッ化ビニリデンメンブレンに移し、適切な抗体でメンブレンを染色します。
チャイニーズハムスター卵巣IR細胞における脂質交換は、脳スフィンゴミエリンが交換されたときにスフィンゴミエリンバンド強度の増加とホスファチジルコリンバンド強度の低下をもたらしました。逆に、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンまたはDOPCを交換すると、ホスファチジルコリンのバンド強度が増加し、スフィンゴミエリンのバンド強度が減少した。DOPCと交換された細胞は、インスリン依存性IR自己リン酸化の減少を示しました。
対照的に、脳のスフィンゴミエリン交換細胞は、IRリン酸化を維持または中程度に増加させました。正規化されたリン酸化レベルは、pYpY IR強度をウェスタンブロットデータのIRベータ強度で割ることによって決定しました。
