この作品は、健康補助金EY0081と5T32UY07145の国立研究所によってとテンプル騎士団の目の財団によってサポートされていました。ジェイソンRihelは、生命科学研究財団のブリストルスクイブ社のフェローである。

このプロトコルは、独自のラボでの光のインクリメントとデクリメントのゼブラフィッシュ幼生の視覚 - 運動反応を実行する手順を説明します。ゼブラフィッシュは、行動研究のための優れたモデルシステムである。彼らは保守が容易である、彼らは大規模なクラッチサイズを持っている、と彼らはすぐに開発する。例えば、ゼブラフィッシュ幼生の目は、開発の3日目で、彼らは驚愕反応を示すその時の光に敏感です。 第1部：96ウェルプレートにメッキ個々の魚<ol><li> 28で明/暗サイクル下でWT幼虫を育てる℃で少なくとも4日後に受精（DPF）になるまで。私たちの典型的なライト：暗サイクルは午前9時に開始し、そしてライトの10時間OFF、午後11:00に開始のライトの14時間です。最良の行動の結果を得るには、過密を避ける、我々は通常、単一のペトリ皿に50以上の幼虫を保つ。 </li><li> 4 DPF後は、ゼブラフィッシュは、96ウェルプレートに転送する準備が整いました。幼虫より水泳の部屋を与えるために、我々は一般的に650μlの大型よくサイズを96ウェルプレートを使用しますが、標準的な96ウェルプレートは問題なく動作。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、静かによくごとに幼虫を移す。 </li><li>ウェルに魚を転送した後、水の表面が井戸の上にほぼ平らになるように十分な魚の水を各ウェルに必要事項を記入してください。どちらもがあふれたり、アンダーフィルとの録音のカメラ用の光学問題を引き起こす可能性があります。また、ウェルに気泡を導入しないように注意してください。 </li></ol>パート2：記録装置の調査 プロトコルのこの部分については、コンポーネントを識別するためにフィルムを参照し、記録装置の私達の一連の設定をよく理解してください。 <ol><li>内側に録音室には96ウェルプレートの位置を明確に定義された場所です。 </li><li>カメラは背面に配置され、ボックスをオフにミラーを使用してプレートに焦点を当てています。これらのミラーの角度を所定の位置にミラーを保持するネジを回せば調整できます。 </li><li>記録室は、赤外線LEDで下から照らされている。これは、カメラが暗い場所でも魚を見ることができます。幼虫は赤外光を検出できないので、この定数IRの照明は、実験には影響しません。白色LEDは、下から録音室を照らす。彼らは、赤外光とは別に制御されます。上記または側面からの白色光とチャンバーを照らすことは確かに可能ですが、その場合には、注意が強いが、カメラを妨げる可能性が水面からglares避けるように注意する必要があります。 </li><li>数時間以上続くその実験のために、優しく、実験期間中、一定温度を維持するために流水でチャンバーを埋める。水の一定流量を達成する1つの方法は、典型的な水中水槽のヒーターで28℃に加熱され、小さな水槽のポンプでタンクから水をポンプすることです。 </li><li>部屋からの浮遊振動を最小限に抑えるために、全体の記録装置は、重いバランステーブルの上に座っているはず。 </li></ol>パート3：ビデオ追跡のコンピュータのグリッドと96ウェルプレートのアライメント ソフトウェア <ol><li>録音室に魚を含む96ウェルプレートを置きます。 </li><li>水浴を使用する場合は、徐々に水位をプレートの上にこぼれることなく調整するチャンスを与えて、水でプレートを置きます。また、水の流れを遮断する板を追加して、フローを再開する。また、場所に96ウェルプレートを保持するためにバネやゴムバンドを使用してください。 </li><li>視点Videotrackソフトウェアでは、あなたの実験のすべての幼虫が、コンピュータの画面上に表示されることを確認してください。ソフトウェアのコントロールを使用して、それぞれの魚がグリッドの正方形内になるようにしてプレートのウェルにビデオトラッキングソフトのグリッドに合わせます。トラッキングコンピュータは、コンピュータのグリッドがずれそうであれば、魚の動きの一部が失われる可能性があります、これらのボックスのそれぞれに別々の動きを計算されます。またはさらに悪い：2つの隣接する魚は、同じ領域を占有され、1魚としてカウントされる。このステップでは、すべてのレコーディングのために非常に重要です。 </li><li>整列後、プログラムライトがオンとオフに行く必要があるときのタイミング。我々は通常、ボックス内の光や暗順応の3時間がベースラインの活動レベルを得るためだけでなく、幼虫のピペット操作や取り扱いは、次の沈静化する機会を与えるために、両方が可能。ベースラインの後、我々のランプの30分で、代替は、ライトの30分でOFFに続いて、と数回繰り返す。 </li><li>次に、録音室のドアを閉じ、記録を開始します。 </li><li> （フィルムを参照して実際には、我々は、1秒当たりの各魚の活動を記録、しかし実際には視点のソフトウェアは、フレームデータがフレームを記録するデータ収集のデモンストレーションのため）。フレームあたりの最小ピクセルの変化のしきい値を設定すると、特定のカメラとライトの設定に多少左右されます。我々のセットアップのために、我々は通常、4ピクセルのしきい値を使用して、つまり、より少ない4ピクセルが変化している場合、それが背景とみなされます。以上の4ピクセルが移動している場合、それは魚が動いていることを示します。我々は経験的にこのカットは、ほとんどすべての幼虫の水泳やターンの動きを検出することを決定。 </li><li>録音ボックスはかなりよく幼虫を分離するにもかかわらず、部屋に光をオフにして、閉じるなどして開くドアを部屋で、ダンスパーティーを持っている、またはあなたのエクササイズを行うなど、機械的なノイズと中断を最小限にするように注意してください。 </li></ol>パート4：データの分析<ol><li>実験が完了すると、Excelシートにまたはあなたの好みの分析スイートに収集されたデータを転送する。 </li><li>添付のExcelシートは、データがどのようになるかの例です：それは、実験全体を通して、すべての魚のための秒あたりの各幼生の実験や活動の開始からの時間を秒単位（で補足ファイルのサンプルデータを参照して含まれていますこのページのファイル]セクション）。 </li><li>図1は、単一の幼虫の活動の例を示しています。図2は、40重量ゼブラフィッシュの幼虫の平均の代表的なトレースです。で平均化し、OFF応答が顕著と一致している。 <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="図1" width="569" height="398" /> 図1：単一の魚の活性のONとOFFを光で30分の交互の期間に対応する5 DPFでの単一WT魚の活動。。応答にある黒い矢印と赤矢印とOFF応答で示されます。 <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="図2" width="577" height="387" /> 図2：40尾の平均活動のONとOFFを光で30分の交互の期間に対応する5 DPFで40 WT魚の平均活動。。で平均化（黒矢印）とOFF（赤矢印）の応答が顕著と一致している。 </li></ol> 5。代表的な結果図3は、我々の実験のすべてで使用されている実験的な輪郭の概略図概略です。 <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="図3" width="530" height="479" /> 図3。視覚運動反応（VMR）試験の実験的なデザイン。）個々の魚は、録音室で96ウェルプレートに配置されます。それぞれの魚の活性は、毎秒測定されます。 B）魚は、それらを解決するために、ベースラインの活動レベルを得るために暗または明順応の期間を与えられている。 ONとOFFの点灯30分ライトの期間は、3時間の合計のために連続して導入されています。この図は、プローバら、2006から翻案されました。 視覚運動応答のグラフは、どのようなものでしょうか？ 我々は、光のインクリメントとデクリメントのWT魚のONとOFFの応答を測定した。これらの応答は、眼の機能に依存していたことを確認するために、我々はどんな目を発症しないCHK変異体の活性を測定した。図4は、WT、動物だけでなく、CHKの変異体から得られた平均的な活動を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="図4" width="489" height="212" /> 図4：。WT魚は、横方向の目によって媒介される応答のONとOFFを明確に持つ 5 DPFにおけるゼブラフィッシュ幼生の運動行動の光の30分ONと光のOFFの30分への応答では毎秒記録されます。各トレースは、120個々のWT（青のトレース）または3つの実験にわたって記録されたCHK変異体の幼虫（オレンジ色のトレース）から480応答の平均を表しています。 CHKの変異は著しく、光増分または減分のどちらかにその活性を高め、活動の低いベースラインのレベルを持っていない。この図は、Emranら、2007年から適応されました。 NRC変異魚から視覚運動応答 。 NRC変異体は、OKRのテストに基づいて完全にブラインドと考えられていた。 NRC変異体では、光受容体端末が正しく形成されず、視覚的な経路上で深刻な1を危険にさらされます。これらの変異魚から網膜神経節細胞のレコーディングは、彼らは主にOFF型神経節細胞応答、何らかの異常なON - OFFが、2オンタイプの応答がない純粋を示すことを明らかにした。 VMRのテストを使用して、我々はNRC変異体は、通常のオフ応答と遅延と低迷ON -応答を有することを示した（SEeは、図5）。従って、NRC変異体は、以前に考えられていた2のような全盲ではない。 <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="図5" width="591" height="244" /> 図5：NRCのmutatsは光強度の変化に応じてその活性を増加させる行動反応はWTと5 DPFにおけるNRC変異幼虫からの光とOFFする。。各トレースは、各遺伝子型から120個々の魚から480応答の平均を表しています。 NRCの変異体の平均的な運動挙動（ピンクのトレースは）若干としてWT魚（青のトレース）に比べて減少したが、刺激OFF光に続く活発なままです。 WT魚の応答に光に比べてに光にNRC変異体の応答の遅い立ち上がり時間に注意してください。

<ol>
	<li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant.">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish.">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li></ol>

我々は映画の中で示す実験手順はWT魚のすべての代表的なものである。しかし、これらの実験は、（代表的な結果のセクションを参照）だけでなく、変異体の魚で同様に行うことができます。我々は、最適制御の目的のためにチェッカーボードのアウトラインで、同じプレート上にプレートWTの魚や変異体の魚に示唆している。 WTの魚と同じプレート上に変異魚を使用する際に魚の種類は、各ウェルに?...

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		<th>Type</th>
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		<th>Catalogue Number</th>
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<td>Microplate devices</td>
<td>Tool</td>
<td>Whatman</td>
<td>7701-1651</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipetes</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>202205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish water</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>refer to reference #4</td>
</tr>
<tr>
<td>Recording chambers (Zebrabox)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Videotrack Software</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities 

視覚性運動反射（OKR）は、基本的な視覚的な反射がほとんどの脊椎動物で展示し、ビジュアルシーンの相対目を安定させる上で重要な役割を果たしています。しかし、OKRは動物が移動するストライプを検出する必要があります、それはOKRを示すために失敗した魚は完全に盲目ではないかもしれないという可能性があります。一つのゼブラフィッシュ変異体では、ない視運動性応答C（NRC）は、どんな光の条件下ではOKRはテストされていないので、完全に盲目であることが報告された。以前は、我々は、OFF -神経節細胞の活動がこれらの変異体に記録されることが示されている。このようなNRC変異体のような無OKR持つ変異体の魚たちは視覚的な運動行動試験（VMR）を開発したシンプルな光のインクリメントとデクリメントを検出できるかどうかを判断する。このアッセイでは、単一のゼブラフィッシュの幼虫は、自動化されたビデオトラッキングシステムを使用して幼虫の同時モニタリングを可能にする96ウェルプレートの各ウェルに配置されます。ライトON、30分および30分の光をOFFに各幼虫の運動応答を記録し、定量した。 WTの魚は、下げるよりも、ベースラインの活動復帰が続く驚愕反応として知られているONライト、、時のモータ動作の短いスパイクを持って凍結と呼ばれる。 WTの魚は（数分以上）ベースラインの自発運動への復帰をも大幅に照明をOFFにした直後に、その運動活性を増加させ、徐々にしか。 NRCの変異体はWT魚として消えていると同じように応答しますが、WT魚と比較してそれらの平均の活性のわずかな減少を示す。 NRC変異体ではON光に反応して運動能力が遅れ、低迷しています。応答にWT光と比較してのライトにNRC変異体の応答の遅い立ち上がり時間があります。結果は、NRCの魚は完全に盲目ではないことを示している。硬骨は非網膜組織を介して光を検出できるため、我々は、光強度の変化への迅速な行動反応が完全に開発の初期段階から目を欠くchokh（CHK）変異体を、使用して無傷の目を必要とすることを確認した。私たちのVMRのアッセイでは、CHKの変異体は、横方向の目はこの動作を仲介することを示す、ONまたはOFFの光のどちらにも驚愕反応を示さない。 VMRアッセイは、ここで説明する光強度の変化に対応するためにゼブラフィッシュ幼生の能力をテストしていない十分に確立されたOKRアッセイを、補完する。また、VMRアッセイの自動化は、視覚的な反応を駆動する光の強度の欠陥のためのハイスループットスクリーニングに適しています。

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

我々は光をインクリメントおよびデクリメントに対応して幼虫のゼブラフィッシュのモータ出力を定量化するために視覚運動応答を開発した。我々はまた別のビジョンアッセイ、視覚性運動反射によってテストするときに完全に盲目であると思われた視運動性応答（NRC）変異体、何を含めていないゼブラフィッシュのビジョンの変異を調べた。

光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

16.2K ビュー.  Harvard. 我々は光をインクリメントおよびデクリメントに対応して幼虫のゼブラフィッシュのモータ出力を定量化するために視覚運動応答を開発した。我々はまた別のビジョンアッセイ、視覚性運動反射によってテストするときに完全に盲目であると思われた視運動性応答（NRC）変異体、何を含めていないゼブラフィッシュのビジョンの変異を調べた。

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Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

生物学

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

腎上皮再生を研究するためにゼブラフィッシュの前腎のレーザーアブレーション

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

酸化ストレスに赤/近赤外光療法の波長および強度の範囲の効果の評価のための手法<em&gt;インビトロ</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

で液分泌とイオンフラックス速度を測定するためのラムゼイアッセイの使用<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;マルピーギ管

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...