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Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

New England BioLabs

&#x4E3A;&#x4E86;&#x786E;&#x5B9A;&#x65B0;&#x578B;&#x8FDC;&#x85E4;-&alpha;-N-acetylgalactosaminidases (&#x8FDC;&#x85E4;-&alpha;-GalNAcases&#xFF09;&#xFF0C;&#x56DB;&#x4E2A;&#x6F5C;&#x5728;&#x57FA;&#x56E0;&#x88AB;&#x514B;&#x9686;&#x3002;&#x4E09;&#x4E2A;&#x8868;&#x8FBE;&#x86CB;&#x767D; EngEF &#x7684;&#x7CAA;&#x80A0;&#x7403;&#x83CC;&#x3001; &#x75E4;&#x75AE;&#x4E19;&#x9178;&#x6746;&#x83CC;&#xFF0C;&#x4ECE; EngPA &#x548C; EngCP &#x4ECE;&#x4EA7;&#x6C14;&#x835A;&#x819C;&#x68AD;&#x83CC;&#x88AB;&#x51C0;&#x5316;&#x548C;&#x7279;&#x70B9;&#x3002;&#x5176;&#x5E95;&#x7269;&#x4E13;&#x4E00;&#x6027;&#x662F;&#x8C03;&#x67E5;&#x548C;&#x76F8;&#x6BD4;&#x5546;&#x4E1A;&#x4E0A;&#x53EF;&#x7528;&#x7684;&#x8FDC;&#x85E4; alpha GalNAcases &#x4ECE;&#x80BA;&#x708E;&#x94FE;&#x7403;&#x83CC; &#xFF08;EngSP&#xFF09; &#x548C;&#x4EA7;&#x78B1; sp (EngAL)&#x3002;&#x3002;&#x6240;&#x6709;&#x7684;&#x9176;&#x90FD;&#x5B75;&#x5316;&#x5404;&#x79CD;&#x5408;&#x6210;&#x886C;&#x5E95;&#xFF0C;&#x548C;&#x6BD4;&#x8272;&#x6CD5;&#x548C;&#x8584;&#x5C42;&#x8272;&#x8C31;&#x6CD5;&#x5206;&#x6790;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5929;&#x7136;&#x7CD6;&#x86CB;&#x767D;&#x548C;&#x91CA;&#x653E;&#x7CD6;&#x5206;&#x3002;&#x6838;&#x5FC3; 1 &#x53CC;&#x7CD6; Gal beta 1 &#x4E2D;&#xFF0C;3GalNAc alpha 1pNP &#x662F;&#x6700;&#x8FC5;&#x901F;&#x6C34;&#x89E3;&#x7684;&#x57FA;&#x6750;&#xFF0C;&#x7ECF;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x7684;&#x6240;&#x6709;&#x9176;&#x3002;EngEF &#x5C55;&#x793A;&#x6B64;&#x57FA;&#x677F;&#x7684;&#x6700;&#x9AD8; k(cat)&#x3002;EngEF &#x548C; EngPA &#x4E5F;&#x80FD;&#x591F;&#x5145;&#x5206;&#x6C34;&#x89E3;&#x6838;&#x5FC3; 3 &#x53CC;&#x7CD6;&#x5E38;&#x6CF0; beta 1&#xFF0C;3GalNAc alpha 1pNP&#x3002;&#x8FD9;&#x662F;&#x8FDC;&#x85E4;-&alpha;-GalNAcases EngEF &#x548C; EngPA &#x4E0A;&#x9664;&#x4E86;&#x6838;&#x5FC3; 1 O &#x7CD6;&#x6838;&#x5FC3; 3 &#x884C;&#x4E8B;&#x7684;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#x62A5;&#x544A;&#x3002;&#x6709;&#x8DA3;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x6709;&#x6CA1;&#x6709;&#x663E;&#x8457;&#x5DEE;&#x5F02;&#x5177;&#x6709;&#x8F6C;&#x7CD6;&#x57FA;&#x6D3B;&#x52A8;&#x65F6; Gal beta 1&#x3001; 3GalNAc alpha 1pNP &#x6216;&#x5E38;&#x6CF0; beta 1&#xFF0C;&#x4E0E;&#x5B75;&#x5316; 3GalNAc alpha 1pNP &#x5404; 1 &#x73AF;&#x70F7;&#x9187;&#x8FDC;&#x85E4;-&alpha;-GalNAcases &#x4E0B;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x8FD9;&#x9879;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x3002;

&#x65B0;&#x578B;&#x8FDC;&#x85E4;-&alpha;-N-acetylgalactosaminidases &#x4E0E;&#x66F4;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7684;&#x5E95;&#x7269;&#x4E13;&#x4E00;&#x6027;&#x3002;

In an effort to identify novel endo-alpha-N-acetylgalactosaminidases (endo-alpha-GalNAcases), four potential genes were cloned. Three of the expressed proteins EngEF from Enterococcus faecalis, EngPA from Propionibacterium acnes, and EngCP from Clostridium perfringens were purified and characterized. Their substrate specificity was investigated and compared to the commercially available endo-alpha-GalNAcases from Streptococcus pneumoniae (EngSP) and Alcaligenes sp. (EngAL). All enzymes were incubated with various synthetic substrates, and natural glycoproteins and the released sugars were detected by colorimetric assay and thin layer chromatography analysis. The Core 1 disaccharide Gal beta 1,3GalNAc alpha 1pNP was the most rapidly hydrolyzed substrate by all enzymes tested. EngEF exhibited the highest k(cat) for this substrate. EngEF and EngPA were also able to fully hydrolyze the Core 3 disaccharide GlcNAc beta 1,3GalNAc alpha 1pNP. This is the first report of endo-alpha-GalNAcases EngEF and EngPA acting on Core 3 in addition to Core 1 O-glycans. Interestingly, there were no significant differences in transglycosylation activities when Gal beta 1,3GalNAc alpha 1pNP or GlcNAc beta 1,3GalNAc alpha 1pNP was incubated with various 1-alkanols in the presence of the endo-alpha-GalNAcases tested in this work.

Novel endo-alpha-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity.

Dans un effort pour identifier de nouveaux endo-alpha-N-acetylgalactosaminidases (endo-alpha-GalNAcases), quatre g&#xE8;nes potentiels ont &#xE9;t&#xE9; clon&#xE9;s. Trois des prot&#xE9;ines exprim&#xE9;es &#xE0; partir EngEF Enterococcus faecalis, EngPA de Propionibacterium acnes, et EngCP de Clostridium perfringens ont &#xE9;t&#xE9; purifi&#xE9;e et caract&#xE9;ris&#xE9;e. Leur sp&#xE9;cificit&#xE9; de substrat a &#xE9;t&#xE9; &#xE9;tudi&#xE9;e et compar&#xE9;e &#xE0; la disponible dans le commerce endo-alpha-GalNAcases de Streptococcus pneumoniae (EngSP) et Alcaligenes sp. (EngAL). Toutes les enzymes ont &#xE9;t&#xE9; incub&#xE9;es avec diff&#xE9;rents substrats synth&#xE9;tiques, et de glycoprot&#xE9;ines naturelles et les sucres lib&#xE9;r&#xE9;s ont &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;tect&#xE9;s par dosage colorim&#xE9;trique et mince analyse par chromatographie en couche. Le Core 1 disaccharide Gal beta 1,3 GalNAc alpha 1pNP &#xE9;tait le substrat le plus rapidement hydrolys&#xE9; par tous les enzymes test&#xE9;es. EngEF expos&#xE9;es plus haut k (chat) pour ce substrat. EngEF et EngPA &#xE9;taient &#xE9;galement en mesure de pleinement hydrolyser le Core 3 disaccharide GlcNAc b&#xEA;ta 1,3 GalNAc alpha 1pNP. Ce rapport est le premier de l&#x26;#39;endo-alpha-GalNAcases EngEF et EngPA agissant sur Core 3, en plus de base 1 O-glycanes. Fait int&#xE9;ressant, il n&#x26;#39;y avait pas de diff&#xE9;rences significatives dans les activit&#xE9;s de transglycosylation lorsque Gal beta 1,3 GalNAc alpha 1pNP ou GlcNAc b&#xEA;ta 1,3 GalNAc alpha 1pNP a &#xE9;t&#xE9; incub&#xE9;es avec diff&#xE9;rentes 1-alcanols en pr&#xE9;sence des endo-alpha-GalNAcases test&#xE9;s dans ce travail.

Roman Endo-alpha-N-acetylgalactosaminidases plus large sp&#xE9;cificit&#xE9; de substrat avec

In dem Bem&uuml;hen um neuartige Endo-Alpha-N-Acetylgalactosaminidases (Endo-Alpha-GalNAcases) zu identifizieren wurden vier potenzielle Gene geklont. Drei der exprimierten Proteine EngEF von Enterococcus Faecalis, EngPA von Propionibakterien und EngCP von Clostridium Perfringens wurden gereinigt und charakterisiert. Ihrer Substratspezifit&auml;t wurde untersucht und verglichen mit den handels&uuml;blichen Endo-Alpha-GalNAcases von Streptococcus Pneumoniae (EngSP) und Alcaligenes SP. (EngAL). Alle Enzyme wurden mit verschiedenen synthetischen Substraten inkubiert und nat&uuml;rliche Glykoproteine und der ver&ouml;ffentlichten Zucker durch kolorimetrische Assays und D&uuml;nnschicht-Chromatographie-Analyse erkannt wurden. Die Core 1 Disaccharid Gal Beta 1, 3GalNAc alpha 1pNP war das am schnellsten hydrolysiert Substrat durch alle Enzyme getestet. EngEF stellte die h&ouml;chste k(cat) f&uuml;r dieses Substrat. EngEF und EngPA konnten auch voll die Core 3 Disaccharid GlcNAc Beta 1, 3GalNAc alpha 1pNP hydrolysieren. Dies ist der erste Bericht der Endo-Alpha-GalNAcases EngEF und EngPA auf Core 3 neben Core 1 O-Glykanen. Interessanterweise gab es keine signifikanten Unterschiede in Transglycosylation Aktivit&auml;ten als Gal Beta 1, 3GalNAc alpha 1pNP oder GlcNAc Beta 1, 3GalNAc alpha 1pNP war inkubiert mit verschiedenen 1-Alkanols in Anwesenheit der Endo-Alpha-GalNAcases getestet, in diesem Werk.

Neuartige Endo-Alpha-N-Acetylgalactosaminidases mit breiteren Substratspezifit&auml;t.

Nel tentativo di identificare nuovi endo-alfa-N-acetylgalactosaminidases (endo-alfa-GalNAcases), quattro geni potenziali sono stati clonati. Tre delle proteine espresse EngEF da Enterococcus faecalis, EngPA da Propionibacterium acnes ed EngCP da c. perfringens sono stati purificati e caratterizzata. Loro specificit&agrave; di substrato &egrave; stato indagato e rispetto alla endo-alfa-GalNAcases commercialmente disponibile da Streptococcus pneumoniae (EngSP) e Alcaligenes SP. (EngAL). Tutti gli enzimi sono stati incubati con vari substrati sintetici e naturali glicoproteine e gli zuccheri rilasciati sono stati rilevati da dosaggio colorimetrico e analisi cromatografia su strato sottile. Il disaccaride Core 1 Gal beta 1, alfa 1pNP 3GalNAc era il substrato pi&ugrave; rapidamente idrolizzato dagli enzimi tutti testati. EngEF esposto il k(cat) pi&ugrave; alto per questo substrato. EngEF ed EngPA sono stati in grado di idrolizzare completamente il Core 3 disaccaride GlcNAc beta 1, alfa 1pNP 3GalNAc. Questo &egrave; il primo rapporto di endo-alfa-GalNAcases EngEF ed EngPA che agiscono sul Core 3 oltre a Core 1 O-glicani. &Egrave; interessante, c&#39;erano differenze significative nell&#39;attivit&agrave; transglycosylation quando 3GalNAc alfa 1pNP, GlcNAc beta 1 o beta Gal 1, alfa 1pNP 3GalNAc &egrave; stato incubato con vari 1-alkanols in presenza di endo-alfa-GalNAcases testato in questo lavoro.

Romanzo endo-alfa-N-acetylgalactosaminidases con la pi&ugrave; ampia specificit&agrave; di substrato.

&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;-&#x3B1;-N-acetylgalactosaminidases&#xFF08;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;-&#x3B1;-GalNAcases&#xFF09;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x52AA;&#x529B;&#x3067;&#x306F;&#x3001;4&#x3064;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x304C;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x767A;&#x73FE;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D4;&#x30AA;&#x30F3;&#x9178;&#x306E;&#x306B;&#x304D;&#x3073;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x8178;&#x7403;&#x83CC;&#x3001;EngPA&#x304B;&#x3089;EngEF&#x3068;&#x3001;&#x30A6;&#x30A7;&#x30EB;&#x30B7;&#x30E5;&#x83CC;&#x304B;&#x3089;EngCP&#x306E;&#x3046;&#x3061;3&#x3064;&#x306F;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3057;&#x3001;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3057;&#x3001;&#x5E02;&#x8CA9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x80BA;&#x708E;&#x7403;&#x83CC;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;-&#x3B1;-GalNAcases&#xFF08;EngSP&#xFF09;&#x3068;Alcaligenes&#x5C5E;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x305F;&#x3002; &#xFF08;EngAL&#xFF09;&#x3002;&#x5168;&#x3066;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x3001;&#x69D8;&#x3005;&#x306A;&#x5408;&#x6210;&#x57FA;&#x8CEA;&#x3068;&#x5171;&#x306B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30E5;&#x30D9;&#x30FC;&#x30C8;&#x3057;&#x3001;&#x5929;&#x7136;&#x306E;&#x7CD6;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x89E3;&#x653E;&#x7CD6;&#x306F;&#x6BD4;&#x8272;&#x5206;&#x6790;&#x3068;&#x8584;&#x5C64;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x5206;&#x6790;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x691C;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x30B3;&#x30A2;1&#x7CD6;&#x30AE;&#x30E3;&#x30EB;&#x30D9;&#x30FC;&#x30BF;1,3 GalNAc&#x306E;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A1;1pNP&#x306F;&#x3001;&#x8A66;&#x9A13;&#x3057;&#x305F;&#x5168;&#x3066;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6700;&#x3082;&#x6025;&#x901F;&#x306B;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x57FA;&#x677F;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002; EngEF&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x57FA;&#x677F;&#x306E;&#x6700;&#x9AD8;K&#xFF08;&#x732B;&#xFF09;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002; EngEF&#x3068;EngPA&#x3082;&#x5B8C;&#x5168;&#x306B;&#x30B3;&#x30A2;3&#x7CD6;&#x306E;GlcNAc&#x3B2;1,3 GalNAc&#x306E;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A1;1pNP&#x3092;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x3001;&#x30B3;&#x30A2;1 O-&#x7D50;&#x5408;&#x578B;&#x7CD6;&#x9396;&#x306B;&#x52A0;&#x3048;&#x3066;Core 3&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;-&#x3B1;-GalNAcases EngEF&#x3068;EngPA&#x6F14;&#x6280;&#x306E;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x5831;&#x544A;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x8208;&#x5473;&#x6DF1;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3001;&#x30AE;&#x30E3;&#x30EB;&#x30D9;&#x30FC;&#x30BF;1,3 GalNAc&#x306E;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A1;1pNP&#x307E;&#x305F;&#x306F;GlcNAc&#x306E;&#x30D9;&#x30FC;&#x30BF;1,3 GalNAc&#x306E;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A1;1pNP&#x3053;&#x306E;&#x4F5C;&#x54C1;&#x3067;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;-&#x3B1;-GalNAcases&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x69D8;&#x3005;&#x306A;1  - &#x30A2;&#x30EB;&#x30AB;&#x30CE;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30E5;&#x30D9;&#x30FC;&#x30C8;&#x3057;&#x305F;&#x7CD6;&#x8EE2;&#x79FB;&#x6D3B;&#x6027;&#x306B;&#x6709;&#x610F;&#x5DEE;&#x306F;&#x8A8D;&#x3081;&#x3089;&#x308C;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;

&#x3088;&#x308A;&#x5E83;&#x7BC4;&#x306A;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x898F;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;-&#x3B1;-N-acetylgalactosaminidases

&#xC18C;&#xC124; &#xC5D4;&#xB3C4;-&#xC54C;&#xD30C;-N-acetylgalactosaminidases (&#xC5D4;&#xB3C4;-&#xC54C;&#xD30C;-GalNAcases)&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574;, 4 &#xAC1C;&#xC758; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCF5;&#xC81C; &#xB41C;. 3 &#xD45C;&#xD604;&#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; EngEF Enterococcus faecalis, Propionibacterium acnes&#xC5D0;&#xC11C; EngPA &#xBC0F; EngCP Clostridium perfringens&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC815;&#xD654; &#xB418;&#xC5C8;&#xACE0; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131; &#xC870;&#xC0AC; &#xB418;&#xC5C8;&#xACE0; &#xC5F0;&#xC1C4; &#xC0C1; &#xAD6C; &#xADE0; &#xADE0; (EngSP)&#xC640; sp. Alcaligenes (EngAL)&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C1;&#xC5C5;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC774;&#xC6A9; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xC5D4;&#xB3C4;-&#xC54C;&#xD30C;-Galnacases&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574;. &#xBAA8;&#xB4E0; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xD569;&#xC131; &#xAE30;&#xD310;&#xC73C;&#xB85C; &#xC778; &#xD050;&#xBCA0;&#xC774; &#xD305; &#xD588;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC790;&#xC5F0; glycoproteins&#xACFC; &#xCD9C;&#xC2DC; &#xC124;&#xD0D5; &#xC0C9;&#xB3C4;&#xACC4; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC587;&#xC740; &#xCE35; &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8;&#xD1A0;&#xADF8;&#xB798;&#xD53C; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCF54;&#xC5B4; 1 &#xC2DC;&#xD0A4;&#xAE30; Gal &#xBCA0;&#xD0C0; 1 3GalNAc &#xC54C;&#xD30C; 1pNP &#xBAA8;&#xB4E0; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC00;&#xC7A5; &#xBE60;&#xB974;&#xAC8C; hydrolyzed &#xAE30;&#xD310; &#xC774;&#xC5C8;&#xB2E4;. Engef&#xC774;&#xC774; &#xAE30;&#xD310;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC00;&#xC7A5; &#xB192;&#xC740; k(cat) &#xC804;&#xC2DC;. Engef&#xC640; Engpa&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xC644;&#xC804;&#xD788; hydrolyze &#xCF54;&#xC5B4; 3 &#xC2DC;&#xD0A4;&#xAE30; GlcNAc &#xBCA0;&#xD0C0; 1, 3GalNAc &#xC54C;&#xD30C; 1pNP &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC5D4;&#xB3C4;-&#xC54C;&#xD30C;-GalNAcases Engef&#xC640; EngPA &#xCF54;&#xC5B4; 1 O-glycans &#xC678;&#xC5D0; &#xCF54;&#xC5B4; 3&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD589;&#xB3D9;&#xC758; &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;. &#xD765;&#xBBF8;&#xB86D;&#xAC8C;&#xB3C4;, transglycosylation &#xD65C;&#xB3D9;&#xC5D0; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xCC28;&#xC774;&#xAC00; &#xC788;&#xC5C8;&#xB2E4; Gal &#xBCA0;&#xD0C0; 1, 3GalNAc &#xC54C;&#xD30C; 1pNP &#xB610;&#xB294; GlcNAc &#xBCA0;&#xD0C0; 1 &#xB54C;&#xC5D0;&#xC11C; 3GalNAc &#xC54C;&#xD30C; 1pNP &#xC0AC;&#xC6A9; &#xC548; &#xB41C; incubated&#xB294;&#xC774; &#xC791;&#xD488;&#xC5D0;&#xC11C; alkanols 1-&#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC5D4;&#xB3C4; &#xC54C;&#xD30C; GalNAcases &#xC874;&#xC7AC; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;.

&#xC18C;&#xC124; &#xC5D4;&#xB3C4;-&#xC54C;&#xD30C;-N-acetylgalactosaminidases&#xB85C; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD55C; &#xAE30;&#xD310;.

En un esfuerzo para identificar nuevos endo-alfa-N-acetylgalactosaminidases (endo-alfa-GalNAcases), cuatro genes potenciales fueron clonados. Tres de los EngEF prote&#xED;nas expresadas a partir de Enterococcus faecalis, EngPA del Propionibacterium acnes, y EngCP de Clostridium perfringens fueron purificados y caracterizados. Su especificidad por el sustrato y se investig&#xF3; en comparaci&#xF3;n con el disponible comercialmente endo-alfa-GalNAcases de Streptococcus pneumoniae (EngSP) y Alcaligenes sp. (EngAL). Todas las enzimas se incubaron con diversos sustratos sint&#xE9;ticos, y glicoprote&#xED;nas naturales y los az&#xFA;cares liberados fueron detectados por ensayo colorim&#xE9;trico y an&#xE1;lisis cromatograf&#xED;a de capa fina. El Core 1 disac&#xE1;rido Gal 1,3 GalNAc alfa beta 1pNP fue el sustrato m&#xE1;s se hidroliza r&#xE1;pidamente por todas las enzimas analizadas. EngEF mostr&#xF3; la mayor k (cat) para este sustrato. EngEF EngPA y tambi&#xE9;n fueron capaces de hidrolizar completamente el Core 3 disac&#xE1;rido GlcNAc beta de 1,3 GalNAc alfa 1pNP. Este es el primer informe de endo-alfa-GalNAcases EngEF y la actuaci&#xF3;n EngPA el Core 3, adem&#xE1;s de Core 1 O-glicanos. Curiosamente, no hubo diferencias significativas en las actividades de transglicosilaci&#xF3;n cuando Gal beta 1,3 GalNAc alfa 1pNP o beta GlcNAc alfa 1,3 GalNAc 1pNP se incubaron con diversos 1-alcanoles en la presencia de las endo-alfa-GalNAcases ensayados en este trabajo.

Ellen P. Guthrie

New England BioLabs

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases