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A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

University of British Columbia 

El canal de SecY sirve para transportar las prote&iacute;nas a trav&eacute;s de la membrana bacteriana interna. El canal cerrado es impermeable a mol&eacute;culas peque&ntilde;as mediante el dominio de un enchufe y un poro hidrof&oacute;bico, que consta de seis residuos conservados de la isoleucina. La sustituci&oacute;n de estos isoleucines por asparagina conduce a la conductancia selectiva de aniones monovalentes peque&ntilde;os, especialmente cloruro. En este ap&eacute;ndice, mostramos que el reemplazo de los residuos de isoleucina por fenilalanina voluminoso tambi&eacute;n conduce a una conductancia cloruro mayor, sugiriendo que la hidrofobicidad del poro no es el &uacute;nico factor determinante para mantener la impermeabilidad del canal. En cambio, incubaci&oacute;n de la membrana con el cati&oacute;n trivalente Al(3+) aumenta dram&aacute;ticamente transporte de cl (-) a trav&eacute;s del canal de SecY de tipo salvaje, sugiriendo densidad de carga superficial alrededor de los juegos de poro SecY un papel importante durante el proceso de conductancia de cloruro.

Modulaci&oacute;n de la permeabilidad del canal SecY por mutaciones de poro y cationes trivalentes.

SecY &#xCC44;&#xB110; &#xB0B4;&#xBD80; &#xC138;&#xADE0; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xC218;&#xC1A1; &#xD558;&#xB294; &#xC5ED;&#xD560;. &#xB2EB;&#xD78C;&#xB41C; &#xCC44;&#xB110;&#xC740; &#xD50C;&#xB7EC;&#xADF8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; 6 &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; &#xC774;&#xC18C;&#xB958;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC73C;&#xB85C; &#xC774;&#xB8E8;&#xC5B4;&#xC9C4; &#xC18C;&#xC218; &#xC131; &#xAE30; &#xACF5;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC791;&#xC740; &#xBD84;&#xC790;&#xB97C; &#xD22C;&#xACFC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC544;&#xC2A4;&#xD30C;&#xB77C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; isoleucines&#xC758; &#xB300;&#xCCB4; &#xC791;&#xC740; &#xC5EC;&#xB7EC;&#xCC28;&#xB840; &#xC74C;&#xC774;&#xC628;, &#xD2B9;&#xD788; &#xC5FC;&#xD654;&#xC758; &#xC120;&#xD0DD;&#xC801; &#xC804;&#xB3C4;&#xB3C4; &#xC774;&#xB04C;&#xC5B4; &#xB0B8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBD80;&#xB85D;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xBD80;&#xD53C;&#xAC00; &#xD398;&#xB2D0;&#xC54C;&#xB77C;&#xB2CC;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC774;&#xC18C;&#xB958;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC758; &#xAD50;&#xCCB4;&#xB3C4; &#xC99D;&#xAC00; &#xC5FC;&#xD654; &#xC804;&#xB3C4;&#xB3C4;&#xB97C; &#xB9AC;&#xB4DC; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; &#xAE30; &#xACF5;&#xC758; hydrophobicity &#xCC44;&#xB110; impermeability&#xB97C; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xC720;&#xC77C;&#xD55C; &#xACB0;&#xC815; &#xC694;&#xC778;&#xC774; &#xC544;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB300;&#xC2E0;, trivalent &#xC591;&#xC774;&#xC628; al(3+)&#xC640; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778;&#xC758; &#xC778;&#xD050;&#xBCA0;&#xC774;&#xC158; &#xADF9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC99D;&#xAC00; Cl(-) &#xC804;&#xC1A1; SecY &#xAE30; &#xACF5; &#xC5F0;&#xADF9; &#xC8FC;&#xC704; &#xD45C;&#xBA74; &#xC804; &#xD558; &#xBC00;&#xB3C4; &#xC81C;&#xC548; &#xC640;&#xC77C;&#xB4DC; &#xD0C0;&#xC785; SecY &#xCC44;&#xB110;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC5FC;&#xD654; &#xC804;&#xB3C4;&#xB3C4;&#xC758; &#xACFC;&#xC815;.

&#xAE30; &#xACF5; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBC0F; trivalent &#xC591;&#xC774;&#xC628;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; SecY &#xCC44;&#xB110; &#xD22C;&#xACFC;&#xC728;&#xC758; &#xBCC0;&#xC870;.

SecY &#x901A;&#x9053;&#x6709;&#x52A9;&#x4E8E;&#x8DE8;&#x5185;&#x7EC6;&#x83CC;&#x88AB;&#x819C;&#x4E0A;&#x8FD0;&#x8F93;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;&#x5C01;&#x95ED;&#x7684;&#x901A;&#x9053;&#x662F;&#x901A;&#x8FC7;&#x63D2;&#x5934;&#x57DF;&#x548C;&#x758F;&#x6C34;&#x5B54;&#xFF0C;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x516D;&#x4E2A;&#x5B88;&#x6052;&#x5F02;&#x4EAE;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x7559;&#x7684;&#x5C0F;&#x5206;&#x5B50;&#x4E0D;&#x900F;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B; isoleucines &#x7684;&#x5929;&#x51AC;&#x9170;&#x80FA;&#x7684;&#x66FF;&#x4EE3;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5C0F;&#x5355;&#x4EF7;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#xFF0C;&#x5C24;&#x5176;&#x662F;&#x6C2F;&#x79BB;&#x5B50;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x7535;&#x5BFC;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x589E;&#x7F16;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C55;&#x793A;&#x7531;&#x7B28;&#x91CD;&#x82EF;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;&#x5F02;&#x4EAE;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x7559;&#x7684;&#x66F4;&#x6362;&#x4E5F;&#x5BFC;&#x81F4;&#x589E;&#x52A0;&#x6C2F;&#x79BB;&#x5B50;&#x7535;&#x5BFC;&#x6697;&#x793A;&#x758F;&#x6C34;&#x6027;&#x6BDB;&#x5B54;&#x4E0D;&#x552F;&#x4E00;&#x7684;&#x51B3;&#x5B9A;&#x56E0;&#x7D20;&#x4E3A;&#x7EF4;&#x62A4;&#x901A;&#x9053;&#x6297;&#x6E17;&#x6027;&#x3002;&#x76F8;&#x53CD;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x4E09;&#x4EF7;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50; Al(3+) &#x819C;&#x5B75;&#x5316;&#x663E;&#x8457;&#x589E;&#x52A0; Cl(-) &#x8FD0;&#x8F93;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x56F4;&#x7ED5; SecY &#x5B54;&#x9699;&#x91CD;&#x5934;&#x620F;&#xFF0C;&#x8868;&#x9762;&#x7535;&#x8377;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x7684;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; SecY &#x901A;&#x9053;&#x4E0A;&#x91CD;&#x8981;&#x4F5C;&#x7528;&#x6C2F;&#x79BB;&#x5B50;&#x7535;&#x5BFC;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x3002;

SecY &#x5B54;&#x9699;&#x7A81;&#x53D8;&#x548C;&#x4E09;&#x4EF7;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053;&#x6E17;&#x900F;&#x7387;&#x7684;&#x8C03;&#x8282;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

The SecY channel serves to transport proteins across the bacterial inner membrane. The closed channel is impermeable to small molecules by means of a plug domain and a hydrophobic pore, consisting of six conserved isoleucine residues. The substitution of these isoleucines by asparagine leads to the selective conductance of small monovalent anions, especially chloride. In this addendum, we show that replacement of the isoleucine residues by bulky phenylalanine also leads to an increased chloride conductance, suggesting that hydrophobicity of the pore is not the sole determinant for maintaining channel impermeability. Instead, incubation of the membrane with the trivalent cation Al(3+) dramatically increases Cl(-) transport across the wild type SecY channel, suggesting that surface charge density around the SecY pore plays a significant role during the process of chloride conductance.

Modulation of the SecY channel permeability by pore mutations and trivalent cations.

Le canal de SecY sert pour le transport des prot&eacute;ines &agrave; travers la membrane int&eacute;rieure bact&eacute;rienne. La cha&icirc;ne ferm&eacute;e est imperm&eacute;able aux petites mol&eacute;cules au moyen d&#39;un domaine de fiche et un pore hydrophobe, consistant en six r&eacute;sidus conserv&eacute;s isoleucine. La substitution de ces isoleucines par l&#39;asparagine m&egrave;ne &agrave; la conductance s&eacute;lective des petites anions monovalents, en particulier de chlorure. Dans cet addenda, nous montrons que remplacement des r&eacute;sidus de ph&eacute;nylalanine encombrant isoleucine m&egrave;ne aussi &agrave; une conductance de chlorure accrue, ce qui sugg&egrave;re que l&#39;hydrophobicit&eacute; du pore n&#39;est pas le seul facteur d&eacute;terminant pour conserver l&#39;imperm&eacute;abilit&eacute; du canal. Au lieu de cela, l&#39;incubation de la membrane avec le cation trivalent Al(3+) augmente de fa&ccedil;on spectaculaire Cl(-) transport outre-manche type sauvage SecY, sugg&eacute;rant cette densit&eacute; de charge superficielle autour le SecY pore joue un r&ocirc;le important pendant le processus de la conductance de chlorure.

Modulation de la perm&eacute;abilit&eacute; du canal SecY de mutations de pores et de cations trivalents.

SecY-Kanal dient zum transport von Proteinen durch die bakterielle innere Membran. Der geschlossene Kanal ist undurchl&auml;ssig f&uuml;r kleine Molek&uuml;le mittels einer Stecker-Dom&auml;ne und einer hydrophoben Pore, bestehend aus sechs konservierten Isoleucin R&uuml;ckst&auml;nde. Die Substitution von diesen Isoleucines von Asparagin f&uuml;hrt zu den selektiven Leitwert von kleinen monovalenten Anionen, insbesondere Chlorid. In diesem Zusatzvertrag zeigen wir, dass Ersatz der Isoleucin R&uuml;ckst&auml;nde von sperrigen Phenylalanin f&uuml;hrt auch zu eine erh&ouml;hte Chlorid Leitwert, darauf hindeutet, dass Hydrophobie der Pore nicht die alleinige Determinante f&uuml;r die Aufrechterhaltung der Kanal dicht ist. Stattdessen steigen Bebr&uuml;tung der Membran mit dem dreiwertiges kation Al(3+) Cl(-) Transport &uuml;ber den Wildtyp-SecY-Kanal, was darauf hindeutet, dass Oberfl&auml;chendichte kostenlos rund um die SecY Pore spielt eine wichtige Rolle w&auml;hrend des Prozesses der Chlorid-Leitwert.

Modulation der SecY Kanal Durchl&auml;ssigkeit von Pore Mutationen und dreiwertiger kationen.

Il canale SecY serve a proteine di trasporto attraverso la membrana interna batterica. Il canale chiuso &egrave; impermeabile a piccole molecole mediante un dominio di spina e un poro idrofobo, composto da sei residui conservati isoleucina. La sostituzione di questi isoleucines da asparagina conduce alla conduttanza selettiva di piccoli anioni monovalenti, specialmente cloruro. In questo addendum, mostriamo che la sostituzione dei residui da ingombrante fenilalanina isoleucina porta anche a una conduttanza maggiore cloruro, suggerendo che l&#39;idrofobicit&agrave; del poro non &egrave; il solo determinante per mantenere l&#39;impermeabilit&agrave; del canale. Invece, incubazione della membrana con il catione trivalente Al(3+) aumenta drammaticamente Cl(-) trasporto attraverso il canale di SecY wild type, suggerendo che densit&agrave; di carica superficiale intorno la SecY poro gioca un ruolo significativo durante il processo di conduttanza di cloruro.

Modulazione della permeabilit&agrave; canale SecY poro mutazioni e cationi trivalenti.

SecY &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x7D30;&#x83CC;&#x5185;&#x819C;&#x3092;&#x8D8A;&#x3048;&#x3066;&#x8F38;&#x9001;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9589;&#x3058;&#x305F;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x304C;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B0; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;&#x516D;&#x3064;&#x306E;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A4;&#x30BD;&#x30ED;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x304B;&#x3089;&#x6210;&#x308B;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x5B54;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5C0F;&#x5206;&#x5B50;&#x3092;&#x900F;&#x904E;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E; isoleucines &#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30A2;&#x30B9;&#x30D1;&#x30E9;&#x30AE;&#x30F3;&#x306E;&#x7F6E;&#x63DB;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A; 1 &#x4FA1;&#x9670;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;, &#x7279;&#x306B;&#x5869;&#x5316;&#x7269;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x7684;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092;&#x30EA;&#x30FC;&#x30C9;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x88DC;&#x907A;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x3082;&#x306E;&#x304B;&#x3055;&#x3070;&#x308B;&#x30D5;&#x30A7;&#x30CB;&#x30EB;&#x30A2;&#x30E9;&#x30CB;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30A4;&#x30BD;&#x30ED;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x7559;&#x306E;&#x4EA4;&#x63DB;&#x3001;&#x5897;&#x52A0;&#x5869;&#x5316;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x308B;&#x3068;&#x30DD;&#x30A2;&#x306E;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x4E0D;&#x900F;&#x6C34;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x552F;&#x4E00;&#x306E;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x8981;&#x56E0;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4EE3;&#x308F;&#x308A;&#x306B;&#x3001;&#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30E5;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F; 3 &#x4FA1;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3; Al(3+) &#x819C;&#x306E;&#x5287;&#x7684;&#x306B; Cl(-) &#x8F38;&#x9001;&#x305D;&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x96FB;&#x8377;&#x5BC6;&#x5EA6; SecY &#x7D30;&#x5B54;&#x6F14;&#x5287;&#x306E;&#x5468;&#x308A;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3001;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; SecY &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3092;&#x8D8A;&#x3048;&#x3066;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x5869;&#x5316;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x4E2D;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x7D30;&#x5B54;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x3068; 3 &#x4FA1;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B; SecY &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x900F;&#x904E;&#x6027;&#x306E;&#x5909;&#x8ABF;&#x3002;

Cardiolipin &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC544;&#xC640; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544;&#xC758; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC808;&#xC57D; &#xB0B4; &#xBA74; &#xB9C9;&#xC758; &#xD56D;&#xC0C1; &#xC788;&#xB294; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAD6C;&#xC870;&#xB294; &#xBCC0;&#xC870;&#xC640;&#xB294; bilayer&#xC758; &#xC5ED; &#xB3D9;&#xC740; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC640; &#xAC19;&#xC774; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAC70;&#xC8FC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC5D0; &#xBBF8;&#xCE58;&#xB294; &#xC601;&#xD5A5;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; cardiolipin &#xB098; &#xB780;, &#xD65C;&#xB3D9;, &#xBC0F; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC804; &#xAE30;&#xACC4;&#xC758; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;&#xC5D0; &#xACB0;&#xACFC; &#xBD84;&#xC11D;. Cardiolipin &#xADF8;&#xB7EC;&#xC790; &#xADF8;&#xAC83; &#xC548;&#xC815;&#xD654;&#xB97C; dimer SecA Atpase&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC11C;&#xD53C;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558; &#xACE0; ATP &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xC790;&#xADF9; SecYEG &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xCC44;&#xB110; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD558; &#xACE0; &#xAE34;&#xBC00; &#xD558; &#xAC8C; &#xC5F0;&#xACB0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xBBF8;&#xCE58;&#xB294; &#xC601;&#xD5A5; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xB2E8;&#xC9C0;&#xC758; subcellular &#xBC30;&#xD3EC; &#xB9C9; cardiolipin &#xB0B4;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC218;&#xC815; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD568;&#xAED8;, &#xACB0;&#xACFC; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC758;&#xC874; &#xBC18;&#xC751;&#xC758; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD55C; &#xBC94;&#xC704;&#xC640; &#xAD00;&#xB828;&#xC774; &#xC788;&#xC744; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC778;&#xB2E4; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xAD50;&#xD1B5; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD558; &#xACE0;, &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8; &#xD589;&#xB3D9;&#xC73C;&#xB85C; &#xD76C;&#xADC0; &#xD558; &#xACE0; &#xD3EC;&#xAD04;&#xC801;&#xC778; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5;.

&#xC138;&#xADE0; translocon&#xC5D0; cardiolipin&#xC758; &#xD589;&#xB3D9;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#x5FC3;&#x78F7;&#x8102;&#x662F;&#x8282;&#x80FD;&#x6280;&#x672F;&#x5185;&#x7684;&#x7EC6;&#x83CC;&#x548C;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x819C;&#x7684;&#x864E;&#x89C6;&#x7708;&#x7708;&#x7684;&#x7EC4;&#x6210;&#x90E8;&#x5206;&#x3002;&#x5176;&#x8C03;&#x5236;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x53CC;&#x5C42;&#x7684;&#x6D3B;&#x529B;&#x6240;&#x793A;&#x7684;&#x4E00;&#x4E9B;&#x7814;&#x7A76;&#x5DF2;&#x5F71;&#x54CD;&#x5176;&#x9A7B;&#x5730;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x6D3B;&#x6027;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x5206;&#x6790;&#x5FC3;&#x78F7;&#x8102;&#x5BF9;&#x6784;&#x8C61;&#x3001; &#x6D3B;&#x52A8;&#x548C;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6613;&#x4F4D;&#x673A;&#x68B0;&#x9020;&#x6210;&#x7684;&#x540E;&#x679C;&#x3002;&#x5FC3;&#x78F7;&#x8102;&#x7D27;&#x7D27;&#x8054; SecYEG &#x86CB;&#x767D;&#x901A;&#x9053;&#x590D;&#x6742;&#xFF0C;&#x4E8E;&#x662F;&#x5B83;&#x7A33;&#x5B9A;&#x4E8C;&#x805A;&#x4F53;&#x3001; &#x8D5B;&#x5EB7; ATPase&#xFF0C;&#x4E3A;&#x521B;&#x5EFA;&#x4E00;&#x4E2A;&#x9AD8;&#x7684;&#x4EB2;&#x548C;&#x6027;&#x7ED3;&#x5408;&#x9762;&#x548C;&#x523A;&#x6FC0; ATP &#x6C34;&#x89E3;&#x3002;&#x9664;&#x4E86;&#x5BF9;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#xFF0C;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x4E9A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x5E03;&#x88AB;&#x4FEE;&#x6539;&#x5FC3;&#x78F7;&#x8102;&#x542B;&#x91CF;&#x7684;&#x819C;&#x3002;&#x5728;&#x4E00;&#x8D77;&#xFF0C;&#x7ED3;&#x679C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7F55;&#x89C1;&#x548C;&#x5168;&#x9762;&#x7684;&#x89C1;&#x89E3;&#x770B;&#x6765;&#x662F;&#x6709;&#x5173;&#x7684;&#x8303;&#x56F4;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7684;&#x80FD;&#x6E90;&#x4F9D;&#x8D56;&#x578B;&#x53CD;&#x5E94;&#x53D1;&#x751F;&#x5728;&#x819C;&#x7684;&#x78F7;&#x8102;&#x4E0A;&#x590D;&#x6742;&#xFF0C;&#x57FA;&#x672C;&#x8FD0;&#x8F93;&#x884C;&#x52A8;&#x3002;

&#x5FC3;&#x78F7;&#x8102;&#x5BF9;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7684; translocon &#x64CD;&#x4F5C;&#x3002;

Cardiolipin is an ever-present component of the energy-conserving inner membranes of bacteria and mitochondria. Its modulation of the structure and dynamism of the bilayer impacts on the activity of their resident proteins, as a number of studies have shown. Here we analyze the consequences cardiolipin has on the conformation, activity, and localization of the protein translocation machinery. Cardiolipin tightly associates with the SecYEG protein channel complex, whereupon it stabilizes the dimer, creates a high-affinity binding surface for the SecA ATPase, and stimulates ATP hydrolysis. In addition to the effects on the structure and function, the subcellular distribution of the complex is modified by the cardiolipin content of the membrane. Together, the results provide rare and comprehensive insights into the action of a phospholipid on an essential transport complex, which appears to be relevant to a broad range of energy-dependent reactions occurring at membranes.

The action of cardiolipin on the bacterial translocon.

Cardiolipine est une composante omnipr&eacute;sente des membranes internes des mitochondries et des bact&eacute;ries, &eacute;conomes en &eacute;nergie. Sa modulation de la structure et le dynamisme de la bicouche impact sur l&#39;activit&eacute; de leurs prot&eacute;ines r&eacute;sidents, comme un certain nombre d&#39;&eacute;tudes ont montr&eacute;. Ici, nous analysons les cons&eacute;quences cardiolipine a sur la conformation, l&#39;activit&eacute; et la localisation de la machinerie de translocation des prot&eacute;ines. Cardiolipine associe &eacute;troitement la cha&icirc;ne de prot&eacute;ine de SecYEG complexe, apr&egrave;s quoi il stabilise le dim&egrave;re, cr&eacute;e une surface de liaison de haute affinit&eacute; pour l&#39;ATPase de SecA et stimule l&#39;hydrolyse de l&#39;ATP. Outre les effets sur la structure et la fonction, la distribution subcellulaire du complexe modifie le contenu de la cardiolipine de la membrane. Ensemble, les r&eacute;sultats donnent un aper&ccedil;u rare et complet dans l&#39;action d&#39;un phospholipide sur une essentielle de transport complexe, qui semble &ecirc;tre pertinent &agrave; une vaste gamme de r&eacute;actions d&eacute;pendant de l&#39;&eacute;nergie qui se produisent &agrave; membranes.

L&#39;action de la cardiolipine sur le translocon bact&eacute;rienne.

Cardiolipin ist eine allgegenw&auml;rtige Komponente der energiesparende inneren Membranen von Bakterien und Mitochondrien. Die Modulation der Struktur und Dynamik der Bilayer hat Auswirkungen auf die Aktivit&auml;t ihrer resident Proteine, wie eine Reihe von Studien gezeigt haben. Hier analysieren wir die Folgen, die Cardiolipin auf die Konformation, Aktivit&auml;t und Lokalisierung der Protein Translokation Maschine hat. Cardiolipin verbindet eng mit dem SecYEG-Protein-Channel, der Komplex, woraufhin es die Dimer stabilisiert, eine Oberfl&auml;che mit hoher Affinit&auml;t binden f&uuml;r die SecA schafft ATPase und stimuliert die ATP-Hydrolyse. Neben den Auswirkungen auf die Struktur und Funktion ist die subzellul&auml;re Verteilung des Komplexes von Cardiolipin Inhalt der Membran ge&auml;ndert. Gemeinsam bieten die Ergebnisse selten und umfassende Einblicke in die Handlung der ein Phospholipid Verkehrsausschusses ein wesentlich komplexer, was f&uuml;r eine breite Palette von Energie-abh&auml;ngige Reaktionen auf Membranen relevant zu sein scheint.

Die Aktion von Cardiolipin auf die bakterielle Translokon.

Cardiolipina &egrave; un componente immancabile delle membrane interne risparmio energetico dei batteri e nei mitocondri. La modulazione della struttura e il dinamismo del doppio strato impatti sull&#39;attivit&agrave; delle loro proteine residenti, come un certo numero di studi hanno dimostrato. Qui analizziamo le conseguenze cardiolipina ha la conformazione, attivit&agrave; e localizzazione dei macchinari di traslocazione di proteine. Cardiolipina associa strettamente con il canale di SecYEG protein complex, dopodich&eacute; stabilizza il dimero, crea una superficie ad alta affinit&agrave; di legame per l&#39;atpasi SecA e stimola l&#39;idrolisi dell&#39;ATP. Oltre agli effetti sulla struttura e funzione, la distribuzione subcellulare del complesso viene modificata dal contenuto cardiolipina della membrana. Insieme, i risultati forniscono approfondimenti rare e complete l&#39;azione di un fosfolipide su un trasporto essenziale complesso, che sembra essere rilevante per una vasta gamma di reazioni di energia-dipendente che si verificano a membrane.

L&#39;azione di cardiolipina sul translocon batterica.

&#x30AB;&#x30EB;&#x30B8;&#x30AA;&#x30EA;&#x30D4;&#x30F3;&#x7D30;&#x83CC;&#x3084;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x306E;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x7BC0;&#x7D04;&#x306E;&#x5185;&#x5074;&#x306E;&#x819C;&#x306F;&#x3001;&#x5E38;&#x306B;&#x5B58;&#x5728;&#x3059;&#x308B;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x6570;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x305D;&#x306E;&#x5909;&#x8ABF;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x4E8C;&#x91CD;&#x819C;&#x306E;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30BA;&#x30E0;&#x305D;&#x306E;&#x5C45;&#x4F4F;&#x8005;&#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B8;&#x30AA;&#x30EA;&#x30D4;&#x30F3; &#x30B3;&#x30F3;&#x30DB;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3001;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D3;&#x30C6;&#x30A3;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x8F38;&#x9001;&#x88C5;&#x7F6E;&#x306E;&#x5C40;&#x5728;&#x306B;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x5206;&#x6790;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x30C0;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3092;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x3001;&#x9AD8;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x7D50;&#x5408;&#x8868;&#x9762;&#x30BB;&#x30AB; ATPase &#x3092;&#x4F5C;&#x6210;&#x3057;&#x3001;ATP &#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x53CD;&#x5FDC;&#x3092;&#x523A;&#x6FC0;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3059;&#x3050;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B8;&#x30AA;&#x30EA;&#x30D4;&#x30F3;&#x306F;&#x3057;&#x3063;&#x304B;&#x308A;&#x3068;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x306E;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3092;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x306B;&#x52A0;&#x3048;&#x3066;&#x3001;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x5206;&#x819C;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B8;&#x30AA;&#x30EA;&#x30D4;&#x30F3; &#x30B3;&#x30F3;&#x30C6;&#x30F3;&#x30C4;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5909;&#x66F4;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x3001;&#x7D50;&#x679C;&#x819C;&#x3067;&#x8D77;&#x3053;&#x308B;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x4F9D;&#x5B58;&#x578B;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306E;&#x5E83;&#x3044;&#x7BC4;&#x56F2;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30A2;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x672C;&#x8CEA;&#x7684;&#x306A;&#x8F38;&#x9001;&#x306B;&#x8907;&#x96D1;&#x3067;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x307E;&#x308C;&#x306A;&#x3001;&#x5305;&#x62EC;&#x7684;&#x306A;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x7D30;&#x83CC;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30ED;&#x30B3;&#x30F3;&#x4E0A;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B8;&#x30AA;&#x30EA;&#x30D4;&#x30F3;&#x306E;&#x30A2;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3002;

Cardiolipina es un componente siempre presente de las membranas internas de conservaci&oacute;n de energ&iacute;a de las bacterias y las mitocondrias. Su modulaci&oacute;n de la estructura y el dinamismo de la bicapa impacta en la actividad de sus prote&iacute;nas residentes, como han demostrado varios estudios. Aqu&iacute; analizamos las consecuencias cardiolipina tiene en la conformaci&oacute;n, actividad y localizaci&oacute;n de la maquinaria de translocaci&oacute;n de la prote&iacute;na. Cardiolipina estrechamente asociados con el canal de la prote&iacute;na de SecYEG complejo, con lo cual estabiliza el d&iacute;mero, crea una superficie de uni&oacute;n de alta afinidad para la ATPasa de SecA y estimula la hidr&oacute;lisis de ATP. Adem&aacute;s de los efectos sobre la estructura y funci&oacute;n, se modifica la distribuci&oacute;n subcelular del complejo por el contenido de cardiolipina de la membrana. En conjunto, los resultados proporcionan ideas raras y completas en la acci&oacute;n de un fosfol&iacute;pido en un complejo de transporte esencial que parece ser relevante para una amplia gama de las reacciones dependientes de energ&iacute;a que ocurre en las membranas.

La acci&oacute;n de cardiolipina en el translocon bacteriana.

&#x4E00;&#x4F53;&#x5F0F;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x90FD;&#x5F88;&#x96BE;&#x4E0E;&#x751F;&#x5316;&#x9274;&#x4E8E;&#x5176;&#x4E0D;&#x6EB6;&#x6027;&#x7684;&#x6027;&#x8D28; &#xFF1B;nanodisc &#x7ED5;&#x8FC7;&#xFF0C;&#x7A33;&#x5B9A;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x7684;&#x8102;&#x8D28;&#x53CC;&#x5C42;&#x5C0F;&#x4FEE;&#x8865;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x4E2D;&#x7684;&#x56F0;&#x96BE;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A; nanodiscs &#x57FA;&#x4E8E; SILAC &#x7684;&#x5B9A;&#x91CF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x5B66;&#x7ED3;&#x5408;&#x53EF;&#x7528;&#x4E8E;&#x6807;&#x8BC6;&#x51E0;&#x4E4E;&#x4EFB;&#x4F55;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x4F19;&#x4F34;&#x3002;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x8BC1;&#x660E;&#x7684;&#x539F;&#x5219;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x8FD0;&#x7528;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7EC6;&#x83CC; SecYEG &#x86CB;&#x767D;&#x8FDB;&#x884C;&#x901A;&#x9053; MalFGK(2) &#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6;&#x519C;&#x7528;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8F66;&#x548C;&#x819C;&#x6574;&#x5408;&#x9176; YidC&#x3002;&#x4E0E;&#x6D17;&#x6DA4;&#x5242;&#x675F;&#xFF0C;&#x5F80;&#x5F80;&#x4F1A;&#x7834;&#x574F;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;nanodisc &#x5F97;&#x4EE5;&#x4ECE;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x6574;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x63D0;&#x53D6;&#x7269;&#x6355;&#x6349;&#x8D5B;&#x5EB7;&#x3001; Syd &#x548C;&#x7537;&#x6027;&#x4E0E;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x7684;&#x4FE1;&#x5FC3;&#x548C;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x3002;&#x65B9;&#x6CD5;&#x662F;&#x4E0D;&#x591F;&#x654F;&#x611F;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x51FD;&#x6570;&#x7684;&#x5149;&#x76D8;&#x548C;&#x6587;&#x5316;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E2D;&#x7684;&#x8102;&#x8D28;&#x6210;&#x5206;&#x5206;&#x79BB;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x975E;&#x540C;&#x5C0F;&#x53EF;&#x3002;&#x4E0E;&#x4EE5;&#x524D;&#x7684;&#x7167;&#x7247;&#x4EA4;&#x53C9;&#x94FE;&#x63A5;&#x5206;&#x6790;&#xFF0C;YidC &#x5E76;&#x6CA1;&#x6709;&#x8868;&#x660E;&#x4EFB;&#x4F55;&#x6E38;&#x79BB;&#x6216;&#x5468;&#x8D28;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x9AD8;&#x4EB2;&#x548C;&#x6027;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E09;&#x4E2A;&#x793A;&#x4F8B;&#x8BF4;&#x660E;&#x7EB3;&#x7C73;&#x8102;&#x8D28;&#x53CC;&#x5C42;&#x786E;&#x5B9A;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x96C6;&#x6210;&#x5728;&#x8102;&#x53CC;&#x5C42;&#x7684;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x7684;&#x5916;&#x56F4;&#x4F19;&#x4F34;&#x7684;&#x5B9E;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x3002;

Nanodiscs &#x548C;&#x57FA;&#x4E8E; SILAC &#x7684;&#x8D28;&#x8C31;&#x6CD5;&#x786E;&#x5B9A;&#x819C;&#x86CB;&#x767D; Interactome&#x3002;

Integral membrane proteins are challenging to work with biochemically given their insoluble nature; the nanodisc circumvents the difficulty by stabilizing them in small patches of lipid bilayer. Here, we show that nanodiscs combined with SILAC-based quantitative proteomics can be used to identify the soluble interacting partners of virtually any membrane protein. As a proof of principle, we applied the method to the bacterial SecYEG protein-conducting channel, the maltose transporter MalFGK(2) and the membrane integrase YidC. In contrast to the detergent micelles, which tend to destabilize interactions, the nanodisc was able to capture out of a complex whole cell extract the proteins SecA, Syd, and MalE with a high degree of confidence and specificity. The method was sensitive enough to isolate these interactors as a function of the lipid composition in the disc and the culture conditions. In agreement with a previous photo-cross linking analysis, YidC did not show any high-affinity interactions with cytosolic or periplasmic proteins. These three examples illustrate the utility of nanoscale lipid bilayers to identify the soluble peripheral partners of proteins intergrated in the lipid bilayer.

Nanodiscs and SILAC-Based Mass Spectrometry to Identify a Membrane Protein Interactome.

Les prot&eacute;ines membranaires intrins&egrave;ques sont difficiles &agrave; travailler avec biochimiquement &eacute;tant donn&eacute; leur nature insoluble ; le nanodisc contourne la difficult&eacute; en stabilisant les en petites parcelles de la bicouche lipidique. Ici, nous montrons que nanodiscs combin&eacute;e &agrave; la prot&eacute;omique quantitative SILAC-bas&eacute; peut servir &agrave; identifier les partenaires qui interagissent solubles de pratiquement n&#39;importe quelle prot&eacute;ine membranaire. Comme une preuve de principe, nous avons appliqu&eacute; la m&eacute;thode sur le canal de conduction prot&eacute;ine bact&eacute;rien SecYEG, le transporteur de maltose MalFGK(2) et de l&#39;int&eacute;grase de membrane YidC. Par contraste avec les micelles de d&eacute;tergents, qui tendent &agrave; d&eacute;stabiliser les interactions, le nanodisc a pu capturer dans un extrait cellulaire complexe des prot&eacute;ines SecA, Syd et m&acirc;le avec un degr&eacute; &eacute;lev&eacute; de confiance et de la sp&eacute;cificit&eacute;. La m&eacute;thode &eacute;tait assez sensible pour isoler ces interacteurs en fonction de la composition des lipides dans le disque et les conditions de culture. En accord avec une pr&eacute;c&eacute;dente analyse de liaison de photo-Croix, YidC n&#39;a pas montr&eacute; les interactions de haute affinit&eacute; avec des prot&eacute;ines cytosoliques ou p&eacute;riplasmiques. Ces trois exemples illustrent l&#39;utilit&eacute; des bicouches lipidiques nanom&eacute;triques pour identifier les partenaires p&eacute;riph&eacute;riques solubles de prot&eacute;ines int&eacute;gr&eacute;s dans la bicouche lipidique.

Nanodiscs et SILAC bas&eacute;e sur la spectrom&eacute;trie de masse pour identifier un Interactome de prot&eacute;ines membranaires.

Integrale Membranproteine sind herausfordernde Arbeit mit biochemisch angesichts ihrer unl&ouml;sliche Natur; die Nanodisc umgeht die Schwierigkeiten von ihnen in kleinen Flecken von Lipid Bilayer zu stabilisieren. Hier zeigen wir, dass Nanodiscs kombiniert mit SILAC-basierte quantitative Proteomik verwendet werden kann, um die l&ouml;slichen interagierenden Partner nahezu jedes Membranprotein zu identifizieren. Als Beweis des Prinzips wir die Methode auf der bakteriellen SecYEG Protein leitenden Kanal angewendet, die Maltose-Transporter MalFGK(2) und die Membran Integrase YidC. Im Gegensatz zu den Sp&uuml;lmittel Mizellen, die tendenziell Interaktionen zu destabilisieren, konnte die Nanodisc aus einem komplexen ganzen Zelle-Extrakt der Proteine, SecA, Syd und M&auml;nnchen mit einem hohen Ma&szlig; an Vertrauen und Spezifit&auml;t erfassen. Die Methode war empfindlich genug, um diese Interaktoren als Funktion der Lipid-Komposition in die Scheibe und die Kulturbedingungen zu isolieren. Im Einvernehmen mit einer fr&uuml;heren Foto-Cross-Link-Analyse zeigte YidC keine hoher Affinit&auml;t Wechselwirkungen mit zellul&auml;ren oder periplasmatischen Proteinen. Diese drei Beispiele verdeutlichen den Nutzen von nanoskaligen Lipid-Doppelschichten um die l&ouml;slichen periphere Partner von Proteinen in der Lipid-Bilayer integriertes zu identifizieren.

Nanodiscs und SILAC-basierte Massenspektrometrie eine Membrane Protein Interaktom zu identifizieren.

Proteine integrali di membrana sono difficili da lavorare con biochimicamente data la loro natura insolubile; il nanodisc aggira la difficolt&agrave; da loro stabilizzazione in piccole chiazze del doppio strato lipidico. Mostriamo qui, che nanodiscs combinato con SILAC-basato proteomica quantitativa pu&ograve; essere utilizzato per identificare il partner interagenti solubile di praticamente qualsiasi proteina di membrana. Come prova di principio, abbiamo applicato il metodo batterico SecYEG protein-conducendo canale, il trasportatore di maltosio MalFGK(2) e la membrana integrase YidC. In contrasto con i detergente micelle, che tendono a destabilizzare le interazioni, il nanodisc &egrave; stato in grado di catturare fuori un Estratto delle cellule intero complesso delle proteine SecA, Syd e maschio con un alto grado di fiducia e di specificit&agrave;. Il metodo &egrave; stato abbastanza sensibile per isolare questi interattori in funzione della composizione lipidica in disco e le condizioni di coltura. D&#39;accordo con un precedente foto-cross linking analisi, YidC non ha mostrato alcun interazioni ad alta affinit&agrave; con le proteine citosoliche o periplasmica. Questi tre esempi illustrano l&#39;utilit&agrave; della nanoscala lipidici per identificare i partner solubili periferici delle proteine integrate nel doppio strato lipidico.

Nanodiscs e SILAC-basa la spettrometria di massa per identificare un Interactome di proteine di membrana.

&#x7A4D;&#x5206;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;&#x4E0D;&#x6EB6;&#x6027;&#x306E;&#x6027;&#x8CEA;&#x3092;&#x8003;&#x3048;&#x308B;&#x4F5C;&#x696D;&#x306B;&#x6311;&#x6226;&#x3057;&#x3066;;&#x30CA;&#x30CE;&#x30C7;&#x30A3;&#x30B9;&#x30AF;&#x306E;&#x78C1;&#x6027;&#x8102;&#x8CEA;&#x4E8C;&#x5206;&#x5B50;&#x819C;&#x306E;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x30D1;&#x30C3;&#x30C1;&#x3067;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x96E3;&#x3057;&#x3055;&#x3092;&#x56DE;&#x907F;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x4E8B;&#x5B9F;&#x4E0A;&#x3042;&#x3089;&#x3086;&#x308B;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30CA;&#x30FC;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B; SILAC &#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30AA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x3068;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x305F; nanodiscs &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x539F;&#x5247;&#x306E;&#x8A3C;&#x62E0;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x306F;&#x3001;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC; MalFGK(2) &#x3068;&#x819C;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30B0;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; YidC &#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9; &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x304C;&#x7D30;&#x83CC;&#x819C;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3092;&#x9069;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4E0D;&#x5B89;&#x5B9A;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x50BE;&#x5411;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x3001;&#x6D17;&#x5264;&#x306E;&#x30DF;&#x30BB;&#x30EB;&#x3068;&#x5BFE;&#x7167;&#x3092;&#x306A;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30CA;&#x30CE;&#x30C7;&#x30A3;&#x30B9;&#x30AF;&#x306E;&#x78C1;&#x6027;&#x304B;&#x3089;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x5168;&#x4F53;&#x30BB;&#x30EB;&#x62BD;&#x51FA;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; SecA&#x3001;&#x30B7;&#x30C9;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x7537;&#x6027;&#x81EA;&#x4FE1;&#x3068;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x5B66;&#x4F4D;&#x3092;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30C1;&#x30E3;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x305F;&#x3002;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x30C7;&#x30A3;&#x30B9;&#x30AF;&#x3068;&#x57F9;&#x990A;&#x6761;&#x4EF6;&#x306E;&#x8102;&#x8CEA;&#x7D44;&#x6210;&#x306E;&#x95A2;&#x6570;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5341;&#x5206;&#x654F;&#x611F;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x5199;&#x771F;&#x30AF;&#x30ED;&#x30B9; &#x30EA;&#x30F3;&#x30AF;&#x5206;&#x6790;&#x3068;&#x306E;&#x5951;&#x7D04; YidC &#x4EFB;&#x610F;&#x30BE;&#x30EB;&#x6027;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30DA;&#x30EA;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30E0;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x9AD8;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x793A;&#x3055;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30CA;&#x30CE;&#x30B9;&#x30B1;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E;&#x8102;&#x8CEA;&#x4E8C;&#x91CD;&#x819C;&#x306E;&#x8102;&#x8CEA;&#x4E8C;&#x91CD;&#x819C;&#x306B;&#x7D71;&#x5408;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x672B;&#x68A2;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30CA;&#x30FC;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30E6;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30EA;&#x30C6;&#x30A3;&#x306F;&#x3053;&#x308C;&#x3089; 3 &#x3064;&#x306E;&#x4F8B;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

Nanodiscs &#x3068; SILAC &#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30FC;&#x30E0;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xD1B5;&#xD569; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD654;&#xD559;&#xC801; &#xD2B9;&#xC131;&#xC0C1; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xBD88;&#xC6A9; &#xC131;; &#xC791;&#xC5C5;&#xD560; &#xB3C4;&#xC804; nanodisc &#xC9C0;&#xC9C8; bilayer&#xC758; &#xC791;&#xC740; &#xD328;&#xCE58;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC548;&#xC815;&#xD654; &#xD568;&#xC73C;&#xB85C;&#xC368; &#xC5B4;&#xB824;&#xC6C0;&#xC744; &#xD53C;&#xD560;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; nanodiscs &#xB2E8;&#xAE30; &#xAE30;&#xBC18; &#xC591;&#xC801; proteomics&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xAC70;&#xC758; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC6A9; &#xD574; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD30C;&#xD2B8;&#xB108;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6D0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC99D;&#xAC70;&#xB85C; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC801;&#xC6A9;&#xD560; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC; &#xC138;&#xADE0; SecYEG &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC2E4;&#xC2DC; &#xCC44;&#xB110; &#x82BD; &#xC804;&#xC1A1; MalFGK(2) &#xACE0; &#xB9C9; integrase YidC. &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xBD88;&#xC548;&#xC815; &#xD558; &#xAC8C; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xD5A5;&#xC774; &#xC138;&#xC81C; micelles &#xB2EC;&#xB9AC;&#xB294; nanodisc &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; SecA, &#xC2DC;&#xB4DC;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC2E0;&#xB8B0;&#xC640; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xD559;&#xC704;&#xB97C; &#xAC00;&#xC9C4; &#xB0A8;&#xC131; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC804;&#xCCB4; &#xC138;&#xD3EC; &#xCD94;&#xCD9C; &#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCEA1;&#xCC98;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB294; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC778;&#xD130; &#xB514;&#xC2A4;&#xD06C; &#xBB38;&#xD654; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xC870;&#xC131;&#xC758; &#xD568;&#xC218;&#xB85C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xD558;&#xB294; &#xC911;&#xC694; &#xD55C;. &#xC774;&#xC804; &#xC0AC;&#xC9C4;-&#xD06C;&#xB85C;&#xC2A4; &#xB9C1;&#xD06C; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744;&#xC640; Yidc&#xB294; &#xC5B4;&#xB5A4; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; cytosolic &#xB610;&#xB294; periplasmic &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC558;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC608; &#xD1B5;&#xD569;&#xB41C;&#xC5D0; &#xC9C0;&#xC9C8; bilayer &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC6A9; &#xD574; &#xC8FC;&#xBCC0; &#xD30C;&#xD2B8;&#xB108;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xB098;&#xB178; &#xC9C0;&#xC9C8; bilayers &#xC720;&#xD2F8;&#xB9AC;&#xD2F0;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Nanodiscs &#xBC0F; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xB2E8;&#xAE30; &#xAE30;&#xBC18; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC704;&#xD558;&#xC5EC; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Prote&iacute;nas de membrana integral est&aacute;n desafiando a trabajar con bioqu&iacute;micamente, dada su naturaleza insoluble; el nanodisc evita la dificultad les estabilizando en peque&ntilde;os parches de la bicapa lip&iacute;dica. A continuaci&oacute;n, os mostramos que nanodiscs combinado con prote&oacute;mica cuantitativa basadas en el est&aacute;ndar puede utilizarse para identificar a los socios interact&uacute;an solubles de pr&aacute;cticamente cualquier prote&iacute;na de membrana. Como una prueba del principio, aplicamos el m&eacute;todo en el canal de prote&iacute;na-realizaci&oacute;n de SecYEG bacteriano, el transportador de maltosa MalFGK(2) y la integrasa de membrana YidC. A diferencia de las micelas de detergentes, que tienden a desestabilizar las interacciones, la nanodisc fue capaz de captar de un extracto de c&eacute;lulas enteras complejo las prote&iacute;nas SecA, Syd y hombre con un alto grado de confianza y especificidad. El m&eacute;todo era lo suficientemente sensible para aislar a estos interactianos en funci&oacute;n de la composici&oacute;n de l&iacute;pidos en el disco y las condiciones de cultivo. De acuerdo con un an&aacute;lisis previo de enlace de foto-Cruz, YidC no mostraron ninguna interacci&oacute;n de alta afinidad con prote&iacute;nas citos&oacute;licas o periplasmic. Estos tres ejemplos ilustran la utilidad de bicapas lip&iacute;dicas de nanoescala para identificar a los socios perif&eacute;ricos solubles de prote&iacute;nas integrados en la bicapa lip&iacute;dica.

Nanodiscs y espectrometr&iacute;a de masas basadas en el est&aacute;ndar para identificar un interactoma de prote&iacute;nas de membrana.

MalFGK(2)&#xFF0C;&#x7537;&#xFF0C;&#x57FA;&#x8D28;&#x86CB;&#x767D;&#x4E0E;&#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6;&#x519C;&#x7528;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8F66;&#x662F; best-characterized &#x7684; ABC &#x8F6C;&#x8FD0;&#x86CB;&#x767D;&#x4E4B;&#x4E00;&#x3002;&#x5728;&#x5E38;&#x89C4;&#x7684;&#x6A21;&#x578B;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x7537;&#x6027;&#x6355;&#x83B7;&#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6;&#x5728; periplasm &#x4E2D;&#x7684;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5C06;&#x7CD6;&#x9012;&#x4EA4;&#x5230;&#x519C;&#x7528;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8F66;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7528; nanodiscs &#x548C; proteoliposomes&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53CD;&#x800C;&#x627E;&#x5230;&#x7684;&#x7537;&#x6027;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4E0E;&#x9AD8;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x5230; MalFGK2 &#x4EE5;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x7CD6;&#x7684;&#x6536;&#x8D2D;&#x3002;&#x5F53;&#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6;&#x6D53;&#x5EA6;&#x8D85;&#x8FC7;&#x8FD0;&#x8F93;&#x80FD;&#x529B;&#x65F6;&#xFF0C;&#x7537;&#x6027;&#x6355;&#x83B7;&#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6;&#x548C;&#x52A0;&#x5165;&#x4ECE;&#x519C;&#x7528;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8F66;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E00;&#x673A;&#x5236;&#x89E3;&#x91CA;&#x4E86;&#x4E3A;&#x4EC0;&#x4E48;&#x8FD0;&#x8F93;&#x7387;&#x662F;&#x9AD8;&#x5F53;&#x7537;&#x6027;&#x6709;&#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6;&#x3001; &#x4F4E;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x548C;&#x4F4E;&#x65F6;&#x7537;&#x6027;&#x5177;&#x6709;&#x9AD8;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x7684;&#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6;&#x3002;&#x519C;&#x7528;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8F66;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7537;&#x6027;&#x4FBF;&#x5229;&#x5728;&#x4F4E;&#x6D53;&#x5EA6;&#x7CD6;&#x6536;&#x8D2D;&#x4F46;&#x8FD8;&#x6355;&#x83B7;&#x5E76;&#x52A0;&#x5165;&#x4ECE;&#x8FC7;&#x53BB;&#x7684;&#x9608;&#x503C;&#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6;&#x6D53;&#x5EA6;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x3002;&#x5728;&#x4F53;&#x5185;&#xFF0C;&#x6B64;&#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6;&#x88AB;&#x8FEB;&#x79BB;&#x89E3;&#x9650;&#x5236;&#x8FD0;&#x8F93;&#x7684;&#x901F;&#x5EA6;&#x3002;&#x9274;&#x4E8E;&#x57FA;&#x8D28;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x517B;&#x62A4;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6A21;&#x5F0F;&#x7684;&#x53D8;&#x6784;&#x8C03;&#x8282;&#x53EF;&#x80FD;&#x666E;&#x904D;&#x4E3A; ABC &#x8FDB;&#x53E3;&#x5546;&#x3002;

&#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6; ABC &#x8F6C;&#x8FD0;&#x86CB;&#x767D; MalFGK2 &#x7684;&#x81EA;&#x52A8;&#x8C03;&#x8282;&#x673A;&#x5236;&#x7684;&#x53D1;&#x73B0;&#x3002;

The maltose transporter MalFGK(2), together with the substrate-binding protein MalE, is one of the best-characterized ABC transporters. In the conventional model, MalE captures maltose in the periplasm and delivers the sugar to the transporter. Here, using nanodiscs and proteoliposomes, we instead find that MalE is bound with high-affinity to MalFGK2 to facilitate the acquisition of the sugar. When the maltose concentration exceeds the transport capacity, MalE captures maltose and dissociates from the transporter. This mechanism explains why the transport rate is high when MalE has low affinity for maltose, and low when MalE has high affinity for maltose. Transporter-bound MalE facilitates the acquisition of the sugar at low concentrations, but also captures and dissociates from the transporter past a threshold maltose concentration. In vivo, this maltose-forced dissociation limits the rate of transport. Given the conservation of the substrate-binding proteins, this mode of allosteric regulation may be universal to ABC importers.

Discovery of an auto-regulation mechanism for the maltose ABC transporter MalFGK2.

Le transporteur de maltose MalFGK(2), ainsi que de la prot&eacute;ine substrat-m&acirc;le, est l&#39;un des transporteurs ABC plus. Dans le mod&egrave;le conventionnel, m&acirc;le capture maltose dans le p&eacute;riplasme et d&eacute;livre le sucre au transporteur. Ici, en utilisant nanodiscs et prot&eacute;oliposomes, trouvons-nous au contraire que le m&acirc;le est li&eacute; avec une haute affinit&eacute; &agrave; MalFGK2 pour faciliter l&#39;acquisition du sucre. Lorsque la concentration de maltose d&eacute;passe la capacit&eacute; de transport, m&acirc;le capture maltose et se dissocie de la transporter. Ce m&eacute;canisme explique pourquoi la vitesse de transport est &eacute;lev&eacute;e quand le m&acirc;le a de faible affinit&eacute; pour le maltose et faible quand le m&acirc;le a une affinit&eacute; &eacute;lev&eacute;e pour le maltose. Transporteur de liaison m&acirc;le facilite l&#39;acquisition du sucre &agrave; de faibles concentrations, mais aussi capture et se dissocie de la transporter au-del&agrave; d&#39;un seuil de concentration de maltose. In vivo, cette dissociation forc&eacute;e maltose limite le taux de transport. Compte tenu de la conservation des prot&eacute;ines de liaison du substrat, ce mode de r&eacute;gulation allost&eacute;rique peut &ecirc;tre universel aux importateurs d&#39;ABC.

D&eacute;couverte d&#39;un m&eacute;canisme d&#39;autor&eacute;gulation pour le transporteur ABC maltose MalFGK2.

Der Maltose-Transporter MalFGK(2), zusammen mit dem Substrat-verbindliches Protein m&auml;nnlich, geh&ouml;rt zu den best-characterized ABC-Transporter. Im konventionellen Modell M&auml;nnchen erfasst Maltose in der Periplasm und liefert den Zucker an den Transporter. Hier mit Nanodiscs und Proteoliposomes, wir stattdessen, dass M&auml;nnchen mit hoher Affinit&auml;t an MalFGK2 gebunden ist, die &Uuml;bernahme des Zuckers zu erleichtern. Wenn die Maltose-Konzentration die Transportkapazit&auml;t &uuml;bersteigt, M&auml;nnchen erfasst Maltose und distanziert von den Transporter. Dieser Mechanismus erkl&auml;rt, warum die Transport-Rate ist beim M&auml;nnchen geringe Affinit&auml;t f&uuml;r Maltose hat hohe und niedrige, beim M&auml;nnchen hohen Affinit&auml;t zu Maltose hat. Transporter gebundene M&auml;nnchen erleichtert die &Uuml;bernahme des Zuckers in niedriger Konzentration, aber auch erfasst und distanziert von den Transporter vorbei an einer Schwelle Maltose-Konzentration. In-vivo, schr&auml;nkt diese Dissoziation Maltose-gezwungen die Rate der. Da die Erhaltung der Substrat-bindende Proteine, kann dieser Modus allosterischer Verordnung an ABC-Importeure universal sein.

Entdeckung eines Selbstregulierung-Mechanismus f&uuml;r die Maltose-ABC-Transporter MalFGK2.

Il trasportatore di maltosio MalFGK(2), insieme con la proteina substrato-maschio, &egrave; uno dei trasportatori ABC best-characterized. Nel modello convenzionale, maschio cattura maltosio nella periplasm e trasporta lo zucchero al trasportatore. Qui, utilizzando nanodiscs e proteoliposomes, troviamo invece che maschio &egrave; associato con alta affinit&agrave; a MalFGK2 per facilitare l&#39;acquisizione dello zucchero. Quando la concentrazione di maltosio supera la capacit&agrave; di trasporto, maschio cattura maltosio e si dissocia dal trasportatore. Questo meccanismo spiega perch&eacute; il tasso di trasporto &egrave; alta quando il maschio ha bassa affinit&agrave; per il maltosio e basso quando il maschio ha alta affinit&agrave; per il maltosio. Transporter-bound maschio facilita l&#39;acquisizione dello zucchero a basse concentrazioni, ma anche cattura e si dissocia da trasportatore del passato una concentrazione di maltosio soglia. In vivo, questa dissociazione forzata maltosio limita la velocit&agrave; di trasporto. Data la conservazione delle proteine substrato-associazione, questa modalit&agrave; di regolazione allosterica pu&ograve; essere universale per gli importatori di ABC.

Scoperta di un meccanismo di auto-regolamentazione per il trasportatore di ABC di maltosio MalFGK2.

&#x57FA;&#x8CEA;&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7537;&#x6027;&#x3001;&#x3068;&#x5171;&#x306B;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC; MalFGK(2)&#x3001;best-characterized &#x306E; ABC &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x4E00;&#x3064;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x5F93;&#x6765;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x7537;&#x6027;&#x304C;&#x30DA;&#x30EA;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30E0; &#x30DE;&#x30EB;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9;&#x3092;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30C1;&#x30E3;&#x3001;&#x7802;&#x7CD6;&#x306B;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;nanodiscs &#x3068;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30AA;&#x30EA;&#x30DD;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x4EE3;&#x308F;&#x308A;&#x306B;&#x7802;&#x7CD6;&#x306E;&#x7372;&#x5F97;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x7537;&#x6027;&#x3068;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x89AA;&#x548C;&#x6027; MalFGK2 &#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x898B;&#x3064;&#x3051;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x8F38;&#x9001;&#x5BB9;&#x91CF;&#x3092;&#x8D85;&#x3048;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x7537;&#x6027;&#x306F;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9;&#x3092;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30C1;&#x30E3;&#x3057;&#x3001;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x304B;&#x3089;&#x5207;&#x308A;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x7537;&#x6027;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x304D;&#x306A;&#x305C;&#x8F38;&#x9001;&#x7387;&#x7537;&#x6027;&#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x4F4E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x304D;&#x306B;&#x30CF;&#x30A4;&#x3068;&#x30ED;&#x30FC;&#x306F;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC; &#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x7537;&#x6027;&#x306F;&#x4F4E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3067;&#x7802;&#x7CD6;&#x306E;&#x53D6;&#x5F97;&#x304C;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3082;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30C1;&#x30E3;&#x3057;&#x3001;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3057;&#x304D;&#x3044;&#x5024;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x904E;&#x53BB;&#x304B;&#x3089;&#x5207;&#x308A;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;In vivo &#x3053;&#x306E;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9;&#x5F37;&#x5236;&#x89E3;&#x96E2;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x306E;&#x901F;&#x5EA6;&#x3092;&#x5236;&#x9650;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x4FDD;&#x5168;&#x3092;&#x8003;&#x3048;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30E2;&#x30FC;&#x30C9;&#x306E;&#x30A2;&#x30ED;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x5236;&#x5FA1; ABC &#x30A4;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306B;&#x30E6;&#x30CB;&#x30D0;&#x30FC;&#x30B5;&#x30EB;&#x304B;&#x3082;&#x3057;&#x308C;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;

&#x30DE;&#x30EB;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9; ABC &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC; MalFGK2 &#x306E;&#x81EA;&#x52D5;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306E;&#x767A;&#x898B;&#x3002;

&#xAE30;&#xD310; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB0A8;&#xC131;, &#xD568;&#xAED8; &#x82BD; &#xC804;&#xC1A1; MalFGK(2), best-characterized ABC &#xC804;&#xC1A1;&#xAE30; &#xC911; &#xD558;&#xB098;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xBAA8;&#xB378;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB0A8;&#xC131; &#x82BD;&#xB294; periplasm&#xC5D0;&#xC11C; &#xCEA1;&#xCC98;&#xD558;&#xACE0; &#xC804;&#xC1A1;&#xC5D0; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xC124;&#xD0D5;. &#xC5EC;&#xAE30;, nanodiscs &#xBC0F; proteoliposomes&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB300;&#xC2E0; &#xCC3E;&#xC744; &#xB0A8;&#xC131; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB418;&#xC5B4; &#xC788;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4;&#xC640; MalFGK2 &#xC124;&#xD0D5;&#xC758; &#xC218;&#xC9D1;&#xC744; &#xCD09;&#xC9C4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD558;&#xC5EC;. &#xC804;&#xC1A1; &#xC6A9;&#xB7C9;&#xC744; &#xCD08;&#xACFC; &#xD558;&#xB294; &#x7CD6; &#xB18D;&#xB3C4; &#xB0A8;&#xC131; &#x82BD; &#xCEA1;&#xCC98;&#xD558;&#xACE0; &#xC804;&#xC1A1;&#xC5D0;&#xC11C; dissociates. &#xC774; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xC774;&#xC720;&#xB97C; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC804;&#xC1A1; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB192;&#xC740; &#xB0A8;&#xC131; &#xB9D0;&#xD1A0;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB0AE;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4;&#xAC00;&#xC9C0;&#xACE0; &#xB54C;&#xC640; &#xB0AE;&#xC740; &#xB54C; &#xB0A8;&#xC131; &#xC544;&#xB2F9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xD558;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4;. &#xC804;&#xC1A1; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB0A8;&#xC131; &#xB0AE;&#xC740; &#xB18D;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC124;&#xD0D5;&#xC758; &#xD68D;&#xB4DD;&#xC744; &#xC6A9;&#xC774; &#xD558; &#xAC8C; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xB610;&#xD55C; &#xCEA1;&#xCC98; &#xBC0F; &#xC784;&#xACC4;&#xAC12; &#x82BD; &#xB18D;&#xB3C4; &#xACFC;&#xAC70; &#xC804;&#xC1A1;&#xC5D0;&#xC11C; dissociates. Vivo&#xC5D0;&#xC11C;&#xC774; &#xC544;&#xB2F9; &#xAC15;&#xC81C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xC804;&#xC1A1; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC81C;&#xD55C;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAE30;&#xD310; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC808;&#xC57D;&#xC744; &#xAC10;&#xC548;&#xD560; &#xB54C;, allosteric &#xADDC;&#xCE59;&#xC758;&#xC774; &#xBAA8;&#xB4DC; &#xBCF4;&#xD3B8;&#xC801;&#xC778; ABC &#xC218;&#xC785; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB9D0;&#xD1A0;&#xC2A4; ABC transporter Malfgk2&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC790;&#xB3D9; &#xC870;&#xC808; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC758; &#xBC1C;&#xACAC;.

El transportador de maltosa MalFGK(2), junto con la prote&iacute;na de uni&oacute;n a sustrato hombre, es uno de los transportadores ABC best-characterized. En el modelo convencional, hombre capta la maltosa en el periplasma y entrega el az&uacute;car al transportador. Aqu&iacute;, usando nanodiscs y proteoliposomes, en su lugar encontramos que el hombre est&aacute; enlazado con alta afinidad a MalFGK2 para facilitar la adquisici&oacute;n del az&uacute;car. Cuando la concentraci&oacute;n de maltosa excede la capacidad de transporte, hombre captura maltosa y se disocia del transportador. Este mecanismo explica por qu&eacute; la tasa de transporte es alta cuando el hombre tiene baja afinidad para la maltosa y baja cuando el hombre tiene alta afinidad para la maltosa. Transportador-limite hombre facilita la adquisici&oacute;n de la az&uacute;car en bajas concentraciones, pero tambi&eacute;n captura y se disocia del transportista m&aacute;s all&aacute; de una concentraci&oacute;n umbral de maltosa. En vivo, esta disociaci&oacute;n maltosa-forzada limita la velocidad de transporte. Teniendo en cuenta la conservaci&oacute;n de las prote&iacute;nas de uni&oacute;n a sustrato, este modo de Regulaci&oacute;n alost&eacute;rica puede ser universal a los importadores de ABC.

Huan Bao

Department of Biochemistry and Molecular Biology

University of British Columbia

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Huan Bao

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Biochemistry and Molecular Biology

University of British Columbia

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Department of Biochemistry and Molecular Biology