Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

University of Washington

Graduate students' views on unionization.

Ma&icirc;trise des vues des &eacute;tudiants sur la syndicalisation.

Laureato opinioni degli studenti sulla sindacalizzazione.

Formation of a water-expelling nonpolar core is the paradigm of protein folding and stability. Although experiment largely confirms this picture, water buried in "hydrophobic" cavities is required for the function of some proteins. Hydration of the protein core has also been suggested as the mechanism of pressure-induced unfolding. We therefore are led to ask whether even the most nonpolar protein core is truly hydrophobic (i.e., water-repelling). To answer this question we probed the hydration of an approximately 160-A(3), highly hydrophobic cavity created by mutation in T4 lysozyme by using high-pressure crystallography and molecular dynamics simulation. We show that application of modest pressure causes approximately four water molecules to enter the cavity while the protein itself remains essentially unchanged. The highly cooperative filling is primarily due to a small change in bulk water activity, which implies that changing solvent conditions or, equivalently, cavity polarity can dramatically affect interior hydration of proteins and thereby influence both protein activity and folding.

Cooperative water filling of a nonpolar protein cavity observed by high-pressure crystallography and simulation.

Formation d&#39;un noyau non polaire-expulsion de l&#39;eau est le paradigme de repliement des prot&eacute;ines et de stabilit&eacute;. Bien que l&#39;exp&eacute;rience confirme largement cette photo, l&#39;eau enterr&eacute; dans des cavit&eacute;s &laquo; hydrophobes &raquo; est requis pour la fonction de certaines prot&eacute;ines. Hydratation du noyau prot&eacute;ique a &eacute;galement &eacute;t&eacute; sugg&eacute;r&eacute;e comme m&eacute;canisme de pression induite par d&eacute;roulement. Par cons&eacute;quent, nous sommes amen&eacute;s &agrave; demander si m&ecirc;me le noyau de prot&eacute;ines plus non polaire est v&eacute;ritablement hydrophobe (c.-&agrave;-d., hydrofuge). Pour r&eacute;pondre &agrave; cette question nous avons sond&eacute; l&#39;hydratation d&#39;un environ 160-A(3), cavit&eacute; tr&egrave;s hydrophobe cr&eacute;&eacute;e par mutation T4 lysozyme &agrave; la cristallographie &agrave; haute pression et simulation de dynamique mol&eacute;culaire. Nous montrons que l&#39;application de pression modeste provoque environ les mol&eacute;cules d&#39;eau quatre entrer dans la cavit&eacute;, alors que la prot&eacute;ine elle-m&ecirc;me restera essentiellement inchang&eacute;e. Le remplissage tr&egrave;s coop&eacute;ratif est principalement attribuable &agrave; un petit changement dans l&#39;activit&eacute; de l&#39;eau en vrac, ce qui implique que le changement de conditions de solvants ou de fa&ccedil;on &eacute;quivalente, polarit&eacute; de la cavit&eacute; peut radicalement int&eacute;rieure hydratation des prot&eacute;ines et ainsi influencer l&#39;activit&eacute; de la prot&eacute;ine et pliage.

Remplissage d&#39;eau coop&eacute;rative d&#39;une cavit&eacute; de prot&eacute;ine non polaire observ&eacute;e par la simulation et la cristallographie &agrave; haute pression.

Formazione di un nucleo non polare ad espellere acqua &egrave; il paradigma del protein folding e stabilit&agrave;. Anche se l&#39;esperimento conferma ampiamente questa foto, acqua seppellito nella cavit&agrave; &quot;idrofobo&quot; &egrave; richiesto per la funzione di alcune proteine. Idratazione del core proteico inoltre &egrave; stato suggerito come il meccanismo di pressione indotta dispiegarsi. Siamo quindi portati a chiedere se anche il core proteico pi&ugrave; polare &egrave; veramente idrofobo (cio&egrave;, acqua-repellente). Per rispondere a questa domanda abbiamo sondato l&#39;idratazione di un circa 160-A(3), altamente idrofobo cavit&agrave; creato dalla mutazione in lisozima T4 tramite cristallografia ad alta pressione e simulazione di dinamica molecolare. Mostriamo che applicazione di modesta pressione provoca circa quattro molecole entrare nella cavit&agrave;, mentre la proteina stessa rimane sostanzialmente invariata. Il materiale da otturazione altamente cooperativo &egrave; principalmente a causa di un piccolo cambiamento nelle attivit&agrave; dell&#39;acqua all&#39;ingrosso, che implica che cambiando condizioni solvente o, equivalentemente, cavit&agrave; polarit&agrave; pu&ograve; influenzare drammaticamente interni idratazione delle proteine e quindi influenzare sia l&#39;attivit&agrave; della proteina che pieghevole.

Riempimento acqua cooperativa di una cavit&agrave; di proteine non polari osservata da simulazione e cristallografia ad alta pressione.

Steric constraints, charged interactions and many other forces important to protein structure and function can be explored by mutagenic experiments. Research of this kind has led to a wealth of knowledge about what stabilizes proteins in their folded states. To gain a more complete picture requires that we perturb these structures in a continuous manner, something mutagenesis cannot achieve. With high pressure crystallographic methods it is now possible to explore the detailed properties of proteins while continuously varying thermodynamic parameters. Here, we detail the structural response of the cavity-containing mutant L99A of T4 lysozyme, as well as its pseudo wild-type (WT*) counterpart, to hydrostatic pressure. Surprisingly, the cavity has almost no effect on the pressure response: virtually the same changes are observed in WT* as in L99A under pressure. The cavity is most rigid, while other regions deform substantially. This implies that while some residues may increase the thermodynamic stability of a protein, they may also be structurally irrelevant. As recently shown, the cavity fills with water at pressures above 100 MPa while retaining its overall size. The resultant picture of the protein is one in which conformationally fluctuating side groups provide a liquid-like environment, but which also contribute to the rigidity of the peptide backbone.

Structural rigidity of a large cavity-containing protein revealed by high-pressure crystallography.

Contraintes st&eacute;riques, charg&eacute; des interactions et nombreuses autres forces importantes &agrave; la fonction et la structure des prot&eacute;ines peuvent &ecirc;tre explor&eacute;es par des exp&eacute;riences de mutag&egrave;nes. Recherche de ce genre a conduit &agrave; une profusion de connaissances sur ce qui stabilise les prot&eacute;ines dans leur &eacute;tat repli&eacute;. Pour obtenir un tableau plus complet exige que nous perturbent ces structures de fa&ccedil;on continue, quelque chose de mutag&eacute;n&egrave;se ne peut atteindre. M&eacute;thodes cristallographiques de haute pression, il est maintenant possible d&#39;explorer les propri&eacute;t&eacute;s d&eacute;taill&eacute;es des prot&eacute;ines tout en variant continuellement les param&egrave;tres thermodynamiques. Ici, nous d&eacute;taillons la r&eacute;ponse structurelle de la cavit&eacute; contenant mutant L99A de T4 lysozyme, ainsi que son pseudo sauvage (WT *) homologue, &agrave; une pression hydrostatique. &Eacute;tonnamment, la cavit&eacute; n&#39;a presque aucun effet sur la r&eacute;ponse de la pression : pratiquement les m&ecirc;mes modifications sont observ&eacute;es chez WT * comme dans L99A sous pression. La cavit&eacute; est plus rigide, tandis que les autres r&eacute;gions se d&eacute;forment sensiblement. Ceci implique que certains r&eacute;sidus peuvent augmenter la stabilit&eacute; thermodynamique d&#39;une prot&eacute;ine, ils peuvent aussi &ecirc;tre structurellement non pertinents. Comme l&#39;a r&eacute;cemment illustr&eacute;, la cavit&eacute; se remplit d&#39;eau &agrave; des pressions sup&eacute;rieures &agrave; 100 MPa, tout en conservant sa taille globale. L&#39;image r&eacute;sultante de la prot&eacute;ine est un dans quels groupes de c&ocirc;t&eacute; conformationnellement fluctuante fournissent un environnement liquide, mais qui contribuent aussi &agrave; la rigidit&eacute; du squelette peptidique.

Rigidit&eacute; de la structure d&#39;une prot&eacute;ine grande cavit&eacute; contenant, r&eacute;v&eacute;l&eacute;e par la cristallographie &agrave; haute pression.

Vincoli sterico, accusato di interazioni e molte altre forze importanti per funzione e struttura della proteina possono essere esplorati da esperimenti mutageni. Ricerca di questo tipo ha portato ad una ricchezza di conoscenza di che cosa si stabilizza le proteine nei loro stati piegati. Per ottenere un quadro pi&ugrave; completo richiede che noi turbare queste strutture in modo continuo, qualcosa non pu&ograve; raggiungere la mutagenesi. Con metodi cristallografici alta pressione ora &egrave; possibile esplorare le propriet&agrave; dettagliate di proteine pur variando continuamente i parametri termodinamici. Ecco, noi dettaglio la risposta strutturale del cavit&agrave; contenenti lisozima mutante L99A della T4, nonch&eacute; sua pseudo wild-type (WT *) controparte, alla pressione idrostatica. Sorprendentemente, la cavit&agrave; non ha quasi nessun effetto sulla pressione risposta: praticamente le stesse modifiche sono osservate nel WT * come L99A sotto pressione. La cavit&agrave; &egrave; pi&ugrave; rigida, mentre altre regioni sostanzialmente deformano. Questo implica che mentre alcuni residui possono aumentare la stabilit&agrave; termodinamica di una proteina, possono anche essere strutturalmente irrilevanti. Come ha recentemente dimostrato, la cavit&agrave; si riempie d&#39;acqua a pressioni superiori a 100 MPa, pur mantenendo la sua dimensione complessiva. L&#39;immagine risulta della proteina &egrave; uno in cui gruppi laterali conformazionalmente fluttuante forniscono un ambiente liquido-come, ma che contribuiscono alla rigidit&agrave; della spina dorsale del peptide.

Rigidit&agrave; strutturale di una grande cavit&agrave; contenenti proteine rivelata dalla cristallografia ad alta pressione.

The thermotropic phase behaviour of aqueous dispersions of some synthetic 1,2-di-O-alkyl-3-O-(beta-D-galactosyl)-rac-glycerols (rac-beta-D-GalDAGs) with both odd and even hydrocarbon chain lengths was studied by differential scanning calorimetry (DSC), small-angle (SAXS) and wide-angle (WAXS) X-ray diffraction. DSC heating curves show a complex pattern of lamellar (L) and nonlamellar (NL) phase polymorphism dependent on the sample's thermal history. On cooling from 95 degrees C and immediate reheating, rac-beta-D-GalDAGs typically show a single, strongly energetic phase transition, corresponding to either a lamellar gel/liquid-crystalline (L(beta)/L(alpha)) phase transition (N< or =15 carbon atoms) or a lamellar gel/inverted hexagonal (L(beta)/H(II)) phase transition (N> or =16). At higher temperatures, some shorter chain compounds (N=10-13) exhibit additional endothermic phase transitions, identified as L/NL phase transitions using SAXS/WAXS. The NL morphology and the number of associated intermediate transitions vary with hydrocarbon chain length. Typically, at temperatures just above the L(alpha) phase boundary, a region of phase coexistence consisting of two inverted cubic (Q(II)) phases are observed. The space group of the cubic phase seen on initial heating has not been determined; however, on further heating, this Q(II) phase disappears, enabling the identification of the second Q(II) phase as Pn3 m (space group Q(224)). Only the Pn3 m phase is seen on cooling. Under suitable annealing conditions, rac-beta-D-GalDAGs rapidly form highly ordered lamellar-crystalline (L(c)) phases at temperatures above (N< or =15) or below (N=16-18) the L(beta)/L(alpha) phase transition temperature (T(m)). In the N< or =15 chain length lipids, DSC heating curves show two overlapping, highly energetic, endothermic peaks on heating above T(m); corresponding changes in the first-order spacings are observed by SAXS, accompanied by two different, complex patterns of reflections in the WAXS region. The WAXS data show that there is a difference in hydrocarbon chain packing, but no difference in bilayer dimensions or hydrocarbon chain tilt for these two L(c) phases (termed L(c1) and L(c2), respectively). Continued heating of suitably annealed, shorter chain rac-beta-D-GalDAGs from the L(c2) phase results in a phase transition to an L(alpha) phase and, on further heating, to the same Q(II) or H(II) phases observed on first heating. On reheating annealed samples with longer chain lengths, a subgel phase is formed. This is characterized by a single, poorly energetic endotherm visible below the T(m). SAXS/WAXS identifies this event as an L(c)/L(beta) phase transition. However, the WAXS reflections in the di-16:0 lipid do not entirely correspond to the reflections seen for either the L(c1) or L(c2) phases present in the shorter chain rac-beta-D-GalDAGs; rather these consist of a combination of L(c1), L(c2) and L(beta) reflections, consistent with DSC data where all three phase transitions occur within a span of 5 degrees C. At very long chain lengths (N> or =19), the L(beta)/L(c) conversion process is so slow that no L(c) phases are formed over the time scale of our experiments. The L(beta)/L(c) phase conversion process is significantly faster than that seen in the corresponding rac-beta-D-GlcDAGs, but is slower than in the 1,2-sn-beta-D-GalDAGs already studied. The L(alpha)/NL phase transition temperatures are also higher in the rac-beta-D-GalDAGs than in the corresponding rac-beta-D-GlcDAGs, suggesting that the orientation of the hydroxyl at position 4 and the chirality of the glycerol molecule in the lipid/water interface influence both the L(c) and NL phase properties of these lipids, probably by controlling the relative positions of hydrogen bond donors and acceptors in the polar region of the membrane.

The thermotropic phase behaviour and phase structure of a homologous series of racemic beta-D-galactosyl dialkylglycerols studied by differential scanning calorimetry and X-ray diffraction.

Le comportement de phase thermotrope des dispersions aqueuses de certains 1,2-di-O-alkyl-3-O-(beta-D-galactosyl)-rac-glycerols synth&eacute;tique (rac-b&ecirc;ta-D-GalDAGs) &agrave; la fois &eacute;trange et m&ecirc;me les longueurs de cha&icirc;nes d&#39;hydrocarbures a &eacute;t&eacute; &eacute;tudi&eacute; par l&#39;analyse calorim&eacute;trique diff&eacute;rentielle (DSC), petits angles (SAXS) et diffraction de rayons x grand angle (Encrassage). Courbes de chauffage de DSC montrent un sch&eacute;ma complexe de lamellaire (L) et le polymorphisme de phase non-lamellaires (NL) d&eacute;pend de l&#39;histoire thermique de l&#39;&eacute;chantillon. Le refroidissement de 95 degr&eacute;s C et r&eacute;chauffage imm&eacute;diat, rac-b&ecirc;ta-D-GalDAGs pr&eacute;sentent g&eacute;n&eacute;ralement une transition de la phase unique, fortement &eacute;nergique, correspondant &agrave; soit une lamellaire gel/liquide-cristalline (L(beta)/L(alpha)) transition de phase (N &lt; ou = 15 atomes de carbone) ou un lamellaire gel/invers&eacute; hexagonal (transition de phase de L(beta)/H(II)) (N &gt; ou = 16). Aux temp&eacute;ratures &eacute;lev&eacute;es, certains compos&eacute;s &agrave; cha&icirc;ne plus courtes (N = 10-13) pr&eacute;sentent des transitions de phase endothermique suppl&eacute;mentaires, identifi&eacute;es comme des transitions de phase L/NL &agrave; l&#39;aide de SAXS/WAXS. La morphologie de NL et le nombre de transitions interm&eacute;diaires associ&eacute;s varient avec la longueur de la cha&icirc;ne d&#39;hydrocarbure. En g&eacute;n&eacute;ral, &agrave; une temp&eacute;rature juste au-dessus de la limite de phase de L(alpha), une r&eacute;gion de la coexistence de phase consistant en deux invers&eacute; cubes (Q(II)) phases sont observ&eacute;s. Le groupe d&#39;espace de la phase cubique vu le chauffage initial n&#39;a pas &eacute;t&eacute; d&eacute;termin&eacute; ; Cependant, le surchauffage, cette phase Q(II) dispara&icirc;t, permettant l&#39;identification de la deuxi&egrave;me phase Q(II) comme m Pn3 (groupe d&#39;espace Q(224)). Seule la phase de m Pn3 est vu le refroidissement. Dans des conditions appropri&eacute;es de recuit, rac-b&ecirc;ta-D-GalDAGs rapidement forme hautement ordonn&eacute; lamellaire cristalline (phases de L(c)) &agrave; des temp&eacute;ratures sup&eacute;rieures (N &lt; ou = 15) ou au-dessous (N = 16-18) la L(beta)/L(alpha) phase de temp&eacute;rature de transition vitreuse (T(m)). Dans le N &lt; ou = 15 lipides de longueur de cha&icirc;ne, DSC chauffage courbes montrent deux pics qui se chevauchent, tr&egrave;s &eacute;nergiques, endothermiques sur chauffage au-dessus de T(m) ; des changements correspondants dans les espacements de premier ordre sont observ&eacute;s par SAXS, accompagn&eacute;es par deux diff&eacute;rents, des motifs complexes de r&eacute;flexions dans la r&eacute;gion d&#39;ENCRASSAGE. Les donn&eacute;es de l&#39;ENCRASSAGE montrent qu&#39;il existe une diff&eacute;rence dans la cha&icirc;ne d&#39;hydrocarbure d&#39;emballage, mais aucune diff&eacute;rence dans les dimensions de la bicouche ou cha&icirc;ne hydrocarbon&eacute;e n&#39;incliner pour ces deux phases 1C (appel&eacute;s L(c1) et L(c2), respectivement). Chauffage continu de convenablement recuit, plus courte cha&icirc;ne rac-b&ecirc;ta-D-GalDAGs d&#39;apr&egrave;s les r&eacute;sultats de phase de L(c2) dans une phase de transition &agrave; une phase de L(alpha) et, sur plus de chauffage, pour les phases Q(II) ou H(II) m&ecirc;mes observ&eacute;s le premier chauffage. Le r&eacute;chauffage recuits des &eacute;chantillons avec des longueurs de cha&icirc;nes plus longues, une phase de subgel est form&eacute;e. Cela se caract&eacute;rise par un endotherme unique, peu &eacute;nergique visible au-dessous de la T(m). SAXS/WAXS identifie cet &eacute;v&eacute;nement comme une transition de phase de L(c)/L(beta). Cependant, les r&eacute;flexions d&#39;ENCRASSAGE dans le di-16:0 lipide ne correspondent pas enti&egrave;rement aux r&eacute;flexions vus pour le L(c1) ou le L(c2) phases pr&eacute;sentes dans la plus courte cha&icirc;ne rac-b&ecirc;ta-D-GalDAGs ; Il s&#39;agit plut&ocirc;t d&#39;une combinaison de r&eacute;flexions L(c1), L(c2) et L(beta), compatibles avec les donn&eacute;es de DSC o&ugrave; toutes les trois phase transitions se produisent en l&#39;espace de 5 degr&eacute;s C. D&#39;une longueur tr&egrave;s longue cha&icirc;ne (N &gt; ou = 19), le processus de conversion de L(beta)/L(c) est si lent qu&#39;aucun phases 1C ne sont forment sur l&#39;&eacute;chelle de temps de nos exp&eacute;riences. Le processus de conversion de phase de L(beta)/L(c) est nettement plus rapide que celle observ&eacute;e dans le rac-b&ecirc;ta-D-GlcDAGs correspondant, mais il est plus lent que dans le 1, 2-sn-b&ecirc;ta-D-GalDAGs d&eacute;j&agrave; &eacute;tudi&eacute;s. Les temp&eacute;ratures de transition L (alpha) /NL phase sont &eacute;galement plus &eacute;lev&eacute;s dans le rac-b&ecirc;ta-D-GalDAGs que dans la correspondante rac-b&ecirc;ta-D-GlcDAGs, ce qui sugg&egrave;re que l&#39;orientation de l&#39;hydroxyle en position 4 et la chiralit&eacute; dans la mol&eacute;cule de glyc&eacute;rol dans l&#39;interface lipide/eau influencent les 1C et NL propri&eacute;t&eacute;s de phase de ces lipides, probablement en contr&ocirc;lant la position relative des liaisons hydrog&egrave;nes donneurs et accepteurs dans la r&eacute;gion polaire de la membrane.

Le comportement de phase thermotrope et la structure de la phase d&#39;une s&eacute;rie homologue de rac&eacute;mique b&ecirc;ta-D-galactosyl dialkylglycerols &eacute;tudi&eacute;s par analyse calorim&eacute;trique diff&eacute;rentielle et de la diffraction des rayons x.

Il comportamento di fase termotropici delle dispersioni acquose di alcuni 1,2-di-O-alkyl-3-O-(beta-D-galactosyl)-rac-glycerols sintetici (rac-beta-D-GalDAGs) con anche lunghezze di catena di idrocarburi e dispari &egrave; stato studiato da calorimetria a scansione differenziale (DSC), piccolo angolo (SAXS) e diffrazione di raggi x (WAXS) grandangolare. Curve di riscaldamento DSC mostrano un modello complesso di lamellare (L) e nonlamellar (NL) fase polimorfismo dipendono dalla storia termica del campione. Raffreddamento da 95 gradi C e riscaldamento immediato, rac-beta-D-GalDAGs tipicamente mostrano una transizione di fase singola, fortemente energico, corrispondenti a entrambi una lamellare gel/liquido-cristallina (transizione di fase L(beta)/L(alpha)) (N &lt; o = 15 atomi di carbonio) o un lamellare gel/invertito esagonale (transizione di fase L(beta)/H(II)) (N &amp;gt; o = 16). A temperature pi&ugrave; elevate, alcuni composti di catena pi&ugrave; corte (N = 10-13) mostrano le transizioni di fase endotermico supplementari, identificate come transizioni di fase L/NL utilizzando SAXS/WAXS. La morfologia NL e il numero di transizioni intermedi associati variano con la lunghezza della catena di idrocarburi. In genere, a temperature appena sopra il contorno di fase L(alpha), una regione della coesistenza di fase composta da due invertito cubi (Q(II)) fasi sono osservati. Il gruppo spaziale della fase cubica visto sul riscaldamento iniziale non &egrave; stato determinato; Tuttavia, ulteriore riscaldamento, questa fase Q(II) scompare, che consentano l&#39;identificazione della seconda fase Q(II) Pn3 m (gruppo spazio Q(224)). Solo la fase m Pn3 &egrave; visto sul raffreddamento. Sotto opportune condizioni di ricottura, rac-beta-D-GalDAGs rapidamente forma altamente ordinato lamellare cristallina (fasi di L(c)) a temperature superiori (N &lt; o = 15) o sotto (N = 16-18) il L(beta)/L(alpha) (T(m)), temperatura di transizione di fase. N &lt; o = 15 lipidi di lunghezza di catena, curve di riscaldamento DSC mostrano due picchi sovrapposti, altamente energici, endotermici sul riscaldamento sopra T(m); corrispondente nelle spaziature di primo ordine sono osservati cambiamenti di SAXS, accompagnato da due diversi, modelli complessi di riflessi nella regione WAXS. I dati WAXS mostrano che esiste una differenza nella catena di idrocarburi di imballaggio, ma nessuna differenza nelle dimensioni di doppio strato o catena di idrocarburi inclinare per queste due fasi L(c) (chiamate L(c1) e L(c2), rispettivamente). Riscaldamento continuo della catena opportunamente ricotto, brevi rac-beta-D-GalDAGs dai risultati della fase di L(c2) in una fase di transizione a una fase di L(alpha) e, su ulteriore riscaldamento, per le stesse fasi Q(II) o H(II) osservate il primo riscaldamento. Il riscaldo campioni ricotti con lunghezze di catena, una fase di subgel &egrave; formata. Questa &egrave; caratterizzata da un singolo, scarsamente energico pu&ograve; visibile sotto il T(m). SAXS/WAXS identifica questo evento come una transizione di fase L(c)/L(beta). Tuttavia, le riflessioni WAXS di-16:0 lipidi non corrispondono interamente alle riflessioni vista per L(c1) o L(c2) fasi presenti nella pi&ugrave; corta catena rac-beta-D-GalDAGs; piuttosto si tratta di una combinazione di riflessi L(c1), L(c2) e L(beta), coerente con i dati di DSC dove trifase tutte le transizioni avvengono in un arco di 5 gradi C. A lunghezze di catena molto lunga (N &amp;gt; o = 19), il processo di conversione L(beta)/L(c) &egrave; cos&igrave; lento che non L(c) fasi sono formati sopra la scala temporale dei nostri esperimenti. Il processo di conversione di fase L(beta)/L(c) &egrave; notevolmente pi&ugrave; veloce rispetto a quello visto nel corrispondente rac-beta-D-GlcDAGs, ma &egrave; pi&ugrave; lento nell&#39;1,2-sn-beta-D-GalDAGs gi&agrave; studiato. Le temperature di transizione L fase /NL (alfa) sono anche pi&ugrave; alti nel rac-beta-D-GalDAGs rispetto al corrispondente rac-beta-D-GlcDAGs, suggerendo che l&#39;orientamento dell&#39;ossidrile in posizione 4 e la chiralit&agrave; della molecola di glicerolo nell&#39;interfaccia acqua/lipidi influenza sia la L(c) NL fase propriet&agrave; di questi lipidi, probabilmente controllando le posizioni relative del legame idrogeno donatori e accettori nella regione polare della membrana.

Il comportamento di fase termotropici e struttura di fase di una serie omologa di racemica dialkylglycerols beta-D-galattosil studiato da calorimetria differenziale a scansione e diffrazione dei raggi x.

Whereas it appears to be generally believed that the leaflets of a phospholipid/cholesterol bilayer interact with each other in some way, the exact mechanism remains undetermined. Various suggestions have been invoked, including chain interdigitation and rapid translocation of cholesterol. There is little, if any, direct evidence supporting or excluding these hypotheses. In this letter, I examine a few different possibilities. Chain interdigitation is unlikely to be significant. Cholesterol translocation meets some, though not all, of the relevant criteria, and probably plays an important role. The simplest explanation is that the layers interact at the midplane in the same way that the ordered and disordered liquid phases common in these systems interact at their interfaces. A quick estimate of that interfacial energy shows that this is a very likely candidate. The consequences of such an energy in biological systems are briefly considered.

Interleaflet coupling mechanisms in bilayers of lipids and cholesterol.

Consid&eacute;rant qu&#39;il appara&icirc;t en g&eacute;n&eacute;ral croit que les folioles d&#39;une bicouche de phospholipides/cholest&eacute;rol interagissent entre eux d&#39;une certaine fa&ccedil;on, le m&eacute;canisme exact reste ind&eacute;termin&eacute;. Diverses suggestions ont &eacute;t&eacute; invoqu&eacute;es, y compris la translocation interdigitation et rapide de cha&icirc;ne de cholest&eacute;rol. Il y a peu, le cas &eacute;ch&eacute;ant, une preuve directe soutenant ou &agrave; l&#39;exclusion de ces hypoth&egrave;ses. Dans cette lettre, j&#39;examine quelques possibilit&eacute;s diff&eacute;rentes. Interdigitation de cha&icirc;ne ne devrait pas &ecirc;tre significative. Translocation de cholest&eacute;rol r&eacute;pond &agrave; certains, mais pas tous, les crit&egrave;res pertinents et joue probablement un r&ocirc;le important. L&#39;explication la plus simple est que les couches interagissent dans le plan m&eacute;dian de la m&ecirc;me mani&egrave;re que les phases ordonn&eacute;es et d&eacute;sordonn&eacute;es liquides communs dans ces syst&egrave;mes interagissent &agrave; leurs interfaces. Une estimation rapide de l&#39;&eacute;nergie interfaciale montre qu&#39;il s&#39;agit d&#39;un candidat tr&egrave;s probable. Les cons&eacute;quences d&#39;une telle &eacute;nergie dans les syst&egrave;mes biologiques sont bri&egrave;vement examin&eacute;s.

Interleaflet m&eacute;canismes de couplage dans les bicouches de lipides et de cholest&eacute;rol.

Considerando che sembra essere generalmente creduto che i volantini di un doppio strato fosfolipidico/colesterolo interagiscono tra loro in qualche modo, l&#39;esatto meccanismo resta indeterminato. Sono stati richiamati vari suggerimenti, tra cui una traslocazione interdigitation e rapido catena di colesterolo. C&#39;&egrave; poco, se del caso, prove dirette di supporto o escludendo queste ipotesi. In questa lettera, esaminare alcune diverse possibilit&agrave;. Interdigitation catena &egrave; improbabile che sia significativo. Traslocazione del colesterolo incontra alcuni, anche se non tutti, i criteri pertinenti e probabilmente svolge un ruolo importante. La spiegazione pi&ugrave; semplice &egrave; che i livelli interagiscono presso il midplane nello stesso modo che le fasi liquide ordinate e disordinate comuni in questi sistemi interagiscono al loro interfacce. Una stima rapida di quella energia interfacciale Mostra che questo &egrave; un molto probabile candidato. Le conseguenze di una tale energia nei sistemi biologici sono considerate brevemente.

Interleaflet meccanismi di accoppiamento nel bilayer di lipidi e di colesterolo.

Plasma membranes of cells are asymmetric in both lipid and protein composition. The mechanism by which proteins on both sides of the membrane colocalize during signaling events is unknown but may be due to the induction of inner leaflet domains by the outer leaflet. Here we show that liquid domains form in asymmetric Montal-Mueller planar bilayers in which one leaflet's composition would phase-separate in a symmetric bilayer and the other's would not. Equally important, by tuning the lipid composition of the second leaflet, we are able to suppress domains in the first leaflet. When domains are present in asymmetric membranes, each leaflet contains regions of three distinct lipid compositions, implying strong interleaflet interactions. Our results show that mechanisms of domain induction between the outer and inner leaflets of cell plasma membranes do not necessarily require the participation of membrane proteins. Based on these findings, we suggest mechanisms by which cells could actively regulate protein function by modulating local lipid composition or interleaflet interactions.

Tuning lipid mixtures to induce or suppress domain formation across leaflets of unsupported asymmetric bilayers.

Les membranes plasmiques des cellules sont asym&eacute;triques dans la composition des lipides et des prot&eacute;ines. Le m&eacute;canisme par lequel les prot&eacute;ines des deux c&ocirc;t&eacute;s de la membrane sont colocalis&eacute;es lors d&#39;&eacute;v&eacute;nements de signalisation est inconnu mais peut &ecirc;tre d&ucirc; &agrave; l&#39;induction des domaines du feuillet interne par le feuillet externe. Ici, nous montrons que la forme liquide de domaines dans les bicouches planaires de Montal-Mueller asym&eacute;triques dans la composition de dont un d&eacute;pliant serait phase distincte dans une bicouche sym&eacute;trique et de l&#39;autre ne serait pas. Sont tout aussi importants, en ajustant la composition lipidique de la seconde brochure, nous capables de supprimer les domaines dans le premier tract. Lorsque les domaines sont pr&eacute;sents dans les membranes asym&eacute;triques, chaque foliole contient des r&eacute;gions de trois compositions lipidiques distinctes, ce qui implique de fortes interactions interleaflet. Nos r&eacute;sultats montrent que les m&eacute;canismes d&#39;induction de domaine entre les folioles ext&eacute;rieures et int&eacute;rieures des membranes plasmiques cellulaires ne n&eacute;cessitent pas forc&eacute;ment la participation des prot&eacute;ines membranaires. Se fondant sur ces constatations, nous sugg&eacute;rons des m&eacute;canismes par lequel les cellules pourraient activement r&eacute;guler la fonction des prot&eacute;ines en modulant la composition lipidique local ou interleaflet des interactions.

Tuning m&eacute;langes lipides d&#39;inciter ou de supprimer la formation domaine &agrave; travers des tracts de bicouches asym&eacute;triques non pris en charge.

Plasma membrane delle cellule sono asimmetriche in composizione sia dei lipidi e proteine. Il meccanismo mediante il quale le proteine su entrambi i lati della membrana colocalize durante gli eventi di segnalazione &egrave; sconosciuto, ma pu&ograve; essere causa di induzione di domini foglietto interno dell&#39;opuscolo esterno. Qui vi mostriamo quella forma liquida domini in asimmetrica Montal-Mueller planare bilayer nella composizione di cui uno opuscolo sarebbe fase separata in una simmetrica doppio strato e l&#39;altro non sarebbe. Altrettanto importante, sintonizzando la composizione lipidica del secondo foglio illustrativo, siamo in grado di sopprimere i domini nel primo volantino. Quando i domini sono presenti nelle membrane asimmetriche, ogni opuscolo contiene aree di tre composizioni di lipidi distinti, che implica forti interazioni interleaflet. I nostri risultati mostrano che meccanismi di induzione di dominio tra gli opuscoli interni ed esterni della membrana plasmatica delle cellule non richiedono necessariamente la partecipazione delle proteine di membrana. Sulla base di questi risultati, consigliamo di meccanismi con cui le cellule potrebbero attivamente regolano la funzione della proteina modulando la composizione lipidica locale o interleaflet interazioni.

Tuning miscele lipidi per indurre o sopprimere la formazione di dominio attraverso volantini del bilayer asimmetrica non supportato.

Membranes containing a wide variety of ternary mixtures of high chain-melting temperature lipids, low chain-melting temperature lipids, and cholesterol undergo lateral phase separation into coexisting liquid phases at a miscibility transition. When membranes are prepared from a ternary lipid mixture at a critical composition, they pass through a miscibility critical point at the transition temperature. Since the critical temperature is typically on the order of room temperature, membranes provide an unusual opportunity in which to perform a quantitative study of biophysical systems that exhibit critical phenomena in the two-dimensional Ising universality class. As a critical point is approached from either high or low temperature, the scale of fluctuations in lipid composition, set by the correlation length, diverges. In addition, as a critical point is approached from low temperature, the line tension between coexisting phases decreases to zero. Here we quantitatively evaluate the temperature dependence of line tension between liquid domains and of fluctuation correlation lengths in lipid membranes to extract a critical exponent, nu. We obtain nu = 1.2 +/- 0.2, consistent with the Ising model prediction nu = 1. We also evaluate the probability distributions of pixel intensities in fluorescence images of membranes. From the temperature dependence of these distributions above the critical temperature, we extract an independent critical exponent of beta = 0.124 +/- 0.03, which is consistent with the Ising prediction of beta = 1/8.

Line tensions, correlation lengths, and critical exponents in lipid membranes near critical points.

Membranes contenant une grande vari&eacute;t&eacute; de m&eacute;langes ternaires de lipides de temp&eacute;rature haute cha&icirc;ne par fusion, temp&eacute;rature de fusion de cha&icirc;ne faible lipides et cholest&eacute;rol subissent une s&eacute;paration des phases lat&eacute;ral dans des phases coexistantes liquides &agrave; une transition de miscibilit&eacute;. Lorsque les membranes sont pr&eacute;par&eacute;s &agrave; partir d&#39;un m&eacute;lange de lipides ternaires &agrave; une composition critique, ils passent par un point critique de miscibilit&eacute; &agrave; la temp&eacute;rature de transition. &Eacute;tant donn&eacute; que la temp&eacute;rature critique est typiquement sur l&#39;ordre de la temp&eacute;rature ambiante, membranes offrent une occasion exceptionnelle dans lequel effectuer une &eacute;tude quantitative des syst&egrave;mes biophysiques qui pr&eacute;sentent des ph&eacute;nom&egrave;nes critiques dans la classe d&#39;universalit&eacute; Ising bi-dimensionnel. Un point critique est l&#39;approche de soit haute ou basse temp&eacute;rature, l&#39;ampleur des fluctuations dans la composition lipidique, d&eacute;finie par la longueur de corr&eacute;lation diverge. En outre, un point critique est l&#39;approche de la basse temp&eacute;rature, la tension de la ligne entre phases coexistantes diminue jusqu&#39;&agrave; z&eacute;ro. Ici nous &eacute;valuer quantitativement l&#39;influence de la temp&eacute;rature de la tension de la ligne entre les domaines liquides et d&#39;une longueur de corr&eacute;lation de fluctuation dans les membranes lipidiques pour extraire un nu exposant, critique. Nous obtenons nu = 1.2 +/-0,2, compatible avec le nu de pr&eacute;diction du mod&egrave;le Ising = 1. Nous &eacute;valuons aussi les distributions de probabilit&eacute; des intensit&eacute;s des pixels dans les images de fluorescence des membranes. De la d&eacute;pendance en temp&eacute;rature de ces distributions au-dessus de la temp&eacute;rature critique, nous extrayons un exposant critique ind&eacute;pendant de b&ecirc;ta = 0,124 +/-0,03, ce qui est conforme &agrave; la pr&eacute;vision d&#39;Ising de b&ecirc;ta = 1/8.

Les tensions de ligne, longueurs de corr&eacute;lation et les exposants critiques dans les membranes lipidiques pr&egrave;s de points critiques.

Membrane contenenti una vasta gamma di miscele ternarie di alta catena di fusione lipidi di temperatura, bassa catena di fusione temperatura lipidi e colesterolo sono sottoposti a separazione di fase laterale in fasi liquidi coesistenti in una transizione di miscibilit&agrave;. Quando le membrane sono preparate da una miscela di lipidi ternario a una composizione critica, che passano attraverso un punto critico di miscibilit&agrave; alla temperatura di transizione. Poich&eacute; la temperatura critica &egrave; tipicamente dell&#39;ordine di temperatura ambiente, membrane forniscono un&#39;opportunit&agrave; insolita in cui eseguire uno studio quantitativo dei sistemi biofisici che presentano fenomeni critici nella classe universalit&agrave; Ising bidimensionale. Come un punto critico viene avvicinato da alta o bassa temperatura, la scala delle fluttuazioni nella composizione lipidica, impostare la lunghezza di correlazione, diverge. Inoltre, come un punto critico &egrave; avvicinato dalla bassa temperatura, la tensione di linea tra fasi coesistenti riduce a zero. Qui noi valutare quantitativamente la dipendenza dalla temperatura della tensione di linea tra domini di liquidi e di lunghezze correlazione fluttuazione in membrane lipidiche per estrarre un critico esponente, nu. Otteniamo nu = 1.2 + /-0.2, coerente con il nu di previsione modello di Ising = 1. Valutiamo anche le distribuzioni di probabilit&agrave; delle intensit&agrave; di pixel nelle immagini di fluorescenza delle membrane. Dalla dipendenza dalla temperatura di queste distribuzioni sopra la temperatura critica, estraiamo un esponente critico indipendente di beta = 0.124 + /-0,03, che &egrave; coerente con la previsione di Ising di beta = 1/8.

Le tensioni di linea, lunghezza di correlazione ed esponenti critici in membrane lipidiche nei pressi di punti critici.

NanoPore sequenziamento ha il potenziale per diventare una tecnologia di sequenziamento del DNA diretto, veloce e poco costoso. La forma pi&ugrave; semplice di sequenziamento del DNA nanopore utilizza l&#39;ipotesi che singoli nucleotidi del DNA single-stranded passando attraverso un nanopore saranno modulare in modo univoco un ionico corrente che fluisce attraverso i pori, permettendo il record della corrente per produrre la sequenza del DNA. Dimostriamo che la corrente ionica attraverso l&#39;ingegneria Mycobacterium smegmatis porin A, MspA, ha la capacit&agrave; di distinguere tutti i quattro nucleotidi del DNA e risolvere singoli nucleotidi nel DNA single-stranded quando DNA double-stranded detiene temporaneamente i nucleotidi nel restringimento dei pori. Passaggio di DNA con una serie di sezioni di double-stranded attraverso MspA fornisce una prova di principio di un semplice metodo di sequenziamento del DNA usando un nanopore. Questi risultati sottolineano l&#39;importanza di MspA in futuro di nanopore sequenziamento.

Sequenziamento del DNA NanoPore con MspA.

Nanopore sequencing has the potential to become a direct, fast, and inexpensive DNA sequencing technology. The simplest form of nanopore DNA sequencing utilizes the hypothesis that individual nucleotides of single-stranded DNA passing through a nanopore will uniquely modulate an ionic current flowing through the pore, allowing the record of the current to yield the DNA sequence. We demonstrate that the ionic current through the engineered Mycobacterium smegmatis porin A, MspA, has the ability to distinguish all four DNA nucleotides and resolve single-nucleotides in single-stranded DNA when double-stranded DNA temporarily holds the nucleotides in the pore constriction. Passing DNA with a series of double-stranded sections through MspA provides proof of principle of a simple DNA sequencing method using a nanopore. These findings highlight the importance of MspA in the future of nanopore sequencing.

Nanopore DNA sequencing with MspA.

S&eacute;quen&ccedil;age nanopore a le potentiel pour devenir une technologie de s&eacute;quen&ccedil;age d&#39;ADN directe, rapide et peu co&ucirc;teuse. La forme la plus simple de s&eacute;quen&ccedil;age de l&#39;ADN nanopore utilise l&#39;hypoth&egrave;se que des nucl&eacute;otides de l&#39;ADN simple brin en passant &agrave; travers un nanopore seront particuli&egrave;rement bien moduler un courant ionique qui circule dans les pores, permettant l&#39;enregistrement du courant pour obtenir la s&eacute;quence d&#39;ADN. Nous d&eacute;montrons que le courant ionique dans l&#39;ing&eacute;nierie Mycobacterium smegmatis porine A, MspA, a la capacit&eacute; de distinguer tous les quatre nucl&eacute;otides de l&#39;ADN et r&eacute;soudre seul-nucl&eacute;otides dans l&#39;ADN monocat&eacute;naire lorsque l&#39;ADN bicat&eacute;naire d&eacute;tient temporairement les nucl&eacute;otides dans la constriction des pores. En passant de l&#39;ADN avec une s&eacute;rie de sections bicat&eacute;naire par MspA apporte la preuve de principe d&#39;une simple m&eacute;thode de s&eacute;quen&ccedil;age d&#39;ADN &agrave; l&#39;aide d&#39;un nanopore. Ces r&eacute;sultats soulignent l&#39;importance de la MspA &agrave; l&#39;avenir du nanopore s&eacute;quen&ccedil;age.

S&eacute;quen&ccedil;age de l&#39;ADN nanopore avec MspA.

High-pressure methods for solving protein structures by X-ray crystallography and NMR are maturing. These techniques are beginning to impact our understanding of thermodynamic and structural features that define not only the protein's native conformation, but also the higher free energy conformations. The ability of high-pressure methods to visualize these mostly unexplored conformations provides new insight into protein function and dynamics. In this review, we begin with a historical discussion of high-pressure structural studies, with an eye toward early results that paved the way to mapping the multiple conformations of proteins. This is followed by an examination of several recent studies that emphasize different strengths and uses of high-pressure structural studies, ranging from basic thermodynamics to the suggestion of high-pressure structural methods as a tool for protein engineering.

Marcus D. Collins

Department of Physiology and Biophysics

University of Washington

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Marcus D. Collins

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University of Washington

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Department of Physiology and Biophysics