Microfluidic Perifusion 장치 내에서 멀티 파라메 트릭 아일릿 Perifusion 시스템

요약

microfluidic 아일릿 perifusion 장치가 여러 아일 레츠와 칼슘 유입과 mitochondrial 잠재적인 변화 동시 형광 이미지의 역동적인 인슐린 분비의 평가를 위해 개발되었습니다.

초록

microfluidic 아일릿 perifusion 장치가 여러 아일 레츠와 칼슘 유입과 mitochondrial 잠재적인 변화 동시 형광 이미지의 역동적인 인슐린 분비의 평가를 위해 개발되었습니다. 이 장치는 세 계층으로 구성되어 있습니다 : 첫 번째 레이어는 아일 레츠의 노출 표면적을 흐름과 극대화에 노출된 상태에서 아일 레츠를 무력화하는 데 도움이 microscale 웰스 (500 μm의 직경 150 μm의 깊이)의 배열을 포함, 두 번째 레이어는 원형을 포함 perifusion 챔버 (깊이 3mm, 7mm 직경) 및 세 번째 계층은 입구 - 혼합 채널을 포함하는 팬들 아웃하기 전에 최적화에 대한 perifusion 챔버에 주입 (폭 2mm, 길이 19mm, 높이 500 μm의) 혼합 효율 전에 perifusion 챔버를 입력합니다. 선형, 종 모양 등 다양한 포도당 그라디언트, 그리고 광장 형태의 생성도 microfluidic perifusion 네트워크에 만들 수 있으며, 증명합니다.

프로토콜

3 층 microfluidic의 perifusion 장치의 A.의 Microfabrication

하단 그럼 마스터 프로토콜 (150 μm의 깊은 우물)

1. 필요한 경우 면도날을 사용하여 웨이퍼를 청소합니다. 아세톤, 메탄올과 IPA로 닦으십시오. 30 S. 50 왓츠에서 플라즈마 처리를 수행
2. 스핀 SU8 - 100 @ 2000 RPM. [1 단계 : 500 RPM, 10 S, 100 RPM / s의 2 단계 : 2000 RPM, 30 S, 300 RPM / S].
   [참고 : SU8 스피닝 후 핀셋으로 웨이퍼를 보유하지]
3. 소프트 베이킹 65 웨이퍼 ° C 20 분 및 95 °에서 50 분 C.
4. 웨이퍼는 원하는 마스크를 통해 자외선에 노출됩니다. 150 μm의 높이에 대한 선량 650 MJ / cm ^2입니다.
5. 포스트 노출은 65에서 웨이퍼를 구워 ° 1 분 및 95에서 C ° 12 분 C.
6. 15 분 SU8 개발자의 웨이퍼를 개발.

Microchannel 마스터 프로토콜 (500 μm의 깊은 우물)

1. 필요한 경우 면도날을 사용하여 웨이퍼를 청소합니다. 아세톤, 메탄올과 IPA로 닦으십시오. 30 S. 50 왓츠에서 플라즈마 처리를 수행
2. 스핀 SU8 - 2150 @ 1000 RPM. [1 단계 : 500 RPM, 10 S, 100 RPM / s의 2 단계 : 1000 RPM, 30 S, 300 RPM / S].
3. 소프트 베이킹 65 웨이퍼 ° C 15 분 및 95 °에서 2 시간 30 분 C.
4. 웨이퍼는 원하는 마스크를 통해 자외선에 노출됩니다. 650 μm의 높이에 대한 노출 선량은 685 MJ / cm ^2입니다.
5. 포스트 노출은 65에서 웨이퍼를 구워 ° 5 분 및 95에서 C ° ~ 35 분 C.
6. 20-30 분 SU8 개발자의 웨이퍼를 개발.

PDMS 솔루션 준비

1. Polydimethylsiloxane (PDMS) 솔루션은 철저하게 표준 Sylgard 184 키트의 치료 요원 1 일부로 실리콘 탄성체의 10 부분을 혼합하여 준비가되어 있습니다.
2. 혼합 과정에서 PDMS 솔루션에서 생성된 거품은 진공 건조기를 사용하여 제거됩니다.
3. 거품없는 PDMS 솔루션은 천천히 SU8 마스터와 세 번째 레이어에 빈 페트리 접시에 적절합니다.
4. 뜨거운 접시의 온도가 75로 설정되어 ° C와 PDMS는 2 시간이 온도에서 치료됩니다
5. 인레츠, 콘센트 및 교환 우물은 적절한 크기의 구멍 구멍을 뚫는를 사용하여 밖으로 펀치입니다.
6. 레이어는 휴대용 플라즈마 장치를 사용하여 유리 슬라이드 (크기 0.1 ㎜)에 함께 결합하고 있습니다.

B. 실험 설정

1. 마이크로 장치를 통해 흐름을 70 % 에탄올은 소독 수 있습니다. 흐름 DI 물 에탄올을 씻어. microchannel 벽에 인슐린 이외의 구체적인 흡착을 방지하기 위해 장치를 통해 0.5 % BSA의 50 ML을 Perfuse.
2. 포도당 램프 기울기와 펌프는 그라디언트가 안정되어 있는지 확인하기 위해 테스트하는 주사기와 통신 LabView 소프트웨어에 의해 생성된 기타 관련 그라디언트.
3. 25-30 쥐 아일 레츠가 37 ° C에서 30 분 5 μm의의 Fura-2/AM (칼슘 표시기, 분자 프로브, CA) 및 2.5 μm의의 Rhodamine 123 (Rh123, mitochondrial 가능성 표시기, 시그마, MO)와 incubated되었습니다 이 MM 포도당을 포함한 크렙스 - 링어 버퍼 (KRB)
4. 마우스 아일 레츠는 신중하게 유입 포트를 통해 microfluidic perifusion 장치로 pipetted 있습니다.
5. microfluidic 네트워크는 다음 Tygon 관 그리고 Y - 커넥터 및 분획 수집기에 콘센트를 사용하여 주사기 펌프에 입구를 연결하여 설정합니다. 장치는 현미경에서 가열 단계 (37 ° C)에 자리하고 유입 튜브는 37 챔버 및 솔루션의 온도를 유지하기 위해 열판에서 가열 ° C.
6. 즉시 설치 후, 쥐 아일 레츠는 KRB 그런 다음 10 분 25 분 포도당 램프 (2mM 25mM) 2 MM 포도당이 포함된 함께 perifused 있습니다.
7. 시간 경과 이미지 SimplePCI 소프트웨어에 의해 매 15 s를 수집하고 분석합니다. perifusate 또한 엘리사 키트를 사용하여 인슐린 분비를 분석하기 위해 분획 수집기를 사용하여 매 순간을 수집합니다.

대표 결과

마우스 아일 레츠는 2-25 MM 포도당의 선형 그라디언트로 perifused되었습니다. 그림 1에 표시된, 칼슘 유입 및 인슐린 분비는 6 MM 포도당에 해당하는 perifusion 13 분 후에 실행됩니다. Mitochondrial 잠재력의 변화는 약 11 분, 이전에 예상대로 볼 수 있습니다. 이 데이터는 아일릿 생리 특징이 microfluidic 네트워크를 사용하는 장점을 보여줍니다.

그림 1. 세포 자극을 아일릿하는 생리 반응.

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토론

전통 아일릿 perifusion 시스템 (macroscale 및 microscale) 설정 및 디자인, 높은 기술적 요구 사항과 시스템의 사용자 규정된 화학 그라디언트를 만들 어려움 복잡 등 일부 제한이 있습니다. 여기에서 설명한 microfluidic perifusion 시스템 설계 및 제조의 간단한 기하학 이러한 한계를 극복. 더 중요한 것은,이 시스템은 아일릿 생리 연구를 수있는 유일한 도구로 제공하는 형광 이미징 접근 방식과 통합될 수 있...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
60ml Syringes	BD Biosciences
Fura-2 fluorescence dye	Molecular Probes, Life Technologies
Rhodamine123 Fluorescence dye	Molecular Probes, Life Technologies
Glucose	Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich
30" Silicone tubings	Cole-Parmer		1/16 x 1/8in
1.5ml Eppendorf tubes	Fisher Scientific
Y-connectors	Cole-Parmer		1/16” & 4mm
Syringe connectors	Cole-Parmer		female luer plug 1/16”
Straight connectors	Cole-Parmer		1/16”
Elbow connector	Cole-Parmer		1/16”
Havard syringe pump	Harvard Apparatus
Perifusion device
Hot plate	PMC
Thermometer	Omega Engineering, Inc.
Fraction collector	Gibson
Pippettor	Fisher Scientific
Inverted epiflorescence microscope	Olympus Corporation	IX71
Charge-coupled device	QImaging		Retiga-SRV, Fast 1394