배아 척수 Commissural Axons을 방향을 Diffusible 신호 분자의 능력을 시금

요약

이 분석은 commissural axons를 방향에 대한 신호 분자의 능력, 여기에 본 Morphogenetic의 단백질 7 (BMP7)을 평가합니다. 배아 등의 척수의 explant는 COS 세포의 secreting 후보 성장 요인의 집계에 인접한 양식입니다. explant 내에서 성장 Reoriented commissural axons은 immunohistochemistry에 의해 시각입니다.

초록

척추 척수 ¹ 도설 commissural axons은 축삭지도 신호를 식별하는 귀중한 모델 시스템을왔다. 여기, 우리는 시험 관내 분석, commissural axons의 방향 ² 외부와 내장 신호의 효과를 연구하기 위해 광범위하게 사용되고 있습니다 "reorientation 분석"에 대해 설명합니다. 에 chemorepellent BMP를 포함하여,이 분석은 제인 다드, 토마스 Jessell와 앤드류 럼즈던의 실험실에서 수많은 사람들에 의해 개발되었습니다 (자세한 내용은 응답을 참조)이 분석의 버전은 주요 축삭지도 분자의 reorientation 활동을 증명하는 데 사용되었다 지붕 판 ^3,4 및 Netrin1 ⁵ 소닉 헤지 호그 (쉬) 척수의 바닥 판에 ⁶ chemoattractive 활동.

척수의 지느러미 3 분의 2로부터 2-3 세그먼트로 구성된 Explants은 배아 일 (E) 11 쥐에서 해부하고 입체 콜라겐 젤 ⁷ 양식입니다. E11 등의 척추 explants은 당단백질, Tag1 ⁸ 그들 axonal 표현식에서 확인할 수 있습니다 새로 태어난 commissural 뉴런을 포함합니다. 문화 30-40시간 과정 동안 commissural 축삭의 궤도는 생체내에서 볼 비슷한 시간 코스 이들 지느러미 explants에 recapitulated 있습니다. 이 axonal 탄도는 테스트 조직이나 지느러미 explant의 측면 가장자리 중 하나를 접촉 후보 신호 분자를 표현 COS 셀 집합 중 하나를 배치하여 도전을 수 있습니다. 추가 조직의 주변에 연장 Commissural axons은 내생 지붕 판과 이소성 조직 측면에서 모두 신호의 영향 아래에서 성장합니다. commissural axons 이러한 상황에서 reoriented 아르 정도는 계량하실 수 있습니다. 이 분석을 사용하여 그것은 모두 commissural 궤도 ⁹ 직접이 신호의 필요성뿐만 아니라 commissural axons에게 ^3,4를 방향에 특정 신호의 자족을 확인 할 수 있습니다.

프로토콜

1 부 : Transfected COS 세포 집계의 준비 공중 방울을 사용하여

1. 종자 COS - 7 (COS) 35mm 문화 요리 세포. 그들이 제조 업체의 프로토콜에 따라 Lipofectamine2000을 사용하여 세포에 플라스미드 표현의 80 % confluency, transfect 1μg에 도달했을 때.
2. 방울 매달려 준비하려면, transfection 미디어를 기음과 1ml 1X의 인산 버퍼 솔루션 (PBS)로 transfected COS 세포를 헹굴. 15 분 동안 효소가없는 세포 분리 매체의 0.5ml로 세포를 처리합니다. 반응을 중지 Opti - 멤 + 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 글루타민 (P / S / G) + 10% 태아 소 혈청 (FBS)의 솔루션의 1ml을 추가합니다.
3. 문화 요리의 표면에서 그들을 제거하고 15ml 원뿔 튜브로 전송하는 세포를 씹다. 펠렛 세포에 2000K에서 2 분 동안 회전. Opti - 멤 + 1X P / S / G + 10% FBS의 100μl에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 제거합니다.
4. 접시의 바닥 위에 뚜껑 장소 반전, 35mm 문화 접시 뚜껑의 안쪽에 여러 20μl 방울을 스팟과 세포 집계까지 몇 시간 동안 37 ° C 배양기에서 두십시오.

2 부 : 도설 척수 Explants의 작성

1. 어머니의 자궁에서 E11 랫 배아를 해부하다 필요한까지 L15 매체 얼음 계속.
2. 날카롭게 텅스텐 바늘로 즉시 forelimb 버드 아래의 지역에서, 각 배아의 줄기에서 4-6 세그먼트 섹션을 제거합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여, 4 잘 Nunc 요리를 잘 하나에서 조직 조각을 수집하고 얼음 계속.
3. 모든 배아 세그먼트가 해부를하고있을 때, 1ml L15의 솔루션 + Nunc 요리 잘 순식간에 1mg dispase에 조각을 전송할 수있는 플라스틱 피펫을 사용합니다. 오분 이상없이 오래 실온에서 알을 품다. 이상 dispase있는 조직 조각을 품어하지 마십시오.
4. 부화하는 동안, 페트리 접시와 혼합하는 소용돌이에 L15 약 10ml에 가열 inactivated 정상 염소 혈청 (HIGS)의 0.5ml를 추가합니다. 삼분의 일에 잘 Nunc 요리의 솔루션을 1ml를 전송하고 부화가 끝나면이 솔루션에 조직 조각을 전송할 수 있습니다. 얼음 계속. 참고 : 조직 조각이 시간 동안 얼음에 "나머지"를 허용하는 경우 이후의 절개가 쉬울 것입니다.

파트 3 : 마중물 콜라겐

1. 360μl 콜라겐을 40μl 10X 최소 필수 매체를 추가 튜브를 flicking 또는 간단히 vortexing하여 신속하게 철저하게 섞는다. picofuge에 빠른 속도로 스핀 다운. 이 솔루션은 노란색 것입니다. 최대한 얼음에 보관.
2. (아래 참고 참조) 약간 주황색 콜라겐 솔루션을 설정하는 충분한 0.8M 나트륨 중탄산염을 (NaHCO ₃₎ 추가합니다. 다시 말하지만, flicking에 의해 신속하게 그리고 철저하게 혼합하고, picofuge에 잠시 스핀 다운. 솔루션은 혼합 후 분홍색 남아있을 경우, 당신은 너무 NaHCO ₃ 추가하고 콜라겐의 새로운 튜브로 다시 시작해야합니다.
3. 이 시점에서 콜라겐 솔루션은 준비하는 것입니다. 그것은 얼음에 액체 유지되지만, 실온에 데려왔을 때 약 5 분 (분홍색으로 변했) 내에 고체화됩니다.
4. 4 잘 Nunc 요리의 각 우물에 콜라겐의 스팟 20μl. 당신의 피펫의 팁을 사용하여 작은 "패드"를 형성하는 콜라겐을 확산. 상온에서 설정 콜라겐을 보자.

참고 : NaHCO _3의 정확한 금액은 콜라겐의 각 배치에 대해 titrated해야합니다. 낮은 시작 (11μl)와 솔루션은 오렌지의 약간 그늘 때까지 다음 0.5 - 1μl stepwise를 추가합니다. "오른쪽"금액은 보통 콜라겐 분홍색을 돌려 것이다 NaHCO _3의 작은 금액보다 1ul 적습니다. NaHCO _3의 금액은 선형 위 또는 아래로 확장되지 않습니다.

4 부 : 도설 척수의 Explants과 콜라겐 매트릭스에서 COS 세포 집계와 함께 그들의 위치의 해부

1. 갓 둘레에 텅스텐 바늘과 고급 포셉 한 쌍의 (# 5 # 55)를 사용하여 척수를 둘러싼 mesoderm를 제거합니다.
2. 텅스텐 바늘로 바닥 판에 평행하게 절단하는 것은 신중하게 척수의 배면의 다섯째를 제거합니다.
3. 모서리가로 깨끗하게 가능한 절단하고 있는지 만드는 등의 척추 explant를 이등분하다. 필요한 경우, 모서리를 다시 잘라. 약에 가져온 유리 모세관가 장착되어 입을 피펫을 사용하여 별도의 콜라겐 패드에 각 지느러미 척추 explant을 전송합니다. 지름 0.5mm.
4. 지느러미 척추 explant의 측면 가장자리로 거의 같은 넓이의 정사각형으로 transfected COS 세포의 집계를 잘라.
5. 입 피펫을 사용하여 지느러미 척추 explant과 콜라겐 패드에이 사각형 중 하나를 전송합니다.
6. 입 피펫으로 입 피펫을 사용하여 초과 액체를 대기음. 기음 이상하지 마십시오.
7. 패드에 준비하는 콜라겐의 4μl를 적용하고, 텅스텐 바늘을 사용하여직접 조직을 건드리지 않고 explants 통해 콜라겐 이동합니다. explants을 둘러싸고있는 콜라겐의 텅스텐 바늘을 이동하여, 동양 explants 있도록 COS 세포의 집계가 등의 척추 explant의 측면 가장자리에 인접한입니다.
8. 콜라겐 설정한 후 explants가 콜라겐에 완전히 쌌다되는 것을 보장하기 위해 콜라겐의 4μl의 응용 프로그램을 반복합니다.
9. 조직 문화 후드에서 30-40시간에 대한 Opti - 멤 + 1xP/S/G 문화 0.5ml를 추가합니다.
10. 얼음 접시를 유지, 1xPBS에 0.​​5ml 4 % paraformaldehyde로 45 분간 explants을 수정.
11. 1xPBS의 차단 솔루션 + 0.1 % 트리톤 - X100 1퍼센트의 HIGS (PBTN)의 0.5ml로 두 번 씻으십시오. 4 블록 ° C 시간 중 적어도 몇, 야간 부화가 immunohistochemistry에 의해 처리 후 바람직하고 있습니다.

제 5 부 : Immunohistochemistry에 의해 Commissural Axons의 시각화

1. PBTN에서 차단 후, 포셉 및 48 잘 접시에 장소 4 잘 접시의 explants을 잘라 버릴거야.
2. 각 잘하는 기본 항체의 200μl를 추가하고 4 박 떠나 ° C. commissural axons을 시각화하기 위해 마우스 방지 Tag1 항체의 1시 6분 솔루션을 사용합니다. transfection가 성공 여부를 결정하기 위해, 또한 신호 분자가 에피토프이 태그되었는지 중 신호 분자가 테스트하거나 관련 에피토프되는 대한 일차 항체를 포함합니다.
3. 4 PBTN 5 X 1시간 ° C. 각 샘플을 와시
4. 각 잘하는 이차 항체의 200μl를 추가하고 4 박 떠나 ° C. 안티 Tag1 항체가 기본 항체로 사용했다면, FITC 또는 Cy3 중 하나에 결합 염소 항 마우스 IgM 항체 보조를 사용합니다. 가벼운 민감한 차 항체를 사용하면 FITC 또는 Cy3로 결합하는 경우,이 시점부터는 호일로 덮여 48 잘 요리를 보관.
5. 각 샘플 5 4에서 X 1시간 PBTN 각 ° C. 와시
6. , 3 잘 우울증 슬라이드에 explant을 전송 Vectashield 매체와 coverslip에 마운트를 초과 액체를 제거합니다. 4 ° C 또는 -20 ° C. 중 하나에서 빛이 금고에 저장

6 부 : Explants 대표 이미지

성공적인 실험에서, explant와 C​​OS의 집계가 서로 인접 유지하고 콜라겐이 세트로 떨어져 표류하지 않습니다. axons의 최소한의 전면에 자라난 것이있을 것이다; 중요한 axonal 전면에 자라난가 등의 척추 explant 너무 오래 교양있는 것을 나타냅니다. explant에서 성장하고 더 blebs있을 수 없다, 조직 문화 매체와 직접 접촉으로 온다면 blebbing이 발생합니다.

axons을 방향으로 신호 분자의 기능은 공촛점 현미경을 사용하여 평가됩니다. 축삭의 reorientation의 범위는 COS 세포 집계 ³ 가장 가까운 axons의 reorientation의 평균 각도를 측정하여 계량하실 수 있습니다. 그림 1에 표시된, COS 세포는 표현 myc - 태그 BMP7 (파란색)가 지붕 판의 explant가 commissural axons를 (그림 들어갈 수있는 방식과 유사 BMP7의 원본 (그림 1B)에서 멀리 Tag1 ⁺ commissural axons (녹색)를 방향 1A). 제어 벡터를 표현 COS 세포는 commissural axons ^3,4의 방향에 영향을 미치지 않습니다. 이러한 explants 또한 모터 뉴런과 지느러미 interneurons을 장식 전사 인자 Isl1 / 2 (빨간색)에 대한 항체로 분류되었습니다. 이 결과는 최초로 표시했다는 BMP 가족 mediates의 일원 지붕 판 chemorepellent ³ 활동.

그림 1 : 제발 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

토론

이 분석을 수행하는 성공을 결정하는 중요한 요인이 처음이고, 조직이 너무 연장 기간 동안 dispase로 치료해서는 안됩니다, 이러한 치료는 조직이 매우 끈적되고 및 생존 감소가 발생하게됩니다. 둘째, 콜라겐은 완벽하게 준비하는과 최대한 얼음에 보관해야합니다. 이 설정 시작하면 그것은 처리하기 위해 점점 더 어려워 될 것입니다, 핑크 차례 즉. 세는 텅스텐 바늘은 항상 매우 날카로운 보관해...

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