설치류에서 기본 성인 Fibroblast 문화를 구축

요약

이 문서는 고립과 야생 설치류 동물의 피부와 폐 조직에서 기본 fibroblast 문화의 유지 관리를위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

생물 학적 연구, 기본 세포보다는 암 세포 라인을 사용하는의 중요성이 널리 인식되고 있습니다. 차 전지는 세포주기 조절, apoptosis 연구에서 선호하고, DNA의 수리, 암 세포는이 과정에 관련된 유전자에 돌연변이 들고와 같습니다. 차 전지는 무기한 replicative의 노화 또는 aneuploidization의 발병으로 인해 양식 수 없습니다. 따라서, 새로운 문화 정기적으로 설립해야합니다. 쥐 배아 섬유아 세포의 격리에 대한 절차는 잘 구축지만, 종종 도전을 선물 성인 fibroblast 문화를 격리합니다. 인간의 환자에서 섬유아 세포에 비교하면 인간의 질병의 마우스 모델에서 절연 성인 쥐 섬유아 세포가 원하는 컨트롤 수 있습니다. 임신 여성은 쉽게 얻을 수없는 야생 설치류 작업을 할 때뿐만 아니라, 성인 섬유아 세포는 물질에만 사용할 수 있습니다. 여기 쥐 피부와 폐 섬유아 세포에서 성인의 격리와 문화 프로토콜을 제공합니다. 우리는 실험실 마우스 및 쥐에서 같은 비버, 고슴도치, 다람쥐와 같은 야생 및 설치류에 스무 쥐여 종의에서 섬유아 세포를 분리하기 위해 성공적으로이 절차를 사용합니다.

프로토콜

1. 시작하기 전에

1. 70 % 에탄올과 가위와 집게를 소독.
2. 30 ML의 비커 내부에 작은 자기 활동가를 놓고 두 호일의 레이어, 그리고 압력솥로 커버.
3. 멸균 물 속에 28 Wunsch 단위 / Liberase Blendzyme 3 ML 주식 솔루션을 준비합니다. -20 ° C.에서 0.5 ML aliquots 및 동결 만들기 모든 사용하기 전에 새로운 나누어지는를 녹여. 이 솔루션은 해동 후 흐림 나타날 수 있습니다. 소용돌이 솔루션을 분명히 될 때까지.
4. 세포 배양 미디어를 따뜻하게.

2. 동물 샘플 준비

주의 : 야생 동물은 광견병 바이러스로 병원균을 포함할 수 있습니다. 항상 열려있는 샵스 인식합니다.

1. 동물을 안락사 4에서 시체를 배치 ° C. 동물이 분야에서 수집하는 경우로이 같은 실용적하지 않은 경우 그것은 그러나, 바로 시체를 사용하는 것이 가장 좋습니다, 시체는 24 시간 이내에 사용할 수 있습니다. 24시간 세포 항복 거부 후.
2. (하지 조직 문화 후드에서) 수술 스위트 또는 화학 후드에있는 동물을 해부하다.
3. 암내 지역 암내의 피부가 얇은이므로, 적은 지방이 포함되어 피부 샘플을 수집하는 편리한 사이트이며 털이 덜 조밀한입니다. 70 % 에탄올로 절개 사이트를 청소하십시오. 모피는 에탄올로 적셔 있는지 확인하십시오.
4. 날카로운 메스로 절개 사이트 주변의 털이 면도. 원하는 절개 사이트보다 큰 영역을 쉐이브. 피부에 상처를 최소화하기 위해보십시오. 70 % 에탄올로 영역을 스프레이하고 건조하게.
5. 피부 샘플 소비세에게 약 1cm ² 조각을 수집합니다. 티슈 포셉로 피부를 꼬집어하고, 가위로 잘라. 지방 collagenase의 소화 방해로, 피부와 지방 레이어를 잘라하지보십시오. 폐 샘플을 수집하기 위해 70 %의 에탄올과 가슴 지역을 세척하고, T - 모양 절개하고 피부의 펄럭를 따로 당기는하여 가위로 가슴에 피부를 엽니다. 70 % 에탄올로 열린 근육 영역을 씻고 건조하게. 무균 집게와 가위 (큰 동물 뼈 절단기를 사용)를 사용하여 갈빗대 컷. 내장 오염을 막기 위해 살균 기술을 사용합니다. 동물 모피를 건드리지 악기와 내부 장기를 만지지 마십시오. 무균 집게와 가위를 사용하여 약 1cm ^2의 폐 조각을 잘라 버릴거야.
6. 플레이스 조직 조각 멸균 PBS로 50 ML 튜브에 건조하지 않도록합니다.
7. 에탄올과 조직의 파편 50 ML 튜브의 외부를 세척하고, 조직 문화 후드에게 가져가라.
8. 제대로 동물 시체 처리.

3. 추출 셀

1. 멸균 메스를 사용하여 10cm의 조직 문화 요리에 조직 조각을 전송합니다. 샘플과 너무 PBS를 전송하지 마십시오.
2. 이 scalpels를 사용하여 ~ 1mm의 조각으로 조직을 잘라. 중심부에서 시작 떨어져 당기는 가위 작업을 사용하여 두 날개를 사용하십시오. 조직이 하나 하나를 풀어 보는 게 어때, 잘 고사리 유지. 절단은 피부가 퍼티 유사 충분하면 조각으로 분리되지 않습니다하지만 얇은 스트레치합니다. 폐 조직자를 쉽게이며, 그것은 작은 조각으로 분리됩니다.
3. 메스를 사용하여 멸균 저어 바와 무균 30 ML의 비커에 자른 조직을 전송할 수 있습니다. / 0.14 Wunsch 단위 ML Liberase Blendzyme 3, 1X antimycotic / 항생제와 DMEM/F12 미디어 10 ML과 조직을 절단에 사용되는 접시를 씻어하고, 조직의 파편 30 ML의 비커에 솔루션을 추가합니다.
4. 무균 호일로 비커를 커버하고, 37 품어 ° C, 천천히 저어, 30-90분하십시오. 부화의 길이는 종 및 조직 유형에 따라 다릅니다. 조직을 덮어 소화 안됩니다. 조직 조각은 소화의 끝에 아직도 존재하는 때 최고의 수익률을 얻을 수 있습니다. 피부는 폐보다 소화 오래 걸립니다. 큰 동물의 피부는 소화 오래 걸립니다. 30 분 후 소화하고 매 10 분 확인합니다. 피부 소화가 완료되면 미디어가 흐리고 서로 별도로 피부 조각되고, 조각의 가장자리는 "퍼지"됩니다. 때 적색에서 흰색과 끈적끈적한 섬유 형성 시작 폐 조각 변경 색상 폐 소화가 중지되어야합니다.
5. 대단히 짧은 시간을 휴식하고를 조직 조각을 아래로 포함 Pipet 솔루션입니다. 무균 50 ML 관에 대한 해결책을 전송합니다. 조각은 10 ML의 피펫 절단 및 소화를 통해 쉽게 이동하면 잘 이루어졌다. 15% FBS, antimycotic / 항생제 1X와 함께 따뜻한 DMEM/F12 미디어 10 ML있는 비커에게 3 번 씻어 조직의 파편 50 ML 튜브에 미디어를 추가합니다. 50 ML 튜브와 역전 몇 배 혼합을 닫습니다. 미디어 FBS는 Liberase 소화를 중지합니다.
6. 5 분 스윙 버킷 조직 문화 원심 분리기에서 524g에 스핀. 뜨는을 제거합니다. 15% FBS, 1X antimycotic / 항생제와 함께 따뜻한 DMEM/F12 미디어 10 ML에서 펠렛을 Resuspend. Pipet 정지와 함께조직 조각을 깰 최대 힘.
7. 15% FBS, 1X 5 분 스윙 버킷 조직 문화 원심 분리기에서 524g에 antimycotic / 항생제, 혼합과 원심 분리기와 DMEM/F12 미디어의 다른 30 ​​ML을 추가합니다. Liberase의 흔적을 제거하는 한 더 많은 시간을 반복합니다.
8. 15% FBS와 DMEM/F12 미디어 10 ML에서 펠렛을 Resuspend, 1X antimycotic / 항생제 37에서 조직 문화 인큐베이터에서 10cm 조직 문화 요리와 장소 ° C 5 % CO _2로 전송 3퍼센트 O ₂ .
9. 접시 섬유아 세포 및 미디어 색상 매일 확인합니다. 격리가 성공했다면, 섬유아 세포는 조직 조각에서 크롤 링 플레이트 (그림 1)에 첨부합니다. fibroblast은 2-5 일 이내에 조직 조각을 종료 시작합니다.
10. 노란색으로 미디어의 변화 색면, 이것은 잠재적인 오염이나 세포의 인구 과잉을 나타냅니다. 높은 배율의 현미경으로 번호판을 검사합니다. 박테리아, 곰팡이, 또는 웜 현재 번호판을 (이것은 거의 실험실 동물에 문제가 없다, 그러나 샘플이 야생에서 수집한 경우 발생할 수 있습니다) 폐기하는 경우. 더 오염이 존재 없지만, 미디어가 색상을 변경하는 경우, 이것은 너무 많은 세포 또는 같은 접시에 배치 너무 많은 조직 파편에 의해 발생합니다. 접시의 60 % 이상이 첨부 섬유아 세포에 의해 덮여있는 경우, 접시에있는 미디어를 변경하고 새로운 미디어가있는 새 접시에 조직 조각을 전송할 수 있습니다. 아니 많은 섬유아 세포가 판에 부착된 경우, 미디어를 변경하고 2-4 접시에 조직 조각을 분할.
11. 미디어 이전 변경되지 않았다면 7 일 후, 미디어를 변경하고 새로운 미디어가있는 새 접시에 조직 조각을 전송할 수 있습니다.
12. 추가 7 일 동안 세포와 조직 조각을 품어. 일 14 모두 가능한 섬유아 세포는 조직 조각을 종료합니다.
13. 세포 격리의 시작 부분부터 14 일 후, 기존의 미디어 조직 조각을 폐기 15% FBS, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신이 아닌 필수 아미노산과 5x10 ⁵ 셀 / 플레이트 EMEM에서 새 접시에 세포와 플레이트를 수확 그리고 나트륨 pyruvate 있습니다. EMEM 미디어는 다른 세포 유형을 죽게하거나 proliferating 중지합니다 섬유아 세포의 성장을 지원합니다.
14. 세포 80~90%의 합류에 도달 후, 나중에 사용할 세포의 나누어지는을 동결.
15. 세포 80~90%의 합류에 도달했을 때 5x10 ⁵ 셀 / 슬라이딩 분할 그들에 의해 culturing 세포를 계속합니다.

4. 대표 결과

정상 섬유아 세포가 유명 라고나할까요 (lamellipodia) (그림 2) 대형 세포 수 있습니다. 섬유아 세포는 monolayer 성장. 건강한 성장 문화는 접시의 표면을 통해 강화된 세포를 반올림하지만 플레이트 (그림 3)에서 분리하지 인정 M 단계에서 10-10% 세포를 포함하고 있습니다. 일반적으로 5x10 ⁵ 세포와 씨앗 10cm 요리 3-4 일 이내에 합류된다. 복제 시간은 종 사이에 크게 차이, 그리고 긴 쥐 종 ¹ 일부 큰 수 있습니다. 세포들이 G1 단계에서 증식을 체포 접시를 채울 때. 섬유아 세포의 전형적인 합류 플레이트는 세포 (그림 4)의 단단히 포장 레이어를 포함하고 있습니다. 세포가 90 % 합류에 도달하면 그들은 분리를위한 준비가되어 있습니다. 원하는 경우, 전지가 일반 매체의 변화 (한 일주일에 두 번)와 오랜 기간 동안 체포 합류 접시에 유지하실 수 있습니다.

그림 1. 마우스 피부 (A)와 폐 (B)에서 Fibroblast 절연. 미디어 데이 7 사진을 찍을하기 전에 무소속 세포와 이물질을 제거하기 위해 변경되었습니다.

그림 2. 마우스 폐 섬유아 세포.

그림 3. 10X 확대 사진 M - 단계에서 세포를 포함하는 마우스 섬유아 세포의 분야.

그림 4. 10X 확대 사진 마우스 섬유아 세포의 합류 접시.

토론

일반 기본 섬유아 세포 생물 학적 연구에 설립 암 세포 라인에 대한 훌륭한 대안을 제공합니다. 섬유아 세포의 중요한 이점은 그들이 oncogenes 및 종양 진압에 변이를 수행하고 그대로 세포주기 검문소를 유지하지 않는 것이있다. 이것은 정상적인 섬유아 세포 세포주기 조절, DNA 수리 및 apoptosis의 연구 선호하는 시스템이 있습니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 절연 및 기본 섬유아 세포의 유지 보?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 media	Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic	Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media	ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel	Multiple suppliers
Three Gas Control incubator	Forma or Heraeus