인슐린 주입 및 성인에서 인슐린 민감도를 측정하는 Hemolymph 추출 Drosophila melanogaster</em

요약

보존 인슐린 신호 전달은 과일 파리에서 찾은 경로 Drosophila melanogaster이 유기체 유형 II 당뇨병을 포함하여 신진 대사 장애를 모델링에 대한 잠재적인 도구를합니다. 이를 위해서는 효과적으로 성인 비행에서 주변 포도당 처리에 체계적 인슐린 작용을 측정하는 생리 assays를 확립하는 것이 중요합니다.

초록

보존 영양 감지 메커니즘은 펩티드가 발달 애벌레 단계 ^1,2 중에 포도당 항상성을 유지하기 위해 각각 포유류의 인슐린과 글루카곤, 기능과 유사한 포유류와 과일 날아 사이에 존재합니다. 대부분 사후 mitotic 성인 파리에서 연구가 세포 (IPCs) ^3를 생산 인슐린과 같은 펩티드 (ILP)의 유전자 절제의 결과로 포도당 항상성의 섭동을 공개했습니다. 따라서 성인 과일 파리 2 형 당뇨병을 포함하여 신진 대사 장애에 적합한 유전자 모델 시스템으로 큰 약속을 잡아. 추가로 과일 파리 시스템을 개발하려면, 포유류에서 포도당 내성과 인슐린 민감도를 측정하는 데 사용되는 비교 생리학 assays 설립해야합니다. 이를 위해, 우리는 최근 성인 비행에 경구 포도당 내성 응답을 측정하는 소설 절차를 설명하고 포도당 항상성은 ^4,5 유지 성인 IPCs의 중요성을 보여주었다. 여기, 우리는 인슐린 주사 ⁶ 이전에 설명한 절차를 수정하고 성인 비행의 말초 인슐린 민감도를 측정하는 소설 hemolymph 추출 방식으로 결합합니다. 유니 클리 우리 프로토콜은 인슐린 주사, 인슐린 신호 돌연변이 성인 비행에서 포도당 내성과 인슐린 민감도에 영향을 미치는 잠재적인 개입을 특징으로이 가능하게 방법론에 주변 포도당 부하를 처리하는 성인 비행 능력의 직접적인 생리적 측정이 가능합니다.

프로토콜

1. 인슐린 솔루션 준비

1. 0.01 MG / ML의 농도를 달성하기 위해 PBS에 인슐린을 용해하여 새로운 소 인슐린 솔루션을 준비합니다. 인슐린 / PBS 및 제어 PBS 솔루션 모두 사출 절차를 통해 얼음에 보관해야합니다. 이러한 솔루션은 0.5 % (V / V) FD & C 블루 번호와 함께 준비한다. 1 식용 색소.

2. 니들 준비 및 설정 사출

1. ; 당겨, 210, 속도, 100, 시간, 200 (100ms) 열, 345 : 풀러 설정이 주사에 대한 충분한 품질의 바늘을 생산 따라 micropipette puller.The를 사용하여 모세관 유리 바늘을 준비합니다. 갓 뽑아 바늘은 Kimwipe 조직을 통해 팁을 눌러 무딘해야합니다. 이 둔화 과정은 길쭉한 높은 저항 팁을 제거하고 큰 기공 직경 stouter 팁을 생산하고 있습니다.
2. 팁 - 최대 인슐린 / 혼자 PBS 용액 또는 PBS를 포함하는 microcentrifuge 관에 무딘 바늘을 놓으십시오. 각 바늘의 백업 작성의 작업 결과를 모세. 더 파편이나 공기 방울이 끝에 표시되지 않도록 stereomicroscope 아래 바늘의 팁을 관찰. 정상적으로 입력되지 않은 바늘 폐기하십시오.
3. 바늘 끝이 stereomicroscope를 통해 볼 수 있도록 micromanipulator로 수동 microinjector 니들 홀더 및 위치 바늘 홀더에 가득 바​​늘을 삽입합니다. microinjector의 주사기에 플런저에 연결된 수동 microinjector 마이크로 미터 손잡이를 돌려하여 바늘의 유체 열을 긍정적인 압력을 적용합니다.
4. 유체 변위 위해 충분한 압력을 확인은 바늘 끝에 Kimwipe를 감동 유체 흐름을 확인하여 적용되었습니다.
5. 일단 바늘이 부착 분명 테이프와 바늘 샤프트로, 분사에 대한 보정 차트 준비하고, 20X 배율 아래 stereomicroscope을 통해 초점에 바늘 끝을 가지고있다.

3. 준비 플라이

1. 텐 일 된 암컷 파리는 분사 실험에 사용됩니다. eclosion 24 H 내에 파리를 수집합니다. 남성 여성과 장소 파리가 밖으로 표준 또는 치료 식단을 포함 유리병에 가스 패드에 humidified CO _2, 정렬과 함께 파리를 마취. 10 일간 실험 다이어트에 대한 여성의 파리를 유지합니다.
2. 실험 다이어트에 eclosion 분리 다음 열째 날, 송금은 2 % 한천의 5 ML 플러그인을 포함하는 튜브 자신의 음식을 함유 튜브에서 파리와 12-16 H. 그들을 굶어
3. 인슐린 주입하기 전에 1 시간 10 % 포도당 젖었 필터를 포함하는 튜브에 굶주려 파리를 전송합니다.
4. 간단히 포도당 수유 후 humidified CO _2와 함께 파리를 마취 후 차가운 얼음에 그들을 고정.

4. 사출 절차

1. 부드럽게 잘 포셉 한 쌍의와 추위에 고정 비행을 파악하고 끝은 파리의 흉부의 왼쪽의 앞쪽에 지역에 인접한 있도록 그것은 바늘 끝 가까이에 잡아. stereomicroscope 아래의 초점에 바늘 끝과 파리의 흉부를 모두 가져와.
2. 바늘 끝이 파리의 흉부 (그림 1)의 왼쪽 prescutum 지역의 융기의 중심을 접촉 있도록 부드럽게 바늘 끝쪽으로 날아 이동합니다. 파리가 올바르게 지향하고 바늘 끝에 부합되면, 바늘은 prescutum의 중심을 impales 있도록 바늘에 비행을 사전에 계속.
3. 유체의 0.1 μl가 비행에 주입되어 때까지 microinjector의 micromanipulator 손잡이와 주사기의 플런저를 발전하여 필요에 따라 긍정적인 압력을 적용합니다. 파리의 hemocoel로 유체의 흐름은 앞쪽에 흉부의 왼쪽에 파란색을 가르친다합니다. 때때로 하나는 취소 및 바늘 팁 차단을 이동시키다 및 유체 흐름 수 있도록 여러 번 사전해야합니다.
4. 주입 파리 hemolymph 추출하기 전에 지정된 시간이 지점에 대한 2 % 한천 튜브 안에 복구하도록 허용합니다.

5. Hemolymph 컬렉션

1. 간단히 원하는 사후 분사 시간 지점과 위치에 humidified CO _2와 함께 파리를 마취 등의 사이드 다운 CO ₂ 패드의 표면에 부착된 양면 테이프의 각 비행. 정렬 헤드 캡슐도 행으로 파리를 마련. 하나는 테이프 접착제로 자신의 날개를 눌러 고정을 위해 손질 나무 작은 주걱 스틱을 사용할 수 있습니다.
2. 일단 파리가 테이프로 고정 좋은 포셉 각 비행의 코을 파악하고 머리 캡슐의 앞에는 스테레오 현미경을 통해 볼 수 있도록 부드럽게 비행의 후부 다음 복부 및 지역으로 그것을 끌어 수 있습니다.
3. 다른 손과 위치에 코를​​ 들고 있지만, 펑크 단지 ptilinal 봉합 위의 헤드 캡슐의 중심은 날카로운 텅스텐 바늘 (그림 2)를 사용. 그것이 머리를 캡슐 반대편을 통해 바늘의 팁을 펀치와 이후 C를 잃고 쉽게로서 하나는 너무 멀리 바늘을 삽입하지 않도록주의해야합니다hemolymph 흐름 ontrol. 찔린 모든 hemolymph를 수집하기 전에 사출 그룹에 날아갑니다.
4. 머리 캡슐가 구멍되면 부드럽게 파리의 복부에 압력을 적용하는 손질 나무 작은 주걱 스틱을 사용합니다. 그것은 당신이 압력을 적용으로는 복부 측면에 붙어 있도록 동안 파리를 롤 도움이 될 수 있습니다. 이 절차는 머리 캡슐 찔린 사이트에서 hemolymph의 비말을 생산합니다.
5. 머리 캡슐 찔린 사이트에서 신흥 hemolymph 비말에 1μl microcapillary 튜브의 한쪽 끝을 터치. hemolymph는 모세관을 통해 튜브를 입력합니다. 졸업 볼륨 차트에 대한 microcapillary 튜브 내의 유체 열을 선택하여 수집한 hemolymph의 양을 확인하고 기록합니다.

6. Hemolymph 포도당 결정

1. microplate 우물은 무한 포도당 시약 100 μl를 포함하는으로 hemolymph 샘플을 추출. hemolymph 샘플을로드하는 동안 얼음 접시 보관하십시오.
2. 50mM, 25mM, 12.5mM, 6.25mM과 3.125mM에서 별도로 1 μl 포도당 주식 솔루션의 각로드하여 표준 곡선을 설정합니다.
3. 37 샘플을 품어 ° C를 10 분.
4. 340 nm의 흡광도에서 감지.
5. hemolymph 볼륨에 대한 계정을 수집하여 알​​려진 포도당 농도와 표준 곡선에 따라 샘플 포도당 농도를 결정한다.

7. 대표 결과

전형적인 인슐린 내성 반응은 포도당 수준을 순환의 드롭 15 분 후 주사를 감지 인슐린 주입 파리에서 감지됩니다. 대조적으로, 이러한 반응은 PBS 주입 파리 (그림 3)을 볼 수 없습니다. 주변 포도당 처리에서이 반응은 인슐린 주입에 계속 삼십분 이후 주사까지 날아. 우리는 정기적으로 각 사출 그룹에 4-5 파리 당 hemolymph의 0.2-0.5 μl 압축을 풉니다. 세 사출 그룹은 각 실험에 포함되어 있습니다.

그림 1. 주사 바늘을 ​​삽입 사이트 (Demerec 1950에서 수정) ^7를 보여주 Drosophila의 흉부의 왼쪽 측면. 흉부의 왼쪽의 앞쪽에, 등의 지역에 prescutum의 중심을 통해 바늘을 삽입합니다.

그림 2. hemolymph 추출 (Demerec 1950에서 수정) ⁷ 바늘 위치를 보여주는 Drosophila 머리의 전두엽 볼 수 있습니다. 찔린 단지 ptilinal 봉합 위의 헤드 캡슐의 중심에 가늘게 날카롭게 텅스텐 탐침과 함께 머리를 캡슐.

그림 3. 컨트롤 성인에서 검색된 전형적인 인슐린 내성 응답이 빠르다. 컨트롤 w ¹¹¹⁸ 파리는 소 인슐린 (PBS 1 NG) 또는 PBS에만 주입했다. 복제 그룹에 날아 그 다음 0, 15 또는 30 분 순환 포도당 수준 복구할 수 있었다 것은 측정했다.

토론

이 보고서에 설명된 기술은 Drosophila의 hemolymph 구성에 감지 변경의 결과로 생리 과정을 조사하는 연구에서 잠재적으로 유용합니다. 이러한 방식으로 주입하고 hemolymph 컬렉션을 결합함으로써, 특정 실험 치료 또는 조작의 즉각적인 생리학 관련 효과를 확인할 수 있습니다. 잘린 ^2와 관련된 이전의 기술을 통해 hemolymph 수집이 "방혈"기술의 주요 장점은 직감 contents.If 치료가 때...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 / 장비 이름	회사	카탈로그 번호
보빈 인슐린	시그마	I5500
인피니티 포도당 시약	써모 일렉트론 주식 회사	TR1541
수동 microinjector	서터 악기
P - 87 Flamming / 브라운 micropipette 풀러	서터 악기
싱글 배럴 borosilicate 유리 모세관	AM 시스템	626000
FD & C 블루 제 1	매코믹 & 컴퍼니
1 μl microcapillary 튜브	드루먼드
쓰리 축 수동 micromanipulator 및 기지	세계 정밀 계측기