태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

요약

에탄올로 유도된 발달 손상의 분자 메커니즘을 이해하려면, 우리는 에탄올 노출 zebrafish 모델을 개발하고 에탄올에 노출된 후 발생하는 신체적, 세포 및 유전자 개조를 연구하고 ¹. 그러면 잠재적인 개입을 찾아 신속하게이 동물 모델에서 그들을 시험을 추구합니다.

초록

태아 알코올 증후군 (FAS)은 에탄올에 배아 노출 심각한 징후이다. 그것은 얼굴과 섞여 및 손상된 뇌 발달로 인해 정신 지체를 포함한 장기에 특색있는 결함과 함께 소개합니다. 태아 알코올 스펙트럼 장애 (FASD)는 모성 알코올 소비로 인해 발생하는 선천적 결함의 연속체를 충당하기 위해 사용되는 용어이며, 미국에서 태어난 어린이의 약 4 %에 발생합니다. 어린이 베어링 연령 여성의 50 %가 알코올의 소비를보고, 모든 임신의 절반은 계획되지 않은 있기 때문에 무심코 노출은 지속적인 문제 ^2입니다. 최고의 에탄올에 의해 생산되는 피해를 이해 플러스 잠재적인 개입을 테스트하기위한 모델을 생성하기 위해, 우리는 zebrafish 배아를 사용하여 발달 에탄올 노출 모델을 개발했습니다. Zebrafish는 teratogen 연구 ^3-8 이런 종류의 이상적입니다. 각 쌍은 다음 성인을 해치지 않고 수집될 수 계란 수백을 낳는생선. zebrafish 배아가 투명하고 쉽게 얼룩의 번호를 몇 군데하실 수 있습니다. 이러한 배아 분석 에탄올 제작한 총 발달 결함이 인간의 선천성과 일치하는 기간 및 응용 프로그램의 다른 복용 및 시간에서 에탄올에 노출 후. zebrafish FAS 모델을 연구하고 조작하는 데 사용되는 기본적인 방법은 다음과 같습니다 여기서 설명했다.

프로토콜

1. 태아의 에탄올 처리

1. 야생 형 matings에서 파생된 Zebrafish 배아는 28에서 자랐던 배아 물 5 ML에서 ° C에서. (밀리 Q 60 밀리그램 / 패 인스턴트 오션과 물). 야생 형 배아의 다양한 변종이 노출 ⁹ 에탄올 위해 약간 다른 공차 있습니다.
2. 에탄올에 대한 노출은 최대 24 시간 펄스로, 시간의 원하는 길이에 대한 돔 무대 (~ 4.3 시간 포스트 기름지게, hpf)에서 시작 됐습니다. 이것은 시작 단계 gastrulation에 직전 포유 동물 배아의 주입 단계와 대략적으로 비슷합니다. 에탄올 농도는 0.2 %에서 -2.5 %, 볼륨 / 볼륨 범위를 사용했습니다. 검사 물에 솔루션의 25-50 사이의 %는 개발 배아 ^{10, 11에} 끝나는 것을 증명하고있다. 태아도 시간의 원하는 길이에 대해 28 ° C에서 유지 관리됩니다. 에탄올 노출의 원하는 길이 후, 에탄올 - 물 용액이 제거 및 교체 정규 zebrafish 물 세 세차장와 함께 구경이 유지됩니다시간의 R 원하는 길이. 결함의 특이성은 발병, 복용량 및 에탄올의 펄스 길이의 시간에 따라 달라집니다.

2. 원위치 하이브리드화, 항체, 그리고 연골 염색법의 RNA에 대한 태아의 수집,

1. qPCR에 대한 mRNA를 수집하려면, 연령 일치하는 배아는 eppendorf 튜브에 수집됩니다. zebrafish 물의 제거 후 TCEP과 용해 버퍼가 추가됩니다. 동력 pulverizer는 물리적으로 용해 용액의 배아를 떼어 놓다하는 데 사용됩니다. 이것은 그때 어떤 undissociated 큰 조각을 제거 preclear 칼럼을 통해 전달됩니다. 결과 솔루션은 용해 과정에서 릴리스된 모든 macromolecules가 포함되어 있습니다. RNA는 다음 세차장 및 DNAse 치료 뒤에는 칼럼에서이 솔루션을 실행하여 추출됩니다. 용리 그런 다음 물 또는 제조 업체 (5'-프라임)에 의해 제공 용출 용액을 사용하여 수행됩니다. RNA은 마이크로에서 qPCR에 대한 표준 기술을 사용하여 cDNA로 변환하거나 사용할 수 있습니다배열 분석.
2. 원위치 하이브리드화 및 항체 염색법, 6-24에서 배아에 들어 hpf은 4 ° C.에 밤새 4 % paraformaldehyde에서 해결되었다 이것은 PBS에서 3 세차장 + 0.1 % 십대 초반 (PBT), 같이 가겠다는에서 배아를 유지하기 위해 다음됩니다. 태아도 다음 세 메탄올 일련의를 통해 전송됩니다 PBT들은 -20 ° C.에 저장될 수있는 시점에서, 100 % 메탄올로 세척 이러한 배아는 원위치 하이브리드화 또는 항체 염색법에 사용할 수 있습니다. 일부 항체는 메탄올 처리 후, 이번 경고가 고려하여 특정 항체 그것 메탄올 처리 후 작동하는지 확인하기 위해 테스트를해야 작동하지 않습니다.
3. 연골의 염색법의 경우 배아는 5 ~ 6 일 게시물 기름지게 (dpf)에 제기해야합니다. 그들은 다음 4에서 하룻밤 사이에 4 % paraformaldehyde에서 해결된 ° C는 PBT 3 세차장으로 따라갔다.

3. 평가 에탄올을 유발 유전자 발현 변경 및 발달 결과들

1. 유전자 발현 수준이 변경된 것을 확인하려면, 대상 유전자는 모두 qPCR 의해 원위치 하이브리드화에서 검사합니다. qPCR 그 다음 세 별도의 생물 학적 샘플을 사용하여 유효성을 검사할 통합의 DNA 기술 (IDT) 소프트웨어 설계 primers를 사용하여 이루어진다. 일단 primers가 확인되었으며, qPCR는 수집 RNA 샘플에서 생성된 cDNA에서 수행됩니다. 각 예제는 세중의에서 실행됩니다. PCR 반응은 여러 가지 빛깔의 감지 시스템과 채도-4 PCR 기계 (BioRad) 또는 이와 유사한 PCR 기계에서 플래티넘 SYBR 녹색 qPCR 슈퍼 믹스 (Invitrogen)를 실행하고 있습니다. 심문하는 유전자 이외에, 그것은 primers 세트 컨트롤이 cDNA 또는 RNA 준비의 작은 차이의 균형을 위해 사용되는 것이 중요합니다. 우리 zebrafish 배아 들어, gapdh를 사용 5'GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3 '과 5'TTGCACCACCCTTAATGTGA3'. 분석중인 유전자 그러면 유전자 발현의 상대적인 양을 정함은 2 Pfaffl 메서드 편차를 사용하여 계산됩니다 gapdh 수준으로 정규화 - CT, 야생 유형 ^{12 ~} 실험 상대의 배 차이 같은 데이터가 표시됩니다. 일반적인 계산은 모든 유전자가 모든주기 위해 두 DNA를 복제하고 있다고 가정하며 따라서 정수 "2"이상의 전력 계산으로 표현, 기준 유전자의 변화를 통해 실험적인 유전자의 변화의 비율로 데이터를 표현 완벽한 PCR 반응에서 볼주기에 따라 DNA의 두 배로의 효율성이되는 것입니다. Pfaffl 메서드는 선택한 PCR primers에 대한 진정한 효율성을 생성한 실험자와 일반 "2"를 대체합니다. 그것은 PCR 반응의 차이보다 정확한 반영을 반영합니다. 전체 수식은 다음과 같습니다
   

   (실험적인 유전자의 효율성) (처리 샘플 컨트롤 샘플 CT-CT)

   -------------------------------------------------- -----------------------------------

   (참고 유전자의 효율성) (CT의컨트롤 샘플 - 시료의 처리 CT)

2. 원위치 하이브리드화의 내용은 digoxigenin은 (발굴) - 라벨 riboprobes는 관심 유전자의 일부를 포함하는 plasmids에서 구축하고 있습니다. 연령 일치하는 배아가 표준 조건 ¹³ 사용 riboprobes에 노출 및 컬러 반응 (NBT / BCIP)을 사용하여 레이블 riboprobes의 위치를 수 알칼리 인산 분해 효소에 결합 백신 발굴의 항체를 사용하여 감지됩니다. 태아도 그때 Leica 해부 현미경 (그림 1B-G)를 사용하여 시각 있습니다.
3. morphogenic 발전을 평가하기 위해 배아가 원하는 시간에 수집하고 해부 현미경으로 검사합니다. 체절 형태의 경우, 라이브 배아는 ¹⁴ 군데있다. 상호 눈의 거리와 몸 길이의 경우 배아는 PFA에서 수정되었습니다. 모든 경우에있어서, 원하는 지역의 이미지는 어도비 포토샵 softwar를 사용하여 촬영한 고정 배율 및 측정의 해부 현미경에 캡처되어E ^10,14.
4. 애벌레 zebrafish의 개발 연골 구조에 대한 치료의 효과를 조사하기 위해, 우리는 Alcian 블루 염색법을 사용합니다. 몇 시간이나 야간 20 % 빙초산 (산성 알코올) : 고정 zebrafish 애벌레는 80 % 에탄올에 녹아있는 Alcian 푸른 솔루션으로 취급됩니다. 애벌레는 1 %의 코이에 전송되기 전에 산성 알코올의 몇몇 세차장에서 destained됩니다 안료 세포의 더욱 지워 위해 3 % 과산화수소 용액. Zebrafish는 연골 구조를 보여줄 오래된 최소 4 일이 될 필요가 있으며 이들은보다 5 ~ 6 일이 지나면 물고기는에 정의됩니다.
5. 살아있는 배아에서 세포 사망은 Acridine 오랜지 (AO)를 사용하여 평가됩니다. AO는 살아있는 세포에 대한 세포 투과되지이며, apoptosis과 괴사를 겪고 포함 훼손 세포막과 세포의 DNA에 바인딩합니다. 생활 배아는 PBS 3 세차장 다음, 1 시간 동안 PBS에 5 밀리그램 / ML AO와 incubated있다. 태아도 다음 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 디지털 Z-백산이거야 이미지 합성을 만들 결합됩니다.

4. Zebrafish 배아를 조작

1. 에탄올 노출에 의해 감소​​되는 유전자의 식별 후, 부족한 부분이 유전자를 대체하기위한 mRNA의 분사를 사용하여 그들을 바꾸려고하는 것이 가능합니다. 뒤덮힌 mRNA는 제조 업체 지침 (mMessage 기계, 응용 Biosystems)에 따르면 시험 관내 전사 키트에서 RNA의 효소를 사용하여 선형의 DNA plasmids에서 베꼈는데됩니다. 25-200 사이 RNA의 PG / NL은 0.1 M KCl의 솔루션, 1-2 세포 단계 zebrafish 달걀에 주입된다. 태아도 후 (그림 5) 위에서 설명한대로 에탄올로 치료되기 전에 복구하는 데 사용할 수 있습니다.
2. 에탄올 노출에 의해 증가하고있는 유전자 사본의 경우, 그들은 "노크 다운"안티 센스 morpholino 기술을 사용하여 축소하거나 할 수 있습니다. 안티 센스 morpholinos (아모스)은 회사의 유전자 도구에 의해 디자인, 그리고 단백질로 RNA의 번역을 차단하거나, blo있다실험적인 필요성에 따라 RNA의 CK는 성숙과 접합. morpholinos의이 작업은 타겟 유전자, 그들이 가능한 경우 anitibodies를 사용하여 측정할 수 적자에 대해 활성 단백질의 양을 제한합니다. RNA의 접합에 morpholinos의 효율성 spliced​​ 및 unspliced​​ 성적의 상대적 양을 감지하는 RT-PCR을 사용하여 측정할 수있다. morpholino의 Titrating 것은 선량 종속적인 활동을 ¹⁵ 발생할 수 있습니다. 아모스는 Danieau 솔루션에서 작업 농도 (NG 농도를 PG를 titrated) (58 MM NaCl 0.7 MM KCl, 0.4 MM MgSO _4, 0.6 MM 칼슘 (NO _{3) 2,} 5 밀리미터 HEPES, 산도 7.6)으로 희석한다. 사출은 배아는 위의 치료를 에탄올에 노출되기 전에 개발을 허용하는 다음 1-2-세포 단계에서 이루어진다.

5. 대표 결과

관련된 발달과 유전적 결함의 수가 에탄올 결과에 Zebrafish 배아 노출phenotypes는 다른 척추 동물에서 발견. 우리는 notochord (데이터가 ¹⁴ 보이지 않음)를 포함하여, 축방향 조직의 비정상적인 발전을 문서화했습니다. 에탄올에 의해 생산된 발달 지연은 분명히 단축하고 때때로 중단 notochord (데이터가 ¹⁴ 보이지 않음)로 이어지는, 올바른 notochord 신장의 장애로 안내합니다. 이것은 초기 지연과 notochord 결함 가능성이 경과 컨트롤에서 본 것처럼 그들의 강한 셰브론 모양을 잃었 somites에서 나중에 이상 (그림 2)에 부분적으로 주도하고, 본 phenotypes의 특징 U 형 somites에 가까이있다 음파 신호가 ¹⁴ 감소합니다. somites의 각도가 표준 소프트웨어 및 92.1에서 ± 4.6 ° 치료 컨트롤에서 122.6로 ± 6.6 ° 에탄올 취급 배아 (P <0.001)의 각도 증가를 사용하여 측정할 수있다.

downstrea있을 에탄올 노출의 또 다른 결과초기 발달 지연과 나중 notochord 결함의 상부 배아의 단축 길이 (그림 3)입니다. 심지어 배아는 계좌로 에탄올 노출에 의해 생산되는 곡률을 측정하기 위해, 에탄올 노출 (3E ¹⁴ 그림) 배아에 노출되었다 에탄올의 복용량에 따라 달라집니다 단축 트렁크로 안내합니다. 이 조사는 zebrafish 모델은 인간의 선천성 이상에 대한 이해를위한 관련성을 제안, 개발 ^{16, 17} 중 에탄올에 노출된 어린이에서 발견 prepuberty 짧은 성장의 지속성과 비슷합니다.

FAS의 고전적인 특징 중 하나는 낮은 턱, 작은 눈 개방, 그리고 부드러운 philtrum 포함한 고전 facies입니다. 대부분 이러한 기능의 대부분은 중간선 조직의 감소와 관련있다. 이것은 심각한 에탄올 노출 synopthalmia 및 cyclopia 포함한보다 발음 phenotypes,로 연결되는 동물 모델에서 증명되었습니다. 언제 엑스포에탄올의 증가 복용에 zebrafish의 배아를 부르 intraocular 거리 (IOD)는 인간의 출생 결함의 특성과 일치합니다 (그림 4) 복용에 의존 방식으로 줄어 듭니다. Cyclopia은 매우 다량으로 복용과 함께 발견되지만 낮은 복용이 동물 모델은 중간선 얼굴 개발에 ^10의 유사한 결함을 갖고 제안, IOD (그림 4)에서 상당한 감소를 생산 않습니다.

에탄올 노출에 의해 생산 몸과 얼굴 모두에서 결함의 기본 메커니즘을 이해하려면, 우리는 개발 초기에 발생하며이 합리적으로 나중에 발달 결함에 기여할 것으로 기대 수도 유전자 발현 변화를 설립 모색하고 있습니다. 우리는 두 가지 방법으로이 작업을 수행, 배아에서 mRNA의 추출 컨트롤 (그림 1A)에 비해 에탄올 취급 배아의 유전자 발현의 수준의 양적 평가 수 있습니다. 또한 현장에서 수행할 수하이브 리다이 제이션에 관계없이 신호 (그림 1B-G ¹⁸⁾ 감소 여부, 유전자의 패턴을 볼 수 있습니다. 이 예제에서는 누구의 표현 에탄올에 노출 후 감소 둘이 같이 유전자는 gli1 및 six3b가 표시됩니다. 우리가 six3b위한 원위치 패턴으로 검사했을 때, 우리는 에탄올에 노출된 태아에서이 유전자의 표현의 공간적 범위 (그림 1 EG)의 감소를 찾았지. 유사한 감소는 유전자 gsc (그림 BD)에서 발견되었다. six3b 및 gsc 모두 craniofacial 중간선 조직에 공헌하고 운명 티슈로 표현됩니다. 그래서 8 hpf에서 이러한 유전자의 감소는 나중에 그림 4와 같이 발견 IOD의 감소와 일치합니다.

에탄올의 영향을받는 유전자가 발견되면, 그들의 표현이 증가 또는 감소시킬 수있는 의해 메커니즘이 있습니다. 이 특정 EXA에서mple, 우리는 qPCR에 의해 감소되는 두 유전자 (gli1 및 six3b) 보여주었다. 우리는이 유전자 변화를 반대하는 것은 결과를 향상시킬 수 있는지 확인하기 위해 mRNA를 투입하기로 결정했습니다. 본 실험 대신 gli1 주입으로, 우리는 쉬, gli1 수준을 증가 리간드를 투입하기로 결정했습니다. six3b 들어, six3b 자체를 주입 수 있었다. 우리는 six3b합니다 (데이터가 표시되지 않음) 주입하지만, 근본적으로 보완 쉬 주사 (그림 5)와 zebrafish 배아의 총 결함을 구조할 수 있었다 아무런 변화가 없습니다.

그림 1. 에탄올 노출 초기 패턴과 선택된 발달 유전자의 유전자 발현 수준을 변경합니다. 8hpf에서 배아의) qPCR 결과입니다. 이 유전자에 대한 결과가 표시됩니다 six3b 및 gli1합니다. 결과는 별도의 세 가지 실험을 평균으로 표시그리고 표시된 에탄올의 복용량은 2.5 %이다. 두 유전자가 제어 (T-테스트, P <0.05)에서 중요하다 방식으로 감소됩니다. 8 hpf의 zebrafish의 배아의 원위치 하이브리드화에서 BG). gsc 및 six3b 패턴이 모두 컨트롤에 비해 현재의 시점에서 변경될 수 있습니다. (Loucks 외. 2007 년부터 허가 수정).

그림 2. 체절 개발은 대우 배아로 변경됩니다. 체절 구조와 앵글은 48 hpf에서 검사합니다. 제어 배아에서 () somites는 셰브론 형상과 날카로운 각도로되어 있습니다. 에탄올 노출 zebrafish는 더 또는 U 형 somites하고, 덜 날카로운 각도로되어 있습니다. (Loucks 및 Ahlgren 2,009의 허가와 함께 수정).

그림 3. 에탄올 치료는 크게 zebrafish에서 몸 길이를 줄입니다.치료 및 에탄올 노출된 태아의 길이는 5 일 postfertilization에서 측정되었다. 길이가 크게 감소 (ANOVA, P <0.001) 모든 치료 배아에서 본되었다. BD. 큰 감소는 2.0 %와 2.5 %의 에탄올과 함께 복용한 배아 모습을 본 반면, 1.0 % 및 1.5 %의 에탄올로 치료 배아의 전체 길이는 약간이지만 상당한 감소가 발생했습니다. 각 클러치의 크기 차이에 대한 제어하려면 E., 각 실험의 제어 배아는 100으로 정규화하고, 형제 취급 배아는 100의 비율로 표현되었다. (Loucks 및 Ahlgren 2,009의 허가와 함께 수정).

그림 4. zebrafish 배아에서 intraocular 거리 (iod)의 감소에서 에탄올 노출 결과. ) 배아의 정면 전망 정상과 융합된 눈 phenotypes를 보여줍니다. 나) 에탄올의 다양한 복용은 gastrulation의 고해상도 동안 3 시간 동안 실시물고기는 24 시간 후에 검사하는 경우에 ults이 iod 감소. 융합된 눈과 cyclopia은 (2.4 %) 검사 높은 복용량에서 볼 수 있습니다. *이 컨트롤에 비해 iod에 큰 감소를 나타냅니다. (Ahlgren 2004에서 허가 수정).

그림 5. 쉬 - N 개의 mRNA 주입은 zebrafish의 에탄올 노출에 의해 생산되는 총 결함을 구출. 하나, 둘, 세포 배아는 100 PG / NL 쉬 - N의 mRNA와 주입된 배아의 절반은 4.3-24 hpf에서 표준 에탄올 접종에 노출되었다 주사되었다. 태아은 5 dpf에서 분석했다. 2.0 %의 에탄올로 치료 태아는 dorsally 짧은 꼬리, 난 모양 somites 및 cyclopia 포함한 시력 결함 구부러져냅니다. 이러한 phenotypes의 구조는 주입된 배아 (93 %)의 76분의 71에서 볼 수있다. 이러한 배아에서 몸은 똑바로, somites는 셰브론 모양입니다 있으며, 눈은 완전히 구분됩니다.

토론

방법은 여기서 설명하고 표시된 결과는 zebrafish가 발달 결함을 심문하는 데 사용할 수있는 방법 중 팁을 보여줍니다. 때문에 태아의 접근으로, 각 클러치, 그리고 결과의 높은 재현성을 위해 알을 낳았의 높으면 이러한 척추 동물은 teratogenic 연구에 이상적입니다. 물고기는 또한 특정 유전자 또는 이익 ¹⁹ 경로에 대한 시각적 기자로 사용하는 형광 분자를 포함하도록 조작할 수 있습니다. 에탄올 연구에 사용되는 접종은 포유류의 혈중 알코올 농도 수치에 비해 상당히 높은 나타납니다. 그러나 이러한 수치는 물 속에 존재하는 것을 반영하고, 모든 에탄올의 대부분은 태아에게 전달됩니다.

함께 촬영, 설명 그리고 위의 설명된 방법은 zebrafish 배아는 에탄올 노출에 관련된 인간의 출생 결함을 모델링에 매우 유용하는 것이 좋습니다. 또한, zebrafish에있는 유전자 발현 변경은 다른 사용자가 확인되었습니다에탄올의 발달 효과는 척추 동물에 걸쳐 유지되는 제안 포유 동물 모델 시스템 ²⁰ 인치 위에서 보여주는 기술 중 대부분이 쉽고 빠르게 잠재 teratogens를 검색하고 특정 물질의 teratogenesis에 기여하는 기본 메커니즘을 결정하기 위해 다른 환경이나 제약 모욕 함께 사용할 수 있습니다.

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