RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Elena Ronander; Dominique C. Bengtsson; Louise Joergensen; Anja T. R. Jensen; David E. Arnot

doi:10.3791/4073

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요약

형광성의 현장에서 하이브리드 (물고기) 등의 하나 이상의 회원의 동시 전사로 polygenic 활동의 분석을 할 수 있습니다 VAR multigene 가정에서 Plasmodium falciparum 감염된 적혈구¹. 기술은 적응력이 있으며, 유전자, 세포와 생물의 다른 유형에 사용할 수 있습니다.

초록

말라리아 감염 동안 인간의 내피 수용체에 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구 (IE)의 접착은 VAR 유전자에 의해 인코딩 PfEMP1 단백질 변형의 표현에 의해 중재됩니다.

haploid P. falciparum 게놈은 하나가 감염 혈액 단계에서 한 번에 셀 당 베꼈 것으로되어있는 약 60 가지 VAR 유전자를 비호. 어떻게 VAR 유전자 전사의 이러한 상호 배타적 인 규제가 달성하는 것은 명확하지 않다, 개별 VAR 유전자 또는 P.의 임상 결과에 대한 서로 다른 수용체 및 차동 바인딩의 결과와 관련된 VAR 유전자의 하위 그룹의 식별이 falciparum 감염. 최근 상호 배타적 인 전사 패러다임은 개별 P.에 따라 전사 assays에 의해 의심을하게되었습니다 단일 INF의 falciparum 대본 확인P.의 개별 핵에있는 기생충에 의한 VAR 유전자 전사의 원위치 하이브리드 화에 RNA 형광을 사용하여 ected erythrocytic 전지 (물고기) 분석 falciparum IE ^1.

여기, 우리는 P.의 단일 핵에 VAR 유전자 전사의 분석을 위해 RNA - 물고기 방법론을 수행하기위한 세부 프로토콜을 제시 falciparum은 인간의 적혈구를 감염. 방법의 사용을 기반으로 digoxigenin 및 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템 ² (Perkin 엘머), 미세 분석 갓 선택한 P.를 사용하여 안티센스 RNA 프로브에게 비오틴 - 표시 falciparum IE. 현장 하이브리드 방식의는 P.의 다른 단계에서 표현 전사와 유전자의 다양한 규제를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다 falciparum 수명주기와는 다른 말라리아 기생충 종과 다른 생물과 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 갓 선정 감염된 적혈구의 생성

PfEMP1 단백질의 표면 표현 신선한 선택 문화를 사용하는 경우이 분석은 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 특정 실험 3D7 P.에서 falciparum의 일족이 이전에 ¹ 설명한 바와 같이 특정 항체를 사용하여 선정되었습니다.

1 일

P.의 포장 혈액 세포의 수확 200 μl falciparum 문화는 실온에서 8 분 800 XG에서 원심 분리하여 2~5% 늦게 무대 IE를 포함.
37 2 ML에서 피 펠렛를 다시 일시 중지 ° C 따뜻한 0.75 % 젤라틴 14 ML 멸균 튜브에 솔루션 및 침전에 감염되지 않은 및 링 단계 IE를 허용하도록 37 ° C 15-20 분에 출발합니다.
말기 IE를 수확, 새로운 14 ML 튜브로, 위의 단계를 즉 37 ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어 10 ML로 두 번 씻어.
특정 항 PfEMP의 50 μl를 희석37의 2 ML ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어와 살균 필터 1 항체.
37 번 30 분에 14 ML 멸균 튜브와 배양에서 살균 희석 antisera ° 부드러운 교반과 C와 함께 바랜 말기 IE를 섞는다.
상온에서 8 분 800 XG에 스핀 다운, 그리고 37 ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어 10 ML로 두 번 씻어.
DynaMaq-15 자석을 사용하여 RBC - 세탁 미디어와 중지 두 번 Dynabead 단백질의 50 μl를 씻으십시오.
300 μl RBC - 세탁 미디어에서 Dynabeads을 Resuspend하고 바랜 말기 IE에 추가합니다. 부드러운 교반과 37 ° C에서 30 분에 품다.
DynaMaq-15 자석에 튜브를 전송합니다. 1-2 분을 위해 남겨 모든 액체를 제거합니다.
RBC - 세탁 미디어의 4-5의 ML에 Dynabeads을 Resuspend. 자석에 튜브를 다시 전송하고 모든 액체를 제거하기 전에 1-2 분을 위해 출발합니다. 한 번 세척 단계를 반복합니다.
25cm ^두 멸균 문화 F에 씻은 구슬을 전송200 μl 갓 포장 적혈구를 포함하는 lask. 문화에 Albumax 미디어의 5-6 ML을 추가합니다. 37 5 % CO _2에서 하루 아침에 저장 ° C.

2 일

선택한 IE는 14 ML 멸균 튜브에 대한 모든 문화를 전달하여 새로운 적혈구를 reinvaded 한 문화에서 Dynabeads를 제거합니다. DynaMaq-15 자석에 튜브를 넣고 1-2 분 동안 둡니다. 그런 다음, 문화 플라스크에 모든 액체를 다시 흘려.
와 같은 몇 5~10%의 parasitemia 때까지 가능한 한주기와 기생충에 대한 문화 ringstage 이용하실 수 있습니다.
IE는 올바른 표면 표현형이 중 PFD1235w의 and/orPF11_0008의 즉, 단백질 표현이 ^1를 획득되었는지 확인하기 위해 FACS에 의해 분석해야합니다.

2. 프로브의 작성

안티센스 RNA 프로브는 PFD1235w과 PF11_0008 VAR의 가장 변수 지역에서 생성 된 <P.에서 / em>는 유전자 falciparum 3D7의 게놈의 DNA. DNA는 제조업체의 설명 (로슈)에 따라 각각 PCR에 의해 증폭 및 해독을 위해 pSPT18 또는 19 벡터로 복제되었습니다. 프로브 (580 기본 쌍 (BP)와 길이 590 BP)이 각각 파 RNA 라벨 키트 또는 비오틴 RNA 라벨 믹스를 사용하여 Digoxigenin (파) 또는 비오틴으로 표시되었습니다. 우리는 모두 북부 얼룩 분석 의해 단일 레이블 생선 분석 ^(1)에 의해 프로브의 특이성을 확인했습니다.

3. 현장 하이브리드 화에 얇은 문질러과 이전 기생충 고정

1 일

모든 단계는 RNase없는 환경에서 수행하고 모든 시약은 RNase 무료 또는 디 에틸 pyrocarbonate (DEPC) 또는 RNase 해치 (Invitrogen)로 사전 처리 있습니다. 슬라이드와 커버 용지는 잔여 제조 그리스를 제거하려면 알코올로 세척해야합니다. 이 단계들 사이에서 일시 정지하지 않고 프로토콜을 수행하는 것이 중요합니다nuclease 오염의 위험을 최소화하기 위해 인치

표준 확산 방법 ³ 얇은 혈액 필름을합니다. 현미경의 100x 오일 목적 렌즈를 사용 IE를 계산하고 문화 IE의 비율을 계산합니다. 기생충 단계는 링과 IE주기의 초기 trophozoite 단계에서, 대략 synchrony에 있는지 확인합니다. 다음은 미리 복제, 단일 핵 단계, 표현 VAR 유전자 mRNA와 이런 종류의 단세포 생선 전사 assays에 적합합니다.
1.5 ML RNase 무료 Eppendorf 튜브에 5-10 %의 parasitemia에서 기생충 문화의 50 μl를 전송합니다. 상온에서 2,000 rpm으로 1 분에 원심 분리기.
미디어를 제거하고 DEPC - 처리 된 물 50 μl PBS의 pH를 7.2을 추가합니다. 부드럽게 튜브를 선동. 미디어 및 세포 잔해에서 무료로 세포를 씻어 두 번 원심 침강 단계를 반복합니다.
넷 품질 얇은 얼룩을합니다. 각 비방를 들어,에 한 도말 표본을잘 RNase-자유 후드에서 4도 슬라이드, 총 즉, 네 유리 슬라이드 (중요한 단계) 중 하나에 11mm 직경. 파도가 건조 할 수있는 공중으로 간단히 슬라이드. 특정 프로브, RNase 처리 및 관심 유전자를 표현하지 IE 포함 삼분의 일 슬라이드의 또 다른 슬라이드를 사용하여 다른 관련이없는 유전자에 대한 단일 프로브 착색을위한 컨트롤 - 하나의 제외 슬라이드하기위한 세 가지 여분의 슬라이드를 확인합니다. 10-20 분 동안 벤치에 건조 할 수있는 슬라이드를 둡니다.
우물에 4 % paraformaldehyde 5 % 빙하 아세트산을 포함하는 고정 솔루션을 60 μl를 추가하여 박막을 수정합니다. 실온에서 벤치에 10 분 동안 둡니다.
실온에서 부드럽게 교반 5 분 동안 2 배 SSPE 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오. 간단히 종이 휴지로 부드럽게 세포를 포함하는 우물을 터치하여 초과 액체를 제거합니다.
37 ° C (매우 중요한 단계에서 2 분에 0.01 M HCL에 0.01 %의 펩신과 함께 슬라이드를 커버). 상온에서 5 분을 위해 2 배 SSPE에 슬라이드를 씻으십시오.
10 μg / ML의 최종 농도에 RNase 솔루션을 희석. RNase 솔루션의 60 μl로 대조군의 얼룩을 다룹니다. 37 ° C에서 30 분 동안 배양 한 후 실온에서 5 분을 위해 2 배 SSPE에 슬라이드를 씻어.
하이브 리다이 제이션 단계로 바로 진행합니다.

4. 고정 슬라이드로 RNA 프로브의 하이브리드

1 일

이러한 ThermoStar 100 HC4 또는 RNase 해치와 함께 분사하고 종이 휴지로 깨끗이 닦고하여 깨끗한 오븐에 넣어 빈 피펫 팁 상자 하이브 리다이 제이션 챔버을 준비합니다. 하이브 리다이 제이션 챔버 또는 슬라이드가 하이브리드 동안 밖으로 건조하지 않도록하기 위해 DEPC - 처리 물 상자 하단의 채널을 입력합니다. 48 챔버 및 예열을 닫으 ° C.
12 NG / μl의 최종 농도에 하이브 리다이 제이션 용액에 프로브를 희석. 가열 블록의 5 분에 65에서 프로브 솔루션 ° C를 변성. 즉시 얼음에 진정 하라구.
간단히 공기는 2 배 SSPE 세척 후 슬라이드를 건조. 조심스럽게 종이 휴지로 우물 주변에 초과 액체를 제거합니다.
하이브 리다이 제이션 챔버를 열고 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 하나 또는 잘 60 μl의 총 볼륨의 두 프로브를 적용 할 수 있습니다. 조심스럽게 무균 집게를 사용하여 RNase 무료 커버 슬립이있는 액체 방울을 다룹니다.
챔버를 닫고 밤 동안 적어도 16 시간 48 ° C에서 슬라이드를 잡종을 만들다.

5. 항체 활용 및 형광 증폭

2 일

다음 단계는 Perkin 엘머에서 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템을 기반으로합니다. 모든 단계는 실온에서 이루어집니다.

부드러운 교반 5 분 동안 TNT 버퍼에 슬라이드에게 3 번 씻으십시오.
30 분에 TNB 버퍼 150 μl에 우물을 차단.
1:500의 비율로, TNB 버퍼에 1:100의 비율과 HRP-복합 α-비오틴 항체에 TNB 버퍼에 HRP-복합 α-파의 항체를 희석. 종이 조직과 슬라이드에서 초과 TNB 버퍼를 제거합니다. 동시에 두 스크립트를 감지하면, 두 항체는 한 번에 이동할 수 있습니다. 물론 당 항체 - TNB 솔루션 100 μl의 총 금액을 적용하고 신중하게 커버 슬립을 다룹니다. 2 시간에 슬라이드를 품다.
조심스럽게 커버 용지를 제거합니다. 5 분에 3 회 TNT 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오.
1:500의 비율에 tyramide 증폭 시약에 FITC-형광을 희석하여 각도에 대한 해결책의 100 μl를 적용 할 수 있습니다. 커버 용지로 우물을 커버하고 12 분에 품다.
조심스럽게 커버 미끄러를 제거하고 부드러운 교반에 의한 TNT 버퍼의 5 분의 슬라이드에게 3 번 씻는다.
1:500의 비율로 tyramide 증폭 시약의 Cyan3 - 형광을 희석. 100 μl를 추가합니다이 솔루션의 잘. 커버 용지로 우물을 커버하고 12 분에 품다.
커버를 제거주의 깊게 미끄러 후 TNT 버퍼에 빠져 신속하게 슬라이드를 씻어.
5 분을위한 TNT 버퍼로 슬라이드에게 3 번 씻으십시오.
DEPC - 처리 물에 빠르게 슬라이드를 빠져.
건조 방송에 슬라이드를 둡니다. DAPI를 포함하는 안티 - 페이드 시약으로 슬라이드를 탑재합니다. 매니큐어와 커버 용지의 모서리를 밀봉합니다.
슬라이드 이제 현미경을위한 준비가되어 있습니다. 계속 4에 알루미늄 호일 및 매장으로 덮여 슬라이드 ° C 실험 다음 날 완료 될 경우. 슬라이드의 측면의 완전한 밀폐는 안티 - 페이드 시약을 적용한 후 24 시간을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜이 완료 된 후 슬라이드가 일주일에 이미징 될 수 있습니다.

6. Hybridized 프로브의 시각화

현미경을 사용합니다. 표준 immunofluorescence 현미경 suffic입니다당신은 공 촛점 현미경에 대한 액세스 권한이있는 경우 실험이 종류의 ient,하지만 당신은 또한 3D 이미지이를 사용할 수 있습니다 또는 귀하의 스테인드 세포의 비디오를 얻을 수 있습니다. 현미경은 15-30 분에 따뜻하게 할 수 있습니다. 컴퓨터와 소프트웨어에 전환합니다.
immunofluorescence 현미경에 착색의 품질을 확인합니다. 몇 기생충을 포함하는 장소를 선택합니다.
수동으로 각 레이저의 게인을 조정합니다. 픽셀이 4-6m ^{-1의 -1과} 512 X 512 픽셀의 단계에 머물러 조정합니다.
프레임 람다를 사용하여 테스트 사진을보세요. 레이저 게인을 다시 조정.
형광 단일 세포의 20 좋은 사진 최소보십시오. 5-20 기생충을 포함하는 필드의 적어도 2-5 사진은 긍정적 인 기생충의 비율 공정 개요를 얻기 위해 필요합니다.