Biofunctional Nanofibers를 제조 절차

요약

특히 단백질과 상호 작용 할 수있는 기능 그룹으로 장식 nanofibers을 준비하기위한 효율적인 접근 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 먼저 해당 기능 그룹과 기능화 폴리머의 준비가 필요합니다. 기능 고분자는 electrospinning에 의해 nanofibers로 제조된다. 단백질과 nanofibers의 바인딩의 효과는 공 촛점 현미경으로 연구하고 있습니다.

초록

Electrospinning은 기능 그룹으로 장식 nanofibers을 준비하기위한 효과적인 처리 방법입니다. 기능 그룹으로 장식 Nanofibers은 단일 분자 탐지기와 같은 잠재력을 지닌 바이오 센서 등의 행위 즉, 물질 - biomarker의 상호 작용을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 우리는 기능 모델 단백질로 특히 바인딩의 용량이 기능 고분자를 준비하기위한 효과적인 접근 방법을 개발했습니다. 우리의 모델 시스템에서 기능 그룹은 2,4 - dinitrophenyl (DNP)이며, 단백질 안티 DNP IGE (면역 글로불린 E)입니다. 기능 폴리머, α, ω-BI [2,4-dinitrophenyl caproic] [폴리 (에틸렌 옥사이드) B-폴리 (2 - methoxystyrene) B-폴리 (에틸렌 옥사이드)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO- CDNP)는 음이온 중합에 의해 생활 준비가되어 있습니다. 중합에 활용 difunctional 창시자는 α-methylstyrene의 전자 전달 반응과 칼륨 (거울) 금속에 의해 준비되었다. 2 methoxystyrene의 모노머가 추가되었습니다기자 먼저, 두 번째 모노머, 에틸렌 산화물의 추가에 이어, 마지막 생활 폴리머는 메탄올에 의해 종료되었습니다. α, ω-dihydroxyl 폴리머 [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] α, ω-BI의 형성의 결과로 DCC 커플 링에 의한 N-2 ,4-DNP-∈ - 아미노 caproic 산,와 반응했다 [ 2,4 - dinitrophenylcaproic] [폴리 (ethyleneoxide) B-폴리 (2 - methoxystyrene) B-폴리 (에틸렌 옥사이드)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). 고분자는 FT-IR, ¹ H NMR 및 겔 침투 크로마토 그래피 (GPC)에 의해 특징되었습니다. 고분자의 분자량 분포가 좁은 있었다 (1.1-1.2) 및 50,000보다 큰 분자량과 고분자는이 연구에 사용되었다. 폴리머는 노란색 분말과 tetrahydrofuran에 용해했다. 물은 용해 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (dimethoxyethylene 글리콜) 복합 바인딩하고 몇 초 내에 솔루션을 IGE와 정상 상태 바인딩을 달성합니다. 높은 분자량 (50,000 주위에 물 불용성 예) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP의 고분자, 1 % 단일 벽 탄소 나노 튜브를 포함하는 (SWCNT)는 실리콘 기판 상에 electroactive nanofibers (100 나노 미터에 직경 500 나노 미터)로 처리되었습니다. 형광 분광법은 안티 DNP IGE는 장식 DNP 기능 그룹 섬유와 바인딩하여 nanofibers와 상호 작용 보여줍니다. 이러한 관찰은 적절하게 작용 nanofibers는 biomarker 감지 장치를 개발하기위한 약속을 보유하는 것이 좋습니다.

프로토콜

1. α의 합성, ω-dihydroxyl 폴리머 [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]

1. 그림 1과 같이 중합 반응기를 조립. 이 실험에 대한 반응기는 표준 테이퍼 외부 공동 (Chemglass), stopcocks 두 개의 흐름 제어 어댑터 (Chemglass), 한 테플론 교반 막대를 갖는 2 - 목 플라스크 100 ML 둥근 바닥으로 구성되어 있습니다. 어댑터 A (그림 1)은 불활성 시스템을 입력에서 공기와 습기를 방지하기 위해 시스템을 통해 울트라 고순도 (UHP) 질소가 흐르는 유지하는 데 사용되었다. 어댑터 B는 (그림 1) 반응 플라스크에 용매, 단량체 및 개시제를 삽입하는 데 사용되었다.
2. 건조 질소 가스에 따라 6 시간의 최소, 지표 benzophenone을 사용하여, NA 금속으로 Tetrahydrofuran (THF) 200 ML를 말린다.
3. 24 시간을위한 칼슘 수 소화물 이상 2 methoxystyrene의 10 ML을 말린다.
4. ° C가 이소프로판올의 슬러리를 사용하여 -78에서 관리하고 차가운 온도 목욕 준비차 액체 질소.
5. 질소 가스 아래의 중합 반응 플라스크 (그림 1 참조)에 THF의 25 ML을 추가하고 모든 중합을 통해 질소 가스에서 반응기를 유지.
6. 슬러리에 장소 100 ML 둥근 바닥 플라스크입니다.
7. 반응 플라스크에 기자 솔루션 2 ML을 (0.27 mmol / ML)를 추가합니다.
8. 반응 플라스크에 처음 모노머, 2 methoxystyrene (4 ML)를 주입.
9. 40 분 동안 진행하는 반응을 할 수 있습니다.
10. 두 번째 단량체, 산화 에틸렌 1 ML을 추가합니다.
11. 중합 이틀 동안 실온에서 계속하도록 허용합니다.
12. HCL과 폴리머 (6 M) / 메탄올 (1 / 20 권 / 권)을 해지 할 수 있습니다.
13. hexanes 및 진공 오븐에 건조 폴리머로 precipitating하여 폴리머를 정화.
14. NMR을 사용하여 폴리머을 특성화한다.

2. α, 기능성 Polym을 구하는 N-2 ,4-DNP-Ε - 아미노 Caproic 산성과 ω-dihydroxyl 폴리머의 작용어, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP

1. 세 목 플라스크에서 α, ω-dihydroxyl 폴리머 (0.05 mmol), N-2 ,4-DNP-E - 아미노 caproic 산 (0.25 mmol), DCC (0.15 mmol) 및 DMAP (0.005 mmol) 및 배치 4 시간에 진공 라인에 건조 시키십시오.
2. 술병으로 건조 dichloromethane (10 ML)를 증류.
3. 질소 아래의 진공을 해제하고 상온에서 12 시간에 대한 반응을 젓는다.
4. 필터 반응 혼합물과 hexanes과 메탄올에 두 번 precipitating하여 폴리머를 복구합니다.
5. 드라이는 40 ° C.에서 진공 오븐에서 폴리머를 유발
6. FT-IR 및 ¹ H NMR에 의한 고분자 구조와 기능을 확인합니다.

3. Electrospinning에 대한 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT 솔루션의 준비

1. chlorobenzene에 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP의 20w %를 분해.
2. 20w %를 해산하고 chlorobenzene의 폴리스티렌의 40 W % 번 (MW 800,000)는이 솔루션을 준비 할 수 있습니다. 높은 분자 폴리스티렌은 increas에 사용됩니다전자 폴리머 체인 체인 녹채 및 electrospinning에 필요한 최적의 점도를 구하십시오.
3. 고분자의 1시 1분과 1시 2분 비율을 형성하고 혼합물에 1 W % 번 단일 벽 탄소 나노 튜브 (SWCNT)를 추가하고 CNTs의도 배포 밤새 저어 함께 3.1 및 3.2 준비 폴리머 솔루션을 섞는다.

4. 폴리머 - CNT 복합의 Electrospinning

1. 그림 2와 같이 설정 electrospinning을 조립. 그림의 오른쪽에있는 Glassman 높은 전압 소스입니다. 그 옆에있는 실리콘 웨이퍼가 연결되어있는 레토르트 스탠드입니다. 왼쪽에있는 주사기가 장착되어 있으며 뒤쪽은 그 진행 절차를 시각화를위한 램프입니다에서 다른 레토르트 스탠드입니다.
2. 피하 주사기를 사용하여 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT 혼합물 (약 1 ML)의 작은 수량을 철회하고 레토르트 스탠드에있는 피하 주사기를 장착합니다.
3. 실리콘 웨이퍼는 마운트입니다10cm의 거리에서 안전하게 주사기, 그리고 높은 전압 소스의 접지 클립의 전체 에드는 여기에 첨부됩니다.
4. 주사기에 바늘에 적용 할 높은 전압을 베어링 클립을 첨부, 플런저에게 조금 (바늘 끝에서 드롭을 일시 중지 할 수) 우울이 시점에서, electrospinning이 준비되었습니다.
5. 높은 전압 소스에 대한 전원, 10 KV까지 전압 미터를 조정합니다. 복합의 폴리머의 특성에 따라 높은 전압은 직경이 수백 나노 미터 미만의 nanofibers가 원하는 특히 경우 필요할 수 있습니다.
6. 완전히 건조하는 밤 dessicator에서 마운트 해제 실리콘 웨이퍼 및 장소.

5. Nanofibers의 특성

1. nanofibers의 초기 이미징은 섬유의 전반적인 관점을 관찰하는 광학 현미경을 이용하여 이루어집니다.
2. 형태, 직경, 평균 기공 크기, 등 미세한 세부 사항을 관찰 할 전자 현미경 활용
3. 나르다섬유 등의 3-D 지형을 관찰 할 수있는 원자 힘 현미경에 대한 추가 이미징 아웃

6. 안티 - DNP IGE 단백질과 Nanofibers의 결합 특이성

1. PBS-BSA (인산 버퍼 식염 - 소 혈청 알부민) 솔루션에서 4 UG / L 휘황 표시, FITC-IGE (Fluorescein Isothio-cyanate - 면역 글로불린 E)의 솔루션을 준비합니다.
2. MatTek 잘의 coverslip에 nanofibers가되는 실리콘 웨이퍼의 작은 조각을 놓으십시오. 한 시간이 솔루션에 nanofibers을 품다. 부화는 부드럽게 실리콘 웨이퍼에, 10 UL IGE 솔루션을 pipetting을 통해 이루어집니다.
3. 부화 후, PBS-BSA 버퍼 솔루션 샘플을 세 번 세척하여 언 바운드 IGE를 제거합니다. PBS 솔루션은 직접 nanofibers에 버퍼를 squirting 방지하기 위해, MatTek 요리의 벽에 부드럽게 투여합니다. nanofibers에 버퍼 솔루션을 배포하는 부드럽게 손으로 소용돌이 모양의 접시를. 조심스럽게 피펫으로 버퍼를 제거하고 다시토탄이 두 배.
4. 제어를 들어, 동일한 조건에서 휘황 표시 IgG (DNP에 대한 비 특정)에 nanofibers을 품다.
5. IGE와 바인딩 관찰 할 수있는 공 촛점 현미경으로 바인딩 된 섬유를 표시합니다. 우리의 연구를 들어, 사용 된 현미경 63x 렌즈 Leica 공 촛점 TCS SP2했다.

7. Nanofibers의 전류 전압 동작

1. Keithley 6430 민감 sourcemeter 같은 매우 낮은 전류 소스에 두 개의 마이크로 포지셔너를 연결합니다. 현재 전압의 동작을 결정하는 설정은 그림 3에 표시됩니다. 이 그림은 nanofibers의 초기 IV 특성을 결정하는 데 사용되는 프로브 스테이션을 보여줍니다. 이 Bausch Lomb과 MicroZoom 현미경, 진공 척 무대, 그리고 탐색에 사용되는 네 Micropositioners으로 구성되어 있습니다. 오른쪽 상단에있는 애질런트 34405A 디지털 멀티 미터는 전압을 측정에 사용되는 아래 그입니다 Keithley 6430 하위 Femtoamp 원격 소스 미터 소스 섬유로 입력 있던 낮은 전류를로 사용됩니다.
2. 섬유를 감동 팁 반대편에있는 섬유 매트 위에 마이크로 포지셔너의 프로브 팔을 탑재합니다.
3. 디지털 멀티 미터에 또 다른 두명의 마이크로 포지셔너를 연결 다른 두 사이에 -에 프로브 팔을 마운트 섬유 매트에 대한 도움말을 착륙. 네 가지 방법은 가능한 collinear으로되어 있는지 확인합니다.
4. Keithley (일반적으로 nanoamps 범위에서)에서 전류의 양을 다양한 입력.
5. 소스 현재의 모든 크기를위한 외부 도움말에 걸쳐 전압 드롭을 측정합니다.
6. 이러한 값을 음모하는 것은 섬유 매트는 같은 역할을 장치의 유형을 나타냅니다.

8. 대표 결과

기능성 폴리머

"α의 합성에 대한> 방법 ω-BI [2,4-dinitrophenyl caproic] [폴리 (에틸렌 옥사이드) B-폴리 (2 - methoxystyrene) B-폴리 (에틸렌 옥사이드)] (CDNP-PEO- P2MS-PEO-CDNP)가 그림 4에 표시됩니다. 기능 폴리머의 ¹ 구조가 FT-IR (그림 5), 500 MHz의 ¹ H NMR 분광법 (그림 6)에 의해 확인되었다. FT-IR은의 전체 실종을 보여줍니다 -OH ^-1 CDNP 그룹과 양적 작용을 나타내는 3,500센티미터 주변의 광범위한 흡수가.이 또한 그림 6에 표시된 NMR 스펙트럼으로 확인됩니다. NMR 스펙트럼의 피크의 통합을 사용하여,이 결정되었다는 CDNP-PEO - P2MS-PEO-CDNP의 고분자는 양적 기능화되어 있습니다.

Nanofibers

그림 7에서 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / chlorobenzene에서 폴리스티렌 / SWCNT를 electrospinning하여 얻은 전도성 nanofibers의 매트는 쉬입니다자신의. 획득 공 촛점 이미지는 단백질 IGE는 섬유 표면에 DNP와 바인딩을 보여 주었다. ^3이 IGE 항체에 대한 electrospun DNP-폴리머의 결합의 특이성의 표시입니다. 빛의 강도는 단백질이 휘황 태그되기 때문에 nanofibers에 IGE의 존재의 지표입니다.

그림 8A는이 과정과 그림 8B 얻은 nanofibers이 특정 nanofiber의 크기가 직경 150 nm의 주위에 표시 한 AFM (원자 힘 현미경) 이미지입니다. 이 과정에서 100-700 nm의 사이의 섬유는 얻어진다. 이 현재 시간에서는 특정 차원과 섬유를 준비하기 위해 도전하고 있습니다. 이 다른 그룹에 의해 관찰 한 것과 일치합니다. CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / 폴리스티렌 / SWCNT nanofibers과 nanofibers의 직경의 이미지 SEM 9 쇼는 300 nm의 200 nm의 사이에 있었다 ^네 그림. 세 SEM이 있습니다 nanofibe의 이미지RS는 다른 배율로 표시. 세 이미지의 연구는 섬유의 morphologies은 선형 및 구슬 아르 보여줍니다. 전반적인 목표는 대부분 선형 아르 섬유를 준비하는 것입니다. 그림 10 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / 폴리스티렌 / SWCNT에서 준비 nanofibers의 매트의 IV 계획을 보여줍니다. 줄거리는 저항 (오옴)의 동작을 보여줍니다. 항원이 nanofibers에 바인딩 할 때, 우리는 저항이 변화가 기능 섬유는 단일 분자 검출을위한 센서의 활성 구성 요소로 잠재적 인 응용 프로그램이 것을 제안 특징입니다로 섬유 매트의 IV 행동의 변화를 볼 것으로 예상 .

그림 1. α, ω-dihydroxyl 고분자를 합성을위한 중합 반응기. 흐름 UHP 가스 질소에 대한 A) 주입 지점. 용매, 단량체 및 개시제를위한 B.) 사출 가리 킵니다. C) 반응이 왔습니다.

그림 2. Glassman 높은 전압 소스를 사용하여 electrospinning 사용 설정.

그림 3. 하위 femtoamp 원격 Sourcemeter (Keithley)를 사용하여 IV 플롯을 측정하는 데 사용 설정.

그림 4. OH-PEO-P2MS-PEO-OH 중합체를 준비 A). 합성 방법. B) α의 작용, ω-dihydroxy [폴리 (ethyleneoxide) B-폴리 (2 - methoxystyrene) B-폴리 (ethyleneoxide)].

의 그림 5. FT-IR의 스펙트럼 (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP와 (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP에 선구자.

그림 6. CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP 500 MHz의 NMR 나와라.

그림 7. chlorobenzene에서 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP 섬유 electrospun와 FITC-IGE의 A) 바인딩 이미지입니다. 컨트롤의 B) 공 촛점 현미경 이미지 (IgG와 nanofibers).

그림 8. chlorobenzene와 그림 5A에 표시 한 섬유 B) AFM의 프로필 즉 차원에서 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP 섬유 electrospun의 A) AFM 이미지입니다.

그림 9. CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / 폴리스티렌 / SWCNT nanofibers의 SEM 이미지.

그림 10. CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / 폴리스티렌 / SWCNT에서 준비 nanofibers의 매트 IV의 줄거리.

토론

이 보고서에서, 우리는 biofunctional nanofibers을 준비하기위한 강력한 접근 방식을 제시하고 있습니다. nanofibers는 모델 단백질에 특정한 기능 그룹에 장식되어 있습니다. 이 통신에보고 된 절차와 방법은 자연의 일반적이며, 원하는 모든 기능 그룹으로 장식 nanofibers을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 음이온 생활 중합는 covalently 관심의 특정 생체에 관련된 흥미로운 기능이나 기능 그룹의 번호로 연...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
나트륨 금속	시그마 - 알드리치	282065
Benzophenone	시그마 - 알드리치	239852
2 methoxystyrene	시그마 - 알드리치	563064
Tetrahydrofuran	시그마 - 알드리치	178810
Chlorobenzene	시그마 - 알드리치	319996
단일 벽 CNTs	시그마 - 알드리치	704113
폴리스티렌	시그마 - 알드리치	81,416
실리콘 웨이퍼	실리콘 퀘스트 국제	720200
Zeiss FESEM	칼 Zeiss 주식회사	울트라 60
Bausch & Lomb MicroZoom II 고성능 현미경으로 Probestation	Bausch 및 소호메가바이트
Leica 스캐닝 공 촛점 시스템	Leica 마이크로 시스템즈	TCS SP2
하위 femtoamp 원격 Sourcemeter	Keithley 악기	6430
디지털 멀티 미터를 Autoranging	Keithley 악기	175A
주사기 펌프	Chemyx 주식회사	퓨전 200
Zeiss 광학 현미경	칼 Zeiss 주식회사	Zeiss / Axiotech