바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 실크 실크 단백질 합금 재료 설계

요약

혼합 속성과 결합하여 광범위한 기능과 생체 물질을 생성 할 수있는 효율적인 방법입니다. 다른 천연 실크 단백질 분자 사이의 상호 작용을 예측함으로써, 가변 기계적 복원력 전기적 응답, 광학 투명성, 화학적 가공성, 생분해 성, 또는 열적 안정성을 가진 새로운 실크 실크 단백질 합금 플랫폼을 설계 할 수있다.

초록

섬유 단백질은 바이오 센서, 나노 의학, 조직 재생 및 약물 전달과 같은 생의학 분야에서 다양한 용도로 사용되어왔다 서로 다른 서열과 구조를 표시합니다. 이 단백질 사이의 분자 규모의 상호 작용을 기반으로 자료를 설계하는 것은 조정 가능한 특성을 가진 새로운 다기능 단백질 합금 생체 물질을 생성하는 데 도움이됩니다. 이러한 합금 재료 시스템은 또한 때문에 체내에서 생분해 성 재료, 생체 적합성 및 tenability 전통적인 합성 중합체에 비해 이점을 제공한다. 이 문서에서는 단백질 합금을 생산하는 방법 계산 방법에 의해 단백질 - 단백질 상호 작용을 예측하는 방법을 포함하여이 주제에 관한 유용한 프로토콜을 제공하기 위해 예를 들어 야생 tussah 실크 (Antheraea의 pernyi) 및 국내 뽕나무 실크 (Bombyx 모리)의 단백질 혼합 사용 솔루션은, 어떻게 열 분석에 의해 합금 시스템을 확인하는 방법과 변수 합금 재료를 제조회절 격자와 광학 재료, 회로 코팅과 전기 재료 및 약물 방출 및 전달을위한 제약 재료 포함. 이러한 방법은 다른 단백질 합금에 기초하여 차세대 다기능 생체 재료 설계에 중요한 정보를 제공 할 수있다.

서문

활동은 구조 단백질의 제한된 수를 사용하여 가변 다기능 생물학적 행렬을 생성하기위한 전략을 만들었다. 예를 들어, elastins 및 콜라겐은 항상 특정 조직 ^1,2에 필요한 조정의 장점과 기능을 제공하기 위해 생체 내에서 함께 사용됩니다. 이 전략의 핵심은 블렌딩이다. 블렌딩 비율은 특정 단백질과의 혼합을 포함하고 가변하고 다양한 특성 ^3-5 간단한 재료 시스템을 생성하는 기술 접근 방법이다. 합성 공학 ​​전략 ^6,7과 비교하여, 혼합 재료는 균일 인한 운전 ^8-16의 용이성 물질을 처리 할 수있는 능력을 향상시킬 수있다. 따라서, 다기능, 생체 단백질 합금 재료를 설계하는 의학 연구의 새로운 영역이다. 이 기술은 세포 및 조직의 기능 VIT 모두에서 천연 단백질 기질의 영향에 대한 체계적인 지식을 제공한다RO 및 생체 ^10,17한다. 다른 단백질 사이의 분자 인터페이스를 최적화함으로써, 단백질 계 합금 ^재료는, 예컨대 열 상이한 온도에서의 안정성, 가변 장기에 다양한 조직, 전기적 감도를 지원하는 탄성 및 각막 조직 재생 ³ 광학 특성 등의 물리적 기능의 범위를 포괄 할 수있다 ^18-27. 이러한 연구의 결과는 조정 조직 수리 및 질병 치료와 자신의 새로운 치료 및 진단 기능은 ^3을 구상 할 수있다 생분해 성 임플란트 장치에 더 우위에 직접 관련성 생명 과학 분야에서 새로운 단백질 물질 플랫폼을 제공 할 것입니다.

많은 자연의 구조 단백질은 생체 재료 행렬 후보로 악용 될 수 있습니다 중요한 물리적, 생리 활성 특성을 갖는다. 다른 웜 종 실크, 다른 조직으로부터 머리와 양모, elastins 및 콜라겐에서 케라틴 및각종 식물성 단백질 (도 1) ^18-27 가변 단백질 계 재료를 설계에 사용되는 가장 일반적인 구조 단백질의 일부이다. 일반적으로, 이들 단백질은 그들의 독특한 반복적 차 아미노산 서열 ^3,28-35에 다른 이차 구조의 분자 (예 : 실크, 베타 시트, 또는 케라틴 코일 용 코일)을 형성 할 수있다. 이러한 기능은 생체 고분자 물질의 소중한 자원으로 자신의 유틸리티를 자극 생물 인터페이스에 고유 한 기능을 가진 자기 조립 거시적 구조의 형성을 촉진한다. 여기서, 구조 단백질의 두 종류가 사용되었다 (야생 tussah 실크 예로 들여진 뽕나무 실크 단백질로부터 단백질 B)는 각종 단백질 합금 생체 재료의 제조 일반적인 프로토콜을 설명한다. 증명 프로토콜은 1 부 포함 : 단백질 상호 작용 예측 및 시뮬레이션, 2 부 : 단백질 합금 솔루션의 생산 및 부품 (3) : 단백질 합금의 제조를시스템, 광학, 전기 및 제약 응용 프로그램.

그림은 일반적으로 단백질 기반의 물질을 설계하는 다른 웜 종의 실크를 포함하여 우리의 실험실에서 사용되는 다양한 구조 단백질의 1 원시 자료, 머리와 양모, 다른 조직에서 elastins 및 다양한 식물성 단백질에서 케라틴.

프로토콜

단백질 상호 작용의 1 예측

1. 단백질 분자의 분석의 bioinformatics
   1. 생명 공학 정보 웹 사이트에 대한 국립 센터 (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)를 방문하고, 합금 연구에 사용되는 단백질의 이름을 검색 할 수 있습니다. 주 :이 예에서는,이 단백질이 사용되었다 : 야생 tussah 실크 피브로인 인 단백질 A, 및 국내 뽕나무 실크 피브로인 단백질 인 B를,. 단백질의 경우, 아미노산 서열은 "[Antheraea pernyi] GenBank 등록 피브로인 : AAC32606.1를"에서 찾을 수있다 (Antheraea의 pernyi는 중국어 (오크) Tussah 엄이다). 단백질 B를 들어, 아미노산 서열에서 발견 될 수있는 "피브로인 중쇄 전구체 [Bombyx 모리] NCBI 레퍼런스 시퀀스 : NP_001106733.1"및 "피브로인 경쇄 전구체 [Bombyx 모리] NCBI 참조 서열 NP_001037488.1"함께 (Bombyx 모리)는 뽕나무의 길 들여진 누에이다.
   2. 선택 및 사데이터베이스에서 단백질과 단백질 B의 아미노산 서열을했습니다.
   3. ExPASy 홈페이지 (SIB 정보학 자원 포털) (www.expasy.org) 방문 또는 포함한 서열에 기초하여 기본의 bioinformatics보기 단백질의 데이터를 계산하는 다른 상용 소프트웨어를 사용할 수 있지만, 분자 당 총 전하의 소수성 지수에 한정되지 등이 정보 분자, 상이한 pH 값에서의 분자의 적정 곡선은, 단백질 상호 작용의 계산 시뮬레이션을위한 기본 요소로서 사용되며, 이들 두 단백질이 강한 상호 작용이 있는지 이해하는 것이 도움이 될 것이다. [참고 :이 단계는 정확하게 작은 펩타이드 또는 기능 단백질 과학에서 사용되는 것과 같은 단백질 상호 작용의 모든 세부 사항을 예측하지 않습니다. 이 섹션의 목적은 "합금"소재라고 할 수없는 명백한 macrophase 분리와 단백질 혼합물을 생산 피하기 위해 단지이다. 따라서 추정치는 대략하지만 일이 될 수E 단백질 합금 시스템] 정확한 열 분석을 이용하여 단계 3.1에 ​​기재된 실험적 방법에 의해 확인할 수있다.
2. 단백질 합금 시스템의 전산 시뮬레이션
   이하 단백질 합금 시스템을 시뮬레이션하는 절차를 설명한다. 시뮬레이션 프로그램은 단일 또는 멀티 프로세서 컴퓨터 시스템에서 사용될 수 C 프로그래밍 언어로 작성된다. 격자 스프링 - 질량 (LSM) 모델 합금 단백질 ^36-39을 시뮬레이션하기 위해 사용되었다. 스프링에 부착 한 각각의 질량에 대한 동작을 이해하기 위해 힘 방정식을 풀 때 LSM 모델은 질량에 그물 힘의 간단한 설명을 제공한다. 다음과 같이 간단한 프로그램 알고리즘은 주어진 LSM 모델을 이용하여이 단백질 합금 시스템을 모델링 :
   1. m의 질량을 가지고 결이 거친 입자와 같은 단일 단백질을 나타낸다.
   2. 채권 ^{(38, 39)를} 표현하기 위해 Hookean 또는 신 Hookean 스프링을 사용합니다. 스프링 입자의 유한 수를 상호 연결하면, 하나의 캔 m합금의 안정한 단백질 빌딩 블록을 나타내는 서브 합금 도메인 아케. 인트라 쇄교 채권의 다른 유형을 나타내는 다른 스프링 상수 / 강성을 사용한다.
   3. 둔하게 가교 서브 합금으로 이루어지는 재료로서 단백질 합금 시스템을 모델링. 다시 여기에 다른 강성은 서브 합금 간 결합 간의 상이한 결합을 나타 내기 위해 사용되었다.
   4. 약한 결합을 개혁 할 수있는 사용자를 통해 벨 모델 ^{40, 41,에} 의해 채권 차단 및 개혁 과정을 모델링하지만 깨진 일단 강한 채권은 개혁 할 수 없습니다. 시스템이 충분히 (내 suballoy 간 suballoy 채권 모두)을 강조하는 경우, 채권이 끊어 및 개혁 할 수 있습니다.
   5. 이들은 강조 될 때 합금 단백질 변형에 영향을 연구하기 위하여, 시스템의 외부에 힘을 적용한다. 힘의 방정식 (뉴턴의 법칙) 풀 때 각 입자에 동일하게이 힘을 배포합니다.
   6. 상호 작용을 모델링하려면(물 분자 등) 용액과 단백질 사이의 각 입자에 추가 끌림 힘 또는 마찰력을 적용한다.
   7. 각 힘 (결합, 외력 및 마찰력으로부터 스프링 력)의 동작과, 각 입자에 대한 힘 방정식 해결.
   8. 계산 및 시간의 함수로서 단백질 입자의 위치를​​ 추출한다.
   9. 입자의 위치로부터 합금 단백질을 특성화 물리량을 계산한다.
   10. 서로 다른 단백질 간의 상호 작용을 이해하는 프로그램의 결합 강성을 변경합니다. (평균 접합 강도는 단백질 물질의 영률로부터 계산된다. 다른 단백질 섬유 재료의 영률은 유니버설 인장 시험 ^(18)에 의해, 또는 직접 ^2-4,18 이전 문헌에서 하나를 얻을 수있다).

단백질 합금 솔루션의 2 생산

야생 tussah 실크 (단백질 A) 및 국내 뽕나무 실크 (단백질 B)는 단백질 합금 시스템의 일례로서 현재 선택된다. 이 프로토콜은 제 야생 tussah 실크 (단백질 A) 용액을 수득하는 방법을 제시한다.

1. 3g의 무게에 원시 야생 tussah 실크 누에 고치거나 섬유를 잘라.
2. 소듐 카보네이트 또는 탄산 나트륨 3g 측정한다 (참고 : 탄산나트륨을 사용하여, 단백질 사슬의 분자량이 비등 프로세스 ⁽⁴²⁾ 동안 감소 할 경우).
3. 증류수로 2 L 유리 비커 채우기 (H ₂ O). 그런 다음, 뜨거운 무대에 유리 비커를 배치 끓는 알루미늄 호일, 열으로 커버.
4. 알루미늄 호일 커버를 제거하고 완전히 용해 할 수 있도록 끓는 물에 천천히 측정 나트륨 카보네이트를 추가합니다. (주 : 소듐 카보네이트의 역할은 야생 실크 섬유의 표면에 부착 된 수용성 세리신 단백질 및 기타 불순물을 청소하는 "비누"이다 OTH를 사용하는 경우.어 자연 단백질 섬유는) 문헌에 따라 해당 화학 약품을 선택하십시오.
5. 끓는 물에 원시 단백질 섬유 (야생 실크 섬유)를 추가하고 2 ~ 3 시간 (주 끓인다 할 수 있습니다 :. 끓는 시간은 단백질 사슬 ^26,43의 분자량에 중요한 영향을 미치는 하나에 따라 적절한 시간을 선택해야합니다 문헌 또는 제어 ^실험을 수행함으로써 ^26,43. 끓는 온도는 단백질 사슬 ^26,43,44)의 분자량에 영향을 조절할 수있다.
6. 비등 후 신중 용액으로부터 주걱으로 단백질 섬유를 제거하고 과량의 물을 제거하기 위해 그들을 짠다. (주의 : 섬유는 매우 뜨겁습니다!)
7. 다음에, 차가운 증류수 2 L 비이커에 섬유를 담가, 완전 섬유 표면으로부터 잔류 불순물을 제거하기 위해 30 분마다 배 섬유 씻는다. 적어도 12 시간 동안 흄 후드에서 섬유를 건조.
8. 칼슘 니트의 45.784 g을 녹여속도는 (캘리포니아 (NO _{3) 2)} 유리 비이커에 야생 실크 단백질 섬유를 용해하여 65 ° C에서 액상을 형성한다. (참고 : 다른 천연 단백질 섬유를 사용하는 경우,이 단백질을 용해하는 용매 해당 선택 다음은 또한 9.3 M LiSCN 또는의 LiBr 용액, 또는 다른 실크 섬유를 용해 85 % 인산 용액을 사용할 수 있습니다.).
9. 용매 10 ㎖ 중에 섬유 1g의 비율로 섬유와 용매 겸용. 섬유는 5-12 시간 동안 95 ° C에서 용해 할 수 있습니다. (참고 : 용해 시간 ^26,43-45을 단백질의 분자량에 따라 다름)
10. 주사기를 사용하여, (컷오프 크기로 최대 1000 MW) 12 ml의 투석 카세트로 난폭 실크 용액 또는 밀봉 투석 튜빙 (컷오프 크기로 최대 1000 MW)을 주입하고, 증류수 2 L에 대해 dialyze. (:, 인젝션은 35 ° C에서 용액을 유지하는 경우보다 효율적인 달리 단백질 용액의 점도가 급격히 실온에서 증가 주). (NO _{3) 용액이} 용매 (30 분, 2 시간, 6 시간, 이후 후 매 12 시간 3 일 동안. 총 약 8 물 변화가있을 것입니다) 칼슘을 제거하기 위해 자주 증류수를 변경합니다.
11. 삼일 후, 투석 튜브로부터 카세트 또는 단백질 용액을 수집하고 13,000 rpm으로 평가 튜브에 놓는다.
12. 침전물을 제거하기 위해 4 ° C 배에서 3,500 rpm으로 1 시간 동안 솔루션을 원심 분리기. 각각의 원심 분리기를 실행 한 후, 신속하게 새로운 튜브에 뜨는을 당깁니다. 4 ° C 냉장고에서 최종 솔루션을 저장합니다.
13. (이 보통 12 개 이상의 시간 소요) 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 기판 또는 다른 평면 소수성 기판에 단백질 용액 5 ㎖를 붓고 완전히 건조 할 수 있습니다. 나머지 고체 단백질 필름을 달아 (ML)에 무게 (w / v %이다) 비율 = (MG)에 측정 된 체중 ÷ 5 10 ÷하여 최종 용액 농도를 계산한다.
14. 이 CAS에서 선택된 다른 천연 단백질 섬유 (수집즉, 길 들여진 뽕나무 실크) 단백질 B로서 사용하고, 측정 농도가 최종 단백질 수용액이 얻어 질 때까지, 적절한 "비누"와 함께 용매에 용해 과정을 반복 수행. [주 : 단백질 물질이 분말 형태 인 경우, "비누 칠"과정에서 샘플을 유지하기위한 적절한 다공성 멤브레인 또는 튜브를 사용한다. 단백질이 이미 정제 된 경우, 직접 분말을 용해 2.8 단계로 이동합니다. 단백질 정제 및 이미 수용성 되었으면 제 소망 농도의 수용액을 혼합 한 후 단백질 용액을 아래 2.15 단계로 이동합니다.]
15. 천천히 1.0 중량 %의 단백질에게 수용액을 형성하는 4 ° C에서 단백질에게 증류수 용액 (여기 야생 실크 솔루션을) 희석한다. 단백질 B (여기에 길 들여진 실크)에 대한 동일한 프로세스를 수행합니다.
16. 천천히 4에서 1 중량 %의 단백질에게 단​​백질 용액과 B 용액을 섞어 ° C는 P를 피하기 위해 피펫을 사용하여혼합하는 동안 집계를 rotein. (참고 1 : 일부 단백질 (예를 들면, 실크가) 진동 ^{(46, 47)} 중 하이드로 겔을 형성하기 때문에 단백질을 섞어 소용돌이 악기를 사용하지 마십시오 주 2 :. 가능하면 혼합 비율 및 혼합 크기 결정을 제어하는 추가 장치를 사용 응집을 방지하기 위해 가능한 한 천천히 섞는다해야합니다. 신속하게 혼합하는 동안 솔루션을 피펫하지 마십시오).
17. 최종 혼합 용액은 지정된 질량비 또는 단백질의 몰 비율을 가져야한다 : B. 단백질은 일반적으로 얻기 위해 90:10의 질량비 75:25, 50:50, 25:75과 10:90을 섞는다 합금 솔루션의 광범위한 스펙트럼. 컨트롤과 같은 순수 단백질과 단백질 B 솔루션을 사용합니다. 단백질 B = R : (100-R) 단백질의 몰비와 블렌딩 용 용액. 볼륨 : 볼륨 B = R · (A의 MW) : (100-R) · (B의 MW)에 의해 (동일 하나 중량 %의 솔루션을 기반으로) 혼합 체적 비율을 계산합니다.
18. 즉시 필름 또는 다른 DESI를 형성하도록 PDMS 기판에 최종 솔루션에 캐스팅gned 재료. (참고 : 장시간 고농도 단백질 용액 합금 저장 안 더 응집체 인해 물에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 나중에 형성 할 수있다.). 필요한 경우, 이온이없는 증류수로 혼합 솔루션을 희석 및 솔루션에 추가 단백질 응집을 방지하기 위해 4 ° C의 냉장고에 보관하십시오.

변수 단백질 합금 재료의 3 제작

1. 열 분석에 의한 합금의 예측을 확인 ^3,9,31-35
   1. PDMS 기판을 준비하고 증류수에 담가을 청소합니다.
   2. PDMS 기판에 서로 다른 혼합 비율이 단백질 혼합 용액을 캐스팅.
   3. 필름이 형성 될 때까지 공기 흐름과 화학적 후드에서 적어도 12 시간 동안 용액을 건조 (참고 : 필름의 두께가 고정 될 수 있도록 다른 해법에 대해 동일한 양을 사용하여).
   4. PDMS 기판에서 단백질 합금 필름을 제거하고 깨끗한 요리에 배치합니다.
   5. 많은 열량 (DSC) 알루미늄 냄비 뚜껑 DSC 연구에 무게를 측정. 동일한 전체 중량을 갖도록 이동 및 덮개 쌍 매치 (뚜껑 팬 플러스 중량의 중량을 일정 중량 같음). 예를 들어, 여기에서 전체 뚜껑의 중량 및 22.50 mg의 팬을 사용하고,이 전체 중량과 뚜껑과 팬 조합 팔 세트 준비 하였다.
   6. 알루미늄 DSC 팬에 건조 단백질의 각 유형이 혼합 6 mg의 캡슐화 공정 3.1.5 자신의 일치 뚜껑을 밀봉하십시오. DSC는 그 대 기준 냄비 + 뚜껑의 열용량과 비교 것 자체가 열 분석 (주 동안 기록 될 샘플 만 열용량되도록 빈 팬과 뚜껑 쌍을 봉쇄하는 기준으로하여 시료로 사용될 샘플 + + 팬 뚜껑. 동일한 가중치로 인해, 프라이팬과 뚜껑으로부터 배경 열용량은 팬에 시료만을 열용량) 떠나는 설명 될 것이다.
   7. 와, DSC 악기로 밀봉 참조 및 샘플 팬을 넣어50 ㎖ / 분으로 무수 질소 가스 유동을 주입하고, 냉장 냉각 시스템이 장착. 샘플 측정 전에, DSC 기기는 먼저 각각의 열 흐름 및 온도에 대해 사파이어 및 인듐으로 보정되어야한다.
   8. 150 ° C까지 2 K / 분의 가열 속도에서 DSC를 미리 실행 한 다음 샘플 (전체 중량의 일반적으로 약 3-10%)에 남아있는 물 분자를 제거하기 위해 15 분 동안이 온도에서 유지. 빨리 25 ° C에 (10 K / 분) 냉각.
   9. (300) 2 K / 분의 가열 속도로 다시 DSC를 실행 ° C 또는 단백질 혼합물의 분해 피크 ⁽³⁴⁾ 나타날 때까지. 이 과정에서 서로 다른 온도에서의 단백질 시료의 열용량을 기록한다. DSC를 냉각하고 다른 혼합 비율로 새로운 샘플에 이전 샘플을 변경합니다.
   10. 계산하고 ^31-35 DSC ^{소프트웨어를} 사용하여 각 단백질 시료 블렌드 용 온도 곡선 대 열용량 플롯.
   11. m 판사이하의 방법으로 단백질 혼합 iscibility은 (도 4 및도 5 열 참조),이 단백질이 완전히 혼화 성인 경우, 이들은 "단백질 합금"이라고 할 수있다. 그렇지 용어 "단백질 복합체"는 중합체 서술 이론 ^48,49)에 따른 적절한 이름과 같다 :
       1. 개별 단백질 및 B는 각각의 단일 유리 전이 온도, T _g의 (A) 및 T의 _g (B) (도 5에서, 녹색 및 청색 커브보기) ^3,48을 가져야한다;
       2. 이것은 단일 유리 전이 온도가이 개별 단백질 성분, T _g의 (A) 및 T _g의 (B)의 사이에 일반적으로 그 중간 인 ^3,48 (도 5 참조);
       3. 비혼 화성 상 분리가 모두 T _g의 (A) 및 T _g의 (B)는 원래의 위치 (도 5)에서 나타나는 경우 수득하고, 각 T의 _{공정 g와} 블렌드된다조성물에 비례 높이는,이 단백질은 ^3,48 완전히 불혼 화성이다.
       4. 세미 혼화 복합 블렌드 타입 일 매우 광범위한 유리 전이을 갖거나 여전히 두 유리 천이를 가질 수 있으나, 각각은 순수한 단백질 성분 T의 _g (A) 및 T의 _g (B) (에 대해 서로 가까이 이주했다 ) 그림 5를 참조하십시오. 이 경우, 두 개의 단백질 성분 사이에 형성된 마이크로 이종 위상 구조가있을 수 있으며 상기 조성물은 지역마다 다를 수있다.
   12. (3.1.11.1) DSC에 나타낸 경우이며,이 단백질은 AB 합금 시스템 인 것을 확인할 수있는 경우에, 단백질 합금 재료를 제조하기 위해 이동.
2. 단백질 합금에 의해 광학 재료의 제조
   1. (제조 실험실에서) 생산 또는 캐스팅을 위해 지정된 지형 표면을 구입할 수 있습니다. 이러한 특정 예에서, 네 개의 회절 패턴 유리를 사용 하였다 (도 4광학).
   2. 접시에 회절 패턴으로 유리를 배치하고 패턴 화 된 표면이 위쪽으로 직면하고 있는지 확인하십시오.
   3. 유리 표면에 고르게 PDMS 용액을 확산하고, 충분히 표면 패턴을 커버 (: 사용자의 명령에 따라 ^23,44 일 혼합비 PDMS 용액 화분과 9에서 촉매 용액으로 이루어진다).
   4. 적어도 2 시간 동안 65 ° C의 오븐에 캐스팅 접시를 놓고 평평한 표면에있는 동안. PDMS 용액이 과정에서 고체 기판에 건조한다.
   5. 유리 PDMS 기판을 제거합니다. 회절 패턴은 이제 PDMS 표면에 전사한다.
   6. 적당한 구멍 펀치를 사용하여 회절 패턴 PDMS 금형을 펀치.
   7. 회절 패턴 PDMS 표면에 단백질 합금 해법 버려, 및 회절 패턴을 가진 필름을 얻기 위해, 적어도 12 시간 동안 건조한다.
   8. 불용성 단백질 합금 재료를 얻기 위해서는, DR의 전체 세트를 배치챔버의 바닥에 물 접시 60 ° C의 진공 오븐 (25 kPa의)에 PDMS 금형을 포함하여 Y 영화. 오븐 내의 공기를 밖으로 펌프와, 적어도 2 시간 동안 수증기 어닐링 샘플을 보자. (이 프로세스는 널리 사용되는 메탄올과 비교하는 방법. 온도 제어 수증기 어닐링 ^{(45)라고하며,} 이는 비단 물질 ⁽⁴⁵⁾ 유사 베타 시트 콘텐츠를 생성 할 수있다). 진공을 해제하고 집게를 사용하여 PDMS 기판에서 불용성 필름을 벗겨. 이 예를 들어, 야생 실크 길 들여진 실크 합금이 사용됩니다.
   9. 유리에 원래 패턴와 비교하여 필름의 회절 패턴의 품질을 테스트 (상기 일반 패턴에 대해 레이저 회절 패턴을 수집 예 마이크로 스케일 자세한 SEM 이미지를 수집).
3. 단백질 합금 재료에 전기 회로의 제조
   1. 유리 기판에 전기 회로 패턴을 제조하기 위해, 제 클레아일부 탈지를 이용한 NA 유리 슬라이드 메탄올 5 분 뒤에 아세톤 5 분 뒤에 5 분간 초음파 세정기,에 Alconox 같은 용매를 포함한다. 더 천천히 아세톤 그렇게 기판보다는 건조 떠나 잔류를 날려 할 수있는 것보다 증발하기 때문에 메탄올은 마지막에 사용됩니다.
   2. 180 L 액체 질소 듀어로부터 증발에 의해 생성 된 건조 질소 가스를 사용하여 유리 슬라이드 건조를 불어.
   3. 증착 챔버에 기판 재료를 소개한다. (이 지침은 스퍼터링 시스템이지만 다른 증착 기법이 사용될 수있다.)이로드 록 챔버로 설계된다면, 증착 챔버 내에서 진공이 크게 영향을받지. 30 mTorr로의 압력에로드 록을 벗어날 것.
   4. 로드 록과 메인 증착 챔버 사이에 게이트 밸브를 열어 챔버로 기판을 도입.
   5. 원하는 depositio에 압력을 Ar 가스 압력 조절기의 전원을 켜고 제어N 압력. 낮은 압력이 더 빠른 증착 된 필름을 부착 수익률 동안 높은 압력이 낮은 에너지 스퍼터링 금속 원자보다 균일 한 필름을 제공합니다. 압력의 범위는 20 mTorr로 잘 작동으로, 일반적으로 3 mTorr로 60 mTorr의 사이입니다.
   6. 금속은 다음 동조 회로가 상기 금속 타겟에 RF 전력을 유도하기 위해 요구되는 100 W.의 RF 전력을 이용하여 도포로부터 기판을 보호하는 셔터 상에 투영된다. DC 전력은, 금속 타겟 용의 RF 대신 사용될 수있다. 타겟으로부터 산화물 층과 오염물을 제거하기 위해 몇 분 동안 예비 스퍼터링.
   7. 셔터를 열고, 기판 상에 금속을 스퍼터링. 설명 된 구성에 대한 증착 속도는 분당 약 10 ㎚이다. 이 비율은 마그네트론 캐소드, 타겟의 두께와 스퍼터링 금속에서의 거리, 압력, 자석 강도 작동에 의존 할 것이다. 원하는 두께를 달성하기 위해, 증착 시간을 조정한다.
   8. 에서 코팅 된 유리 슬라이드를 제거실.
   9. 스피너를 사용하여, 필름의 표면에 포토 레지스트를 스핀 코팅. 많은 레지스트를 사용할 수있다. 이 경우를 들어, 긍정적 인 포토 레지스트를 사용 하였다.
   10. 저항이 건조 5 분 동안 90 ° C에서 영화, 부드러운 빵에 방사 한 후 레지스트.
   11. 단단히 저항에 대한 장치의 이미지와 함께 연락처 마스크를 배치합니다. UV 광원이 포토 레지스트를 노출하기 위해 사용된다. 노출은 10 초이지만, 광원의 세기에 따라 변화하고, 레지스트를 사용.
   12. 투사 된 이미지가 나타날 때까지 포토 레지스트 개발에 필름을 놓습니다. 현상 세척 멀리 그 중합체 결합의 파괴가 발생할 UV 광에 노출 된 레지스트. 즉시 화상이 나타난 후, 노광 된 포토 레지스트에 작업에서 현상 제를 중지 DI 물에서 필름을 담근​​다.
   13. 건조 질소 가스로 건조 필름을 불어.
   14. 사진 "하드 빵"에 15 분 동안 120 ° C의 오븐에 필름을 배치저항.
   15. 필름 냉각 한 후, 포토 레지스트에 의해 보호되지 않는 금속이 리프트 오프 할 때까지, 에칭 용액에 배치. 물에 딥 에칭을 정지합니다.
   16. 경화 된 포토 레지스트를 제거하기 위해 아세톤으로 씻어.
   17. 메탄올로 세척하여 건조 질소로 건조한다.
   18. 코팅 된 유리가 준비되면, 안경 단백질 합금 필름을 수득 적어도 12 시간 동안 이들을 유리 표면에 다른 단백질 합금 용액을 드롭하고, 건조. (이것은 제 두꺼운 단백질 합금 필름을 수득 5 중량 % 합금 해법 집중 제안한다.)
   19. 인해 소수성 - 친수성 상호 작용, 금속 박막 필름 ⁽⁵¹⁾ 표면에 부착 된 단백질 합금에 유리 표면으로부터 전달 될 ​​것이다. 집게를 사용하여 유리 기판으로부터 박막 금속 패턴과 단백질 합금 막을 벗겨.
   20. 아와 60 ° C의 진공 오븐 (25 kPa의)에 건조 필름을 배치, 불용성 단백질 합금 재료를 얻으려면챔버의 바닥에 ater에 접시. 오븐 내의 공기를 밖으로 펌프와, 적어도 2 시간 동안 수증기 어닐링 샘플을 보자. 진공을 해제하고 집게를 사용하여 기판으로부터 불용성 필름을 벗겨.
   21. 이러한 전기 저항으로 단백질 합금 필름에 금속 패턴의 전기적 특성을 테스트하고 유리에 원래의 패턴을 비교합니다.
4. 단백질 합금에 의해 제약 재료의 제조
   1. 단계 3.2에 설명 된대로 제약 화합물과 단백질 합금 영화를 제작하려면 먼저 PDMS 기판을 준비합니다. 증류 된 물에 의해 형성된 PDMS 기판을 청소합니다.
   2. 디졸브 또는 수용액 약제 학적 화합물을 분산. 균일하게 물을 제약 화합물을 혼합하는 초음파 또는 소용돌이를 사용합니다. 화합물은 물에 용해되지 않는 경우, 이온이없는 증류수에 균일 분포 분말을 분산.
   3. 원하는 질량 비율을 계산화합물 용액의 화합물 용액의 X 중량 %의 양 : 의해 단백질 합금에 화합물 화합물 용액의 단백질 합금 용액 X 중량 비율의 부피 (여기서는 1 중량 % 합금 용액을 사용 하였다). 단백질 합금 막에 원하는 화합물 막 밀도를 얻기 위해 비를 선택한다.
   4. 천천히 부 (2) 공정에서 2.16 같은 지시에 따라 단백질 합금 용액 화합물 용액을 혼합한다. (참고 : 겔화를 방지하기 위해 초음파 처리 또는 혼합하는 동안 솔루션을 와동하지 않음).
   5. PDMS 기판 상 혼합물의 계산 된 양을 붓고 약학 화합물의 설계를 포함하는 비 단백질 합금을 얻기 막 그것을 화학적 후드에서 적어도 12 시간 건조.
   6. 물리적 3.2 프로세스 3.2.8에서 동일한 명령 다음 막을 가교. 저밀도 (LD) 또는 하이 (HD)의 밀도 모델 불용성 약물 합금 필름의 예는도 4에서 볼 수 있었다 화학.

결과

(단백질 및 단백질 B 사이 예) 전형적인 단백질 - 단백질 상호 작용은 전하 - 전하 (정전) 명소, 수소 결합 형성, 소수성 - 친수성 상호 작용뿐만 아니라, 다이폴, 용매, 카운터 이온 및 특정 사이 엔트로피 효과가 포함되어있을 이 단백질의 도메인 (그림 2) ^3. 따라서, 근본적으로, 우리가 계산 시뮬레이션에 의한 이러한 상호 작용의 효과를 예측할 수있다.

토론

"합금"단백질 생산 시스템에서 가장 중요한 절차의 하나가 블렌딩 된 단백질의 상용 성을 검증하는 것이다. 그렇지 않으면, 안정된 특성과 동조하지 않고 단지 비혼 화성 혼합물을 단백질 또는 단백질 합성 시스템이다. 실험 열 분석 방법은, 이러한 목적을 위해 사용될 수 있고, 그들의 합금의 특성을 확인하기 위해. 단백질 - 단백질 상호 작용은 플로리 - 허긴의 격자 "용매"(우세한 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC)	TA Instruments, New Castle, DE, USA	N/A	You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity
SS30T Vacuum Sputtering System	T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA	N/A	With custom built parts; You can use any type of sputtering system to coat
VWR 1415M Vacuum Oven	VWR International, Bridgeport, NJ, USA	N/A	You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples