엔지니어링 섬유소 기반 조직의 면역 조직 및 제약 조건의 적용에서 생성하고 세포와 콜라겐 (재) 조직을 유도하는 스트레인

요약

이 모델 시스템은 비파괴 방식으로 내생 콜라겐 (재) 조직 리얼 타임으로 공부하는 데 사용할 수있는 근섬유 채워진 섬유소 젤에서 시작됩니다. 모델 시스템은 서로 다른 세포 소스, 중간 첨가제와 함께 사용할 수있는, 매우 조정할 수 있으며, 특정 요구에 쉽게 적용 할 수 있습니다.

초록

콜라겐 함량과 콜라겐 조직 개발 조직은 지방 조직의 긴장과 조직의 제약 조건에 의해 영향을받을 수있다. 조직 엔지니어는 미리 정의 된 콜라겐 구조와 조직을 만들려면 다음 원칙을 사용하는 것을 목표로하고 있습니다. 최종 조직 구조를 제어하는​​ 콜라겐 리모델링의 정확한 기본 프로세스의 완전한 이해는, 그러나, 부족이다. 특히, 약간은 조직의 기계적 부하 조건 변화에 따라 콜라겐 섬유의 (재) 방향에 대한 알려져있다. 우리는 더 콜라겐을 명료하게, 이축이 제한된 근섬유-시드 섬유소 구조로 구성된 체외 모델 시스템을 개발 I 님의 질문에 (재) 방향) 단축 정적 하중 조건 및 II에 이축 복귀) 이축 - 제약의주기 단축 하중은 FlexCell의 FX4000T 로딩 장치의 사용과, 방향로드의 변화 전후의 구조. 시간 경과 공 촛점 이미징은 vi를하는 데 사용됩니다비파괴 방식으로 콜라겐 (재) 방향을 sualize.

구조의 셀 콜라겐 조직은 실시간으로 시각화 할 수 있으며, 내부 참조 시스템은 우리가 시간 경과 분석을위한 세포와​​ 콜라겐 구조를 재배치 할 수 있습니다. 모델 시스템의 다양한 측면은 세포의 소스 또는 건강하고 병에 걸린 세포의 사용과 같이 조정할 수 있습니다. 첨가물 예를 MMPs를 추가 또는 인테그린을 ​​차단하는으로, 더 메커니즘을 기본 콜라겐 리모델링을 명료하게 할 수 있습니다. 구조의 모양과 크기는 쉽게 세포와 콜라겐 (재) 조직을 연구하는 고도 조정 가능한 모델 시스템의 결과로, 특정 요구에 적용 할 수 있습니다.

서문

심장 혈관 조직은 탁월한 하중 기능을 가지고 있습니다. 세포 외 기질의 콜라겐 섬유의 특정 내용과 조직의 하중 특성에 기여하고 전체 조직의 힘 ^1을 지배. 조직 공학 구조물의 기계적 조절이 사용됩니다 - 일반적으로 (주기적) 긴장 요법으로 구성 - 조직의 조직과 기계적 성질 ^2,3을 향상 할 수 있습니다. 미리 정의 된 콜라겐 구조를 가진 조직을 만드는 복잡한 조직 형상의 변형에 의한 콜라겐 조직의 완전한 이해는 아직 달성되었다 아닙니다. 이 개발 조직에 콜라겐 리모델링 우리의 제한된 지식에 주로 때문입니다. 기존 모델은 주로 정적 변형률 ^4-6의 사용과 콜라겐 리모델링의 최종 그물 결과에 대한 정보를 제공합니다. 여기에 우리가 영향을 받아 3D로, 실시간 방식으로 콜라겐 (재) 조직의 연구를 할 수있는 고도 조정 가능한 모델 시스템을 제공정적 또는 주기적 변형. 조직 구조는 구조의 모든 콜라겐 내생 것을 보장 섬유소 기반으로하고 있습니다. 구조의 셀 콜라겐 조직은 시각, 그리고 내부 참조 시스템은 우리가 시간 경과 분석을위한 세포와​​ 콜라겐 구조를 재배치 할 수 있습니다. 이러한 세포는 기초하여 향상된 여분의 세포 매트릭스 생산 및 엔지니어링 심장 혈관 조직 ⁷ 매트릭스와 우리의 설립을 사용 개조 할 수있는 능력에 대한 알려져 있기 때문에이 프로토콜에서 우리는, 인간 베나 Saphena 세포 (HVSCs)를위한 모델 시스템의 사용을 설명합니다 드 Jonge 등. ⁸ 일에

프로토콜

1. 인간 베나 Saphena 세포의 배양

1. SCHNELL 등으로 프로토콜에 따라 보조 자료를 사용하는 지침에 따라 기증자로부터 얻은 베나 saphena 마그나, ^9.에서 세포를 분리하고 액체 질소에 이러한 저장합니다. 여섯 잘 플레이트 문화에 2 × 2 ㎜의 한 기증자 컷 조각의 대정 saphena 마그나의 부분에서. 잘 당 2 개를 사용합니다. 일반적으로 충분한 세포는 액체 질소 0.25 X 10 ⁶ 세포와 약 3 병을 채우기 위해 얻을 수 있습니다. HVSCs는 vimentin에, 최근 desmin의 어떤 표현 α 평활근 액틴 ^10을 표현하는 모집단의 표현을 표시하여, 면역 조직으로 특징입니다. 다음 세포의 수를 증가 액체 질소에서 세포를 해동 프로토콜을 시작합니다.
2. T75 조직 문화 플라스크에 한 병에서 세포를 배치하고 고급 DMEM 50 ML 태아 소 혈청 (FBS), 5 ML 페니실린 / 미팅 성장 매체 (GM)를 추가스트렙토 마이신 5 ML L-glutamax. 2~3일 모든 매체를 변경합니다.
3. 세포는 약 14 일 후에 합류 성장. 스토어 0.5 액체 질소에 한 병에서 x 10 ⁶ 세포는 통로 1이라고합니다.

참고 : 세포의 냉동 HVSCs을 수확 할 때 필요하지 않습니다,하지만 전적으로 저장하는 데 사용됩니다.

4. T175 조직 배양 플라스크에 한 병에서 HVSCs를 놓고 GM을 추가합니다. 2~3일 모든 매체를 변경합니다. 세포는 약 7 일 이후에 합류 성장. 상점 3 액체 질소에 한 병에서 x 10 ⁶ 세포는 통과 2라고도합니다.
5. rollerbottle에 한 병에서 세포를 배치하고 GM을 추가합니다. 2~3일 모든 매체를 변경합니다. 세포는 대략 8 일 후에 합류 성장. 하나 rollerbottle은 약 20 ~ 30 × 10 ⁶ 세포를 포함하고 있습니다. 통과 6 문화 세포집니다. 세포의 표현형이 변경 될 수 있기 때문에, 통과 9보다 높은 통로의 셀을 사용하지 마십시오.

2. 섬유소 기반 조직 구문 공학

1. 경화제 (10시 1분)와 탄성 중합체를 혼합하여 실리콘 접착제를 준비합니다. 벨크로의 7 개의 x 3mm 직사각형 세그먼트를 잘라. 십자가를 형성하고, 벨크로 스트립 사이에 3mm의 제곱 공간을 남겨 유연한 막과 6 잘 문화 판에 접착제 벨크로.

주 : 만 벨크로의 부드러운면을 사용하고이 쪽을 위쪽으로 직면하고 있습니다. 때 접착 벨크로 만 실리콘 접착제 벨크로 커버, 잘 걸쳐 접착제를 전파하지 않는다. 문화 플레이트 실리콘 막 바닥을 가지고 있기 때문에, 플레이트에 쉽게 접착을 보장하기 위해 유연한 세포막을 보강 웰 플레이트 아래에 뭔가를 사용합니다.

2. 접착제의 경화을 보장하기 위해 60 ° C의 오븐에서 하룻밤 실리콘 접착제를 건조. 30 분 동안 우물과 부화에 70 % 에탄올을 첨가하여 살균. PBS로 3 배 씻어 아에서 모든 PBS를 제거LS와 벨크로. 30 분 동안 UV 밑에두고 사용할 때까지 멸균 유지합니다.
3. 조직 공학 GM으로 구성된 중간 (TM) 및 L-아스 코르 빈산 2 - 인산의 130 밀리그램을 준비합니다.
4. TM에 1 밀리그램 / ML ε-아미노 카프로 산 (ACA)를 추가합니다. ACA는 굴욕 ^{(11)로부터} 섬유소를 방지하기 위해 문화의 첫번째 7 일에 사용됩니다. 또한, aprotinin을 사용할 수 있습니다.
5. 덩어리 형성을 방지하기 위해, 피브리노겐은 오픈 전에 실내 온도에 도달 할 수 있습니다. 수풀 피브리노겐없이 더 쉽게 용해됩니다. ACA와 보충 10 ㎎ 실제 단백질 / ㎖ TM ^7의 농도 섬유소를 용해. 살균 필터 피브리노겐 용액은 여러 개의 필터가 필요할 수 있습니다. 사용할 때까지 얼음에 저장합니다.

참고 : 너무 많은 거품 형성을 방지하기 위해 부드럽게 피브리노겐 혼합 용해.

6. ACA와 보충 10 IU / ㎖ TM ^7의 농도에 트롬빈을 녹입니다. 사용할 때까지 얼음에 저장합니다.

참고 : 얼음 저장은 트롬빈과 섬유소의 조기 겔화를 방지하기 위해 필요합니다.

7. GM과 개수에 resuspend을 세포를 Trypsinize.
8. 섬유소 기반의 조직 구조 (조직 공학 심장 판막 ⁷ 방법에 따라 농도) 시드 15 X 10 ⁶ 세포 / ML을 사용합니다. 단일 젤 100 μL GOF 엘, 따라서 1.5 X 10 ⁶ 세포로 구성되어 있습니다. 될 것입니다 젤의 수만큼 원심 분리기 튜브의 결과로, 하나의 원심 분리 관에 1.5 X 10 ⁶ 세포를 넣습니다.
9. 7 분 350 XG에서 세포를 원심 분리하고 상층 액을 버린다. 50 μl의 트롬빈에있는 세포를 resuspend을. 이 현탁액에 파란색 형광 폴리스티렌 마이크로 4 μl를 추가합니다. 유리 병에 피브리노겐의 50 μl를 넣습니다. 세포를 50 μL 트롬빈을 차지하기 위해 피펫을 사용합니다. 100 μL에 피펫의 볼륨을 높입니다. 트롬빈의 50 μL 솔루션을 피펫피브리노겐을 유리 병에 세포는 트롬빈과 섬유소를 혼합하고, 100 ㎕의 혼합물을 차지합니다.

참고 : 형광 폴리스티렌 마이크로는 이미지 분석을위한 내부 기준 마커로 사용됩니다. 혼합 트롬빈과 피브리노겐은 신중 혼합물을 pipetting하여 기포의 형성을 방지합니다. 기포는 섬유소 젤에 구멍 발생합니다.

10. 에와 벨크로 스트립 사이에 젤 혼합물을 피펫. 섬유소 젤의 일반적인 겔화 시간은 한 구성 요소가 혼합되어, 20 초 순서입니다.

주 : 혼합물이 잘 판에 피펫되기 전에 겔화를 방지하기 위해 가능한 한 빨리이 작업을 수행합니다. 세포와 구슬을 사용하기 전에 연습합니다.

11. ACA와 문화의 TM을 추가하기 전에 겔화 할 수 있도록 가습 95 % 공기 / 5 % CO ₂ 배양기에서 37 ° C에서 30 분 동안 현탁액을 품어.
12. 최초 7 일 ACA 2-3일 모든과 TM을 대체합니다. 일주가 ACA없이 배양 할 수 후 젤은 충분히 안정적이다. 첫 주 후 2-3 일마다 TM을 대체합니다. 잘 당 TM 6 ML을 추가합니다. 하루에 12 세포는 시각화를위한 충분한 콜라겐을 생산했다.

3. 스트레인 및 제약 조건의 적용 변형 유도를 변경

1. 정적 변형은 세포 견인 및 압축 ^12에 의한 직접 세포에 의해 적용됩니다. 콜라겐 조직 개편을 유도하기 위해, 조직이 한 방향으로 두 개의 벨크로 스트립에서 느슨한 구성 잘라. 단방향 제약 (그림 1A)이 발생합니다. 구조는 다음 안정 충분하고 콜라겐이 입금 된 이후, 12 일에이 문제를 수행합니다.
2. FlexCell의 FX4000T 시스템의 사용과 유연한 막과 문화 접시의 바닥에 진공을 적용하여주기적인 변형을 적용합니다. 로드 포스트 위에 (이는 일의 한 부분에베이스 플레이트에 플레이트를 놓고전자 주기적 로딩 장치). 펌프는 멤브레인 위에 진공을 적용하여 아래 누워 사각형 포스트에 막 가져옵니다. 조직의 십자가 모양의 첨부 파일로 인해 막 (벨크로 통해) 생성하고 직사각형 게시물 적용주기 변형 (그림 1B) 단축됩니다.
3. 처음에는 순환 변형 응용 프로그램이 6 일째에 시작하기 전에, 초기 기계적인 무결성을 달성하기 위하여 5 일 동안 정적 문화를 사용합니다. 진공 펌프 컨트롤러에 프로그램은 주기적 얼룩 프로토콜입니다. 예를 들어 일축 방향으로 ^13로, 이전에 설정된 간헐적으로 순환 변형 프로토콜을 사용합니다. 이 3 시간 휴식 기간과 교대로 3 시간의 기간 0 ~ 5 % 변형에 긴장 1 Hz에서와 사인파의 간헐적 인 긴장으로 구성되어 있습니다. 정렬 콜라겐 조직을 유도 7 일이주기적인 변형 프로토콜을 수행합니다.
4. 일반적으로 십이일 후 HVSCs은 정렬 된 콜라겐의 조직을 생산N. 정렬 콜라겐 조직에 도달하면, 원래의 변형 방향에 수직으로, 단축 주기적 변형 방향을 변경합니다. 90 ° 직사각형 게시물을 설정하여이 작업을 수행합니다.

4. 시각화 세포와 콜라겐

1. 세포 생존이나 콜라겐 형성을 방해하지 않는 프로브를 활성화 실시간 콜라겐 리모델링, 라벨 샘플을 시각화합니다. 찬란 세포의 세포질과 콜라겐 얼룩 프로브를 사용합니다.
2. 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 또는 차 고조파 세대 780 nm의 500-550 nm의 사이의 감지에 여기에자가 형광 ^14을 사용하여 콜라겐 구조를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
3. 3 시간의 휴식 기간 동안 주기적으로 긴장 샘플, 설치 및 인큐베이터에서 배양 접시를 제거하고 세포와 콜라겐을 시각화하기 위해 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경에 그 (것)들을 수송한다.

결과

이 모델 시스템은 배양 근섬유 - 시드 섬유소 젤 수 있습니다. 그림 1A 정적 이축 제약 조건 첫 번째 배양 조직을 보여줍니다. 조직의 제약 단축 정적 제약 조건을 만들려면 두 가지 조건에서 섬유소 젤을 절단하여 발표 및 조직 압축 및 후 개조 (그림 1A)입니다. 주기적인 변형의 경우, 조직은뿐만 아니라 정적 이축 제약 조건 하에서 배양한다. 후에 5 일주기 단축 스트레인?...

토론

세포 인구 섬유소 구조의 설명 모델 시스템은 세포와 콜라겐의 연구에 큰 잠재력을 가지고 (재) 조직 (드 Jonge 등. ^15), 조직 공학의 목적으로 사용될 예. 초기 세포 캐리어로 섬유소를 사용하여 섬유소 분해 한 후, 조직은 세포와 내생 매트릭스에서만 생성됩니다. 이러한 방법으로, 세포 경계 강성 ¹² 감지, 또는 변형 방지를 표시 수축력에게 ^{16, 17을} 적용하여, ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plastic	Greiner		Includes culture flasks and pipettes
Advanced DMEM	Gibco	12491
Fetal bovine serum	Greiner	758075
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomer and curing agent	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regular store		You can buy this at a regular store, only use the soft side
Bioflex culture plates	Flexcell Int	BF-3001U	Untreated
L-Ascorbic Acid 2-phosphatase	Sigma	A8960
ε-Amino Caproic Acid	Sigma-Aldrich	D7754
Bovine thrombin	Sigma	T4648
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630
0.45 syringe filter	Whatmann (Schleicher and Scheul)	10462100
Polystyrene microspheres	Invitrogen	F-8829	Blue fluorescent, 10 μm diameter
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Includes rectangular loading posts
Cell Tracker Orange	Invitrogen Molecular Probes	C2927
CNA35-OG488			Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss		LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode
Amphotericin	Gibco	15290-018	Needed for cell isolation