Ingegneria fibrina a base di tessuto costrutti da miofibroblasti e applicazione di vincoli e la tensione per indurre Organizzazione cellulare e collagene (Re)

Riepilogo

Questo sistema modello parte da un gel di fibrina myofibroblast popolata che può essere usato per studiare collagene endogeno (ri) organizzazione in tempo reale in modo non distruttivo. Il sistema modello è molto sintonizzabile, in quanto può essere usato con sorgenti cellulari differenti, additivi medie, e può essere facilmente adattato alle esigenze specifiche.

Abstract

Contenuto di collagene e di organizzazione per lo sviluppo di tessuti di collagene possono essere influenzati dai ceppi dei tessuti locali e di vincolo dei tessuti. Ingegneri dei tessuti hanno lo scopo di utilizzare questi principi per creare tessuti con architetture collagene predefiniti. Una piena comprensione delle esatte sottostanti processi di rimodellamento del collagene per controllare l'architettura del tessuto finale, però, è carente. In particolare, si conosce poco l'orientamento (ri) delle fibre di collagene in risposta ai cambiamenti nelle condizioni di carico meccanico del tessuto. Abbiamo sviluppato un sistema modello in vitro, composto da bi-costretti myofibroblast testa di serie fibrina costrutti, per chiarire ulteriormente il collagene (ri) orientamento in risposta ad i), tornando biassiale a condizioni di carico statico monoassiali e ii) ciclica monoassiale carico del bi-vincolato costrutti prima e dopo un cambio di direzione del carico, con l'uso del dispositivo di caricamento Flexcell FX4000T. Time-lapse imaging confocale viene utilizzato a visualize collagene orientamento (ri) in modo non distruttivo.

Organizzazione cellulare e collagene nei costrutti possono essere visualizzati in tempo reale, e di un sistema di riferimento interno ci permette di trasferire le cellule e le strutture di collagene per l'analisi time-lapse. Vari aspetti del sistema modello può essere regolata, come fonte cellulare o l'uso di cellule sane e malate. Additivi possono essere utilizzati per chiarire ulteriormente i meccanismi sottostanti rimodellamento del collagene, per esempio con l'aggiunta di MMPs o blocco integrine. Forma e dimensioni del costrutto possono essere facilmente adattati alle esigenze specifiche, risultante in un sistema modello per lo studio altamente sintonizzabile organizzazione cellulare e collagene (ri).

Introduzione

Tessuti cardiovascolari hanno una funzione di primo piano portante. In particolare, i contenuti e l'organizzazione delle fibre di collagene nella matrice extracellulare contribuire alle proprietà portanti e dominare la forza del tessuto complessivo ^1. In ingegneria dei tessuti è utilizzato condizionata meccanica del costrutto - costituiti in genere da (ciclico) regimi sforzare - per migliorare l'organizzazione dei tessuti e le proprietà meccaniche ^2,3. Piena comprensione di organizzazione collagene deformazione indotta in geometrie complesse dei tessuti per creare tessuti con architettura collagene predefinito non è stato ancora raggiunto. Ciò è dovuto principalmente alla nostra conoscenza limitata del rimodellamento del collagene nei tessuti sviluppo. Modelli esistenti forniscono principalmente informazioni sul risultato netto finale di rimodellamento del collagene con l'utilizzo di sforzo statico ^4-6. Qui forniamo un sistema modello altamente sintonizzabile che consente lo studio del collagene (ri) organizzazione in un modo tempo reale, in 3D, sotto influenzadi deformazione statica o ciclico. I costrutti tissutali sono basati fibrina, assicurando che tutta collagene nel costrutto è endogena. Organizzazione cellulare e collagene nei costrutti viene visualizzato, e un sistema di riferimento interno ci permette di trasferire le cellule e le strutture di collagene per l'analisi time-lapse. In questo protocollo verrà descritto l'uso del sistema modello per umani Vena safena Cells (HVSCs), poiché queste cellule sono noti per la loro maggiore produzione di matrice extracellulare e la capacità di rimodellare la matrice e il nostro uso stabilita in ingegnerizzati tessuti cardiovascolari ^7, basato sul lavoro di de Jonge et al. ⁸

Protocollo

1. Cultura di umani Vena safena Cells

1. Isolare le cellule dalla vena safena magna, acquisita da un donatore in conformità alle linee guida per l'uso materiale secondario, secondo il protocollo di Schnell et al. ⁹ e memorizzare questi in azoto liquido. Dalla parte della vena safena magna da un donatore pezzi tagliati di 2 x 2 mm a coltura in una piastra a sei pozzetti. Usare 2 pezzi per pozzetto. Generalmente sufficienti cellule possono essere ottenute per riempire circa 3 flaconcini con 0,25 x 10 ⁶ cellule in azoto liquido. HVSCs sono caratterizzati come miofibroblasti, mostrando espressione di vimentina, nessuna espressione di desmin e una sottopopolazione che esprime muscolo liscio α actina ^10. Successiva avviare il protocollo di scongelare le cellule dal azoto liquido per aumentare il numero di cellule.
2. Posizionare le cellule da una fiala in un pallone di coltura tissutale T75 e aggiungere mezzo di crescita (GM), costituito Avanzato DMEM, 50 ml di siero bovino fetale (FBS), 5 ml di penicillina /streptomicina e 5 ml di L-glutamax. Cambiare media ogni 2-3 giorni.
3. Cellule crescono confluente dopo circa 14 giorni. Negozio 0.5 x 10 ⁶ cellule in un flaconcino in azoto liquido, indicato come passaggio 1.

Nota: Congelamento delle cellule non è necessario quando la raccolta HVSCs, ma viene esclusivamente utilizzato per l'archiviazione.

4. Posizionare i HVSCs da una fiala in un pallone di coltura tissutale T175 e aggiungere GM. Cambiare media ogni 2-3 giorni. Cellule crescono confluente dopo circa 7 giorni. Negozio 3 x 10 ⁶ cellule in un flaconcino in azoto liquido, indicato come passaggio 2.
5. Mettere le cellule da una fiala in un rollerbottle e aggiungere GM. Cambiare media ogni 2-3 giorni. Cellule crescono confluenti circa dopo 8 giorni. Uno rollerbottle contiene circa 20-30 x 10 ⁶ cellule. Cellule di coltura fino al passaggio 6. Non utilizzare cellule di un passaggio superiore passaggio 9, poiché fenotipo cellulare può cambiare.

2. Ingegneria di costrutti tissutali a base di fibrina

1. Preparare colla siliconica miscelando l'elastomero con il catalizzatore (10:1). Tagliare 7 x 3 mm segmenti rettangolari di velcro. Incollare il velcro in una piastra di coltura 6 bene, con membrane flessibili per formare una croce, e di lasciare uno spazio quadrato di 3 mm tra le strisce di velcro.

Note: usare il lato morbido del velcro solo e questo lato verso l'alto. Per incollare il velcro, coprono solo il velcro con colla al silicone, non si diffondono colla tutto il bene. Poiché le piastre di coltura hanno fondo membrana di silicone, usare qualcosa sotto la piastra bene per rinforzare le membrane flessibili, per garantire il facile incollaggio alla piastra.

2. Asciugare la colla siliconica durante la notte in un forno a 60 ° C per garantire indurimento della colla. Sterilizzare con l'aggiunta di 70% EtOH ai pozzetti ed incubare per 30 min. Risciacquare 3 volte con PBS e rimuovere tutti PBS dal welLS e il velcro. Mettere sotto UV per 30 minuti e mantenere sterile fino al momento dell'uso.
3. Preparare Tissue Ingegneria medie (TM), costituito da GM e 130 mg di acido L-ascorbico 2-fosfato.
4. Aggiungere 1 mg / ml di acido caproico ε-Amino (ACA) alla TM. ACA è usato per i primi 7 giorni di coltura per impedire la fibrina dalla degradante ^11. Alternativamente, aprotinina può essere utilizzato.
5. Per prevenire la formazione di ciuffo, fibrinogeno permettono di raggiungere la temperatura ambiente prima dell'apertura. Senza ciuffi fibrinogeno si dissolverà più facilmente. Sciogliere fibrinogeno ad una concentrazione di 10 mg effettivo proteina / ml TM ⁷ integrato con ACA. Filtro sterile la soluzione di fibrinogeno, è necessaria la più filtri. Conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso.

Nota: Per sciogliere mix fibrinogeno delicatamente per evitare la formazione di schiuma eccessiva.

6. Sciogliere trombina ad una concentrazione di 10 UI / ml TM ⁷ integrato con ACA. Conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso.

Nota: Stoccaggio in ghiaccio è necessaria per evitare la gelificazione precoce di trombina e fibrinogeno.

7. Trypsinize le cellule, risospendere in GM e conteggio.
8. Utilizzare 15 x 10 ⁶ cellule / ml per semina i costrutti tissutali fibrina-based (concentrazione basato su metodi di ingegneria tissutale valvole cardiache ^7). Un unico gel consiste di 100 pl gof el, e quindi di 1,5 x 10 ⁶ cellule. Mettere 1,5 x 10 ⁶ cellule in una provetta da centrifuga, risultante in altrettanti tubi da centrifuga come il numero di gel che verranno fatte.
9. Centrifugare le cellule a 350 xg per 7 minuti e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 50 ml di trombina. Aggiungere 4 ml di blu fluorescente microsfere di polistirolo a questa sospensione. Mettere 50 ml di fibrinogeno in un flaconcino. Utilizzare una pipetta a prendere il 50 trombina microlitri con le cellule. Aumentare il volume della pipetta 100 microlitri. Pipettare la soluzione 50 ml di trombina concellule nel flaconcino con il fibrinogeno per mescolare la trombina e fibrinogeno, e occupano la miscela di 100 ml.

Nota: La fluorescente microsfere di polistirolo vengono utilizzate come marcatori di riferimento interni per l'analisi dell'immagine. Quando trombina e fibrinogeno miscelazione, impediscono la formazione di bolle d'aria pipettando accuratamente la miscela. Bolle d'aria si tradurrà in fori nel gel di fibrina.

10. Pipettare il composto in gel e tra le strisce di velcro. Il tipico tempo di gelificazione per i gel di fibrina, una volta che i componenti sono miscelati, è dell'ordine di 20 sec.

Note: Fate questo il più rapidamente possibile per evitare la gelificazione prima che la miscela viene pipettato nella piastra bene. Pratica prima di utilizzare le cellule e perline.

11. Incubare sospensioni per 30 min a 37 ° C in un umidificata 95% aria / 5% CO ₂ incubatore per consentire gelificazione prima di aggiungere cultura TM con ACA.
12. Sostituire il TM con ACA ogni 2-3 giorni per i primi 7 giorni. I gel sono abbastanza stabili dopo una settimana per essere coltivato senza ACA. Dopo la prima settimana TM sostituire ogni 2-3 giorni. Aggiungere 6 ml di TM per pozzetto. Il giorno 12 celle hanno prodotto abbastanza collagene per la visualizzazione.

3. Applicazione Strain e indurre cambiamenti in Strain e Vincoli

1. Deformazione statica viene applicato direttamente dalle cellule, dovute alla trazione cella e compattazione ^12. Per indurre il collagene di riorganizzazione, ha tagliato il tessuto costruire sciolto da due strisce di velcro in una sola direzione. Ciò si traduce in vincoli unidirezionali (Figura 1A). Eseguire questo il giorno 12, dal momento che il costrutto è quindi abbastanza stabile e il collagene è stato depositato.
2. Applicare deformazione ciclica applicando un vuoto al fondo delle piastre di coltura con membrane flessibili, con l'utilizzo del sistema FX4000T Flexcell. Posizionare le piastre su una piastra di base, sulla parte superiore del post carico (che sono una parte del secolodispositivo di carico ciclico e). La pompa si applica un vuoto sulla membrana e tira in tal modo la membrana sopra il post rettangolare giace sotto. Dovuto alle allegati sagomate trasversali del tessuto costruisce alla membrana (attraverso il velcro) e il post rettangolare il ceppo ciclico applicato è monoassiale (Figura 1B).
3. Inizialmente, utilizzare la cultura statica per 5 giorni per raggiungere l'integrità meccanica iniziale, prima dell'applicazione di sforzo ciclico a partire dal giorno 6. Programma un protocollo macchia ciclico nel regolatore per la pompa del vuoto. Ad esempio, utilizzare un protocollo ceppo ciclica intermittente precedentemente stabilito, con la direzione monoassiale ^13. Questo consiste in un ceppo intermittente di un'onda sinusoidale con 1 Hz, tendendo da 0 a 5% di deformazione, per periodi di 3 ore, alternate con periodi di riposo 3 ore. Eseguire questo protocollo sforzo ciclico per 7 giorni, inducendo una organizzazione collagene allineate.
4. In genere dopo 12 giorni HVSCs hanno prodotto un organizatio collagene allineaten. Dopo aver raggiunto una organizzazione collagene allineata, cambiare la direzione di deformazione ciclica uniassiale, per essere perpendicolare alla direzione ceppo originale. Fare questo girando i posti rettangolari di 90 °.

4. Visualizzare cellule e collagene

1. Per visualizzare attivo, in tempo reale rimodellamento del collagene, i campioni di etichette con le sonde che non interferiscono con la vitalità delle cellule o la formazione di collagene. Utilizzare sonde a macchiare fluorescently citoplasma della cellula e collagene.
2. In alternativa generazione di seconda armonica con microscopio confocale a scansione laser può essere usato per visualizzare le strutture di collagene mediante autofluorescenza ^14, con eccitazione a 780 nm e il rilevamento tra 500-550 nm.
3. Rimuovere le piastre di coltura dalla configurazione e l'incubatore, per i campioni ciclicamente tese durante il periodo di riposo di 3 ore, e trasportarli in un microscopio confocale a scansione laser per visualizzare le cellule e collagene.

Risultati

Questo sistema consente di effettuare la coltura myofibroblast teste di serie gel di fibrina. Figura 1A mostra un tessuto coltivato prima sotto vincoli biassiali statiche. Vincoli dei tessuti vengono rilasciati tagliando il gel di fibrina da due vincoli, per creare vincoli statici monoassiali e compatta del tessuto e rimodella dopo (Figura 1A). Per deformazione ciclica, il tessuto viene coltivato sotto vincoli biassiali statiche pure. Dopo 5 giorni deformazione uniassiale ciclico può e...

Discussione

Il sistema modello descritto costrutti di fibrina cellula-popolate ha un grande potenziale per lo studio della cellula e collagene (ri) organizzazione (de Jonge et al. ^15), ad esempio da utilizzare per scopi di ingegneria tissutale. Utilizzando fibrina come il vettore cellula iniziale, dopo la degradazione della fibrina, un tessuto è creato con cellule e unica matrice endogena. In questo modo, le cellule sono stimolate a reagire a ceppo, o statico o ciclico in natura, applicando forze contr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plastic	Greiner		Includes culture flasks and pipettes
Advanced DMEM	Gibco	12491
Fetal bovine serum	Greiner	758075
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomer and curing agent	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regular store		You can buy this at a regular store, only use the soft side
Bioflex culture plates	Flexcell Int	BF-3001U	Untreated
L-Ascorbic Acid 2-phosphatase	Sigma	A8960
ε-Amino Caproic Acid	Sigma-Aldrich	D7754
Bovine thrombin	Sigma	T4648
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630
0.45 syringe filter	Whatmann (Schleicher and Scheul)	10462100
Polystyrene microspheres	Invitrogen	F-8829	Blue fluorescent, 10 μm diameter
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Includes rectangular loading posts
Cell Tracker Orange	Invitrogen Molecular Probes	C2927
CNA35-OG488			Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss		LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode
Amphotericin	Gibco	15290-018	Needed for cell isolation