세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

요약

리스테리아 균은 자주 세포 내 기생의 연구를위한 주요 모델로 사용되는 그람 양성 세균 병원체이다. 후반 L. 이미징 소 간섭 RNA 화면의 문맥 내 감염 단계 모노 사이토 겐은 표적 숙주 세포의 세균 감염에 필요한 세포 경로의 글로벌 학습을 허용한다.

초록

세균의 세포 내 병원균 절묘하게 조작 및 호스트 대상 조직의 감염에 필요한 세포의 기능을 파괴하는 그들의 능력에 의한 세포 신호 폭포를 해부하는 분자 도구로 생각 될 수있다. 이러한 세균성 병원균 가운데, 리스테리아 균은 세포 면역 반응의 특성에 세포 내 기생에 대한 패러다임으로 사용 된 그람 양성 미생물이며, 세포 골격과 막 인신 매매의 역 동성을 제어하는 분자 경로의 발견에서 쓸모있는 역할을했다한다. 이 문서에서는, 우리는 L. 늦은 세포 감염 단계의 검출을위한 강력한 현미경 분석을 설명 모노 사이토는 InlC, 감염된 세포의 세포질에 축적 박테리아 분비 단백질의 형광 표지에 근거,이 분석은 숯불하기 위해 자동화 고 처리량 소 간섭 RNA 스크린에 연결될 수있다감염의 상향 또는 하향 조절에 관여 세포 신호 전달 경로를 acterize.

서문

그람 양성 세균 리스테리아 균은 숙주 세포에 침입의 국제화 공포를 방해하고 숙주 세포 ^1의 세포질에서 복제 식품 매개 병원체이다. L. 세포 및 동물 모델에서 관찰 된 세균의 독성 특성의 지속성과 관련된 실험실 컨텍스트 (급속한 성장, 건강한 개인에 대한 낮은 독성)의 조작의 용이성 모노 사이토 겐 (용혈성 활동, 백혈구가)의 주요 모델로 1960 년에 처음 사용 허용 세포 내 기생의 감염 ^2에 대한 세포 성 면역의 이론적 기초의 설립을위한 연구. 1980 년대 후반과 1990 년대 초반, 세균의 세포주기 ^3뿐만 아니라 가장 중요한 세균의 독성의 분자 특성의 해부는 ^4-7 L.의 사용을 선호하는 요인 조작 및 스터드의 핵심 분자 도구로 모노 사이토 제네스숙주 세포 기능의 Y. 리스테리아 속에서 무독성의 존재 (L.의 innocua)과 악성 (L. monocytogenes에) 종 비교 게놈 연구 ⁸ 도로를 포장하는, 함께 완전한 L.의 최근 설립과 함께 모노 사이토는 L.의 진화에 대한 우리의 이해를 증가, ⁹ 사체 인간 병원체 등의 감염을위한 모델 시스템으로 모노 사이토는 ^{10 연구.}

L. monocytogenes에 자신의 숙주 세포 수용체 각각 E-cadherin의와 메트로, ^{11 ~ 12과} 박테리아 표면 단백질 InlA 및 InlB의 상호 작용에 따라 숙주 세포로의 내면화를 유도한다. 초기 후보 기반 연구의 InlB - 중요한 음향과 InlA 침략의 통로 ^(13)와 phosphoinositide 3 - 키나제 (PI 3-K)의 중요한 구성 요소로서 α / β의 catenins - 굴지 링크의 식별에지도 의존 침공 casca데 ^{14 ~ 15.} 프로테오믹스 및 기능 기반의 분석 이후에 허용 된 새로운 골격 요소 ^(16)와 숙주 세포의 침공에 필요한 지질 두 번째 메신저 ^(17)의 식별. 전사 연구 ^(18)와 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스 ^(19)는 최근 호스트 신호 폭포의 활성화와 L. 동안 면역 반응의 억제에 관한 새로운 빛을 발산했다 감염 모노 사이토 겐. 시스템 생물학은 작은 간섭 RNA에 의한 유전자 (kinomes, 전체 게놈)의 큰 세트의 불 활성화에 기반 접근 (siRNA의) 침묵은 최근 식균 작용을 포함한 특정 세포 기능의 컨텍스트에서 폭포 신호 글로벌 호스트의 분석을위한 새로운 길을 열고있다 병원체 내면화 ^20. 게놈 전체의 siRNA 화면은 이전에 L.의 감염에 필요한 세포의 계곡을 조사하기 위해 수행 된 식세포 초파리 모노 사이토 제네스 S2 세포를 ^{21 ~ 22} 만, 이러한 유형의 분석은 비 식세포로 수행되지 않은, 생체 내에서 감염을위한 중요한 표적을 나타낸다.

우리는 L.에 의해 감염의 후반 단계의 현미경 검출을위한 프로토콜을 최적화 한 상피 세포 내 세균 항목의 높은 처리량의 siRNA 연구에 적합 모노 사이토 제네스. 우리의 분석은 매우 침습적 L. 활용 PRFA, L.의 주요 전사 조절에 점 돌연변이를 제시 변형 모노 사이토 겐 독성이 ^{6 요인} 리스테리아 모노 사이토 겐 (PRFA * 이름)이 돌연변이는 ²³ PRFA는 구조적으로 활성 렌더링 때문에, 그렇지 않으면 제대로 감염된 비 식세포의 세균 항목을 호의를 침공 단백질 InlA 및 InlB의 발현 증가로 연결됩니다. 감염에 대한 우리의 판독은 분비 된 세균의 단백질 InlC의 세포질 축적의 검출을 기반으로이 분자는내 세포질 L.에 의해 우선적으로 발현되는 형질 발현 이펙터 모노 사이토 ⁹ 참여는 박테리아 세포에 세포 ^24를 전파뿐만 아니라, 호스트 면역 반응 ^25을 변조하는뿐만 아니라. 세포 내 세균에 의해 InlC 분비의 형광 표시가 명확하게 감염되지 않은 세포에서 감염과 구별 할 수 있지만, 또한 엔드 포인트 이후의 여러 단계에서 감염을 해부하는 데 사용할 수있는 판독 나타냅니다뿐만 아니라 : 항목, 액포 탈출, 세포 내 세균을 증식과 세포 간 확산. 이 현미경 기반 프로토콜 따라서 L. 의한 숙주 세포의 감염에 관련된 세포 경로를 연구하는 siRNA를 스크린에 연결될 수있다 모노 사이토 제네스.

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프로토콜

1. 세포의 준비 및 세균 배양, 형질 도구 및 차 항체

1. 개인 L.를 분리 신선한 한천 플레이트를 준비 C. -80 °로 유지 세균 글리세롤 (세균의 액체 배양 물을 포화 glycerol/50 % 50 %)에서 식민지 모노 사이토 겐
   1. 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트에 고정 된 세균 글리세롤, 줄무늬 박테리아를 전송 (-80 ° C 유지) 알루미늄 랙을 사용.
   2. 48 시간 (또는 개별 박테리아의 식민지가 고립 될 수있을 때까지) 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
   3. (액체의 문화를 시드하는 데 사용됩니다) 1 개월 최대 시간 동안 4 ° C에서, 그 후이 작업 판을 보관하십시오.
   4. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 L.를 사용 혈청보기 1/2A EGDe.PrfA * 균주 모노 사이토 겐 만도 1에 예시 된 바와 같이 L. P14.PrfA 4B monocytogenes의 혈청 형은 * 변형은 유사한 결과를 제공합니다.
2. 그라 ATCC CCL2의 셀은 항생제의 부재 하에서 10 %의 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 성장된다.
3. 스크램블 (제어) 및 안티 메트로 된 siRNA는 블랙 384도 현미경 세포 배양 접시에로드 된 독립 풀.
   1. RNase가없는 물 500 μL에 siRNA를 160 pmol의 희석 잘 당이 솔루션의 5 μL (최종 농도 1.6 pmol의)를 추가합니다.
   2. 1 년을 최대 -20 ° C에서이 판을 보관하십시오.
4. 이전 ²⁵ 설명한대로 InlC-GST 재조합 단백질을 사용하여 예방 접종에 의해 얻어졌다 InlC 세균의 단백질에 대한 다 클론 토끼 항체.

2. siRNA를 세포 형질 반전

1. 감염 전에 72 시간 실온 아니라 각각의 RNase없는 물 5 μL에서 1.6 pmol의 siRNA에 포함 된 블랙 384도 현미경 세포 배양 접시에 가져다.
2. 300에서 3 분 동안 접시를 원심 분리기우물의 벽에 입금 된 수의 siRNA를 가지고 실온에서 RCF.
3. 0.4 % 리포 펙 타민 RNAiMAX 보충 실내 온도 DMEM을 준비합니다.
4. (siRNA를 추가하기 전에 더 이상 20 분 이상 형질 매체를 배양하지 않는다) 각 웰에 DMEM / RNAiMAX 형질 매체의 25 μl를 추가합니다.
5. 형질 감염 용액으로 siRNA를 혼합 앞뒤로 플레이트를 놓은 후 siRNA를 리포 펙 타민 - 복합체 형성하도록 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 유지한다.
6. 한 10 ㎖ 37 ° C 미리 예열 PBS와 합류 또는 하위 합류 세포 배양 플라스크에서 세척 HeLa 세포.
7. 1 ㎖ 37 °를 추가하여 HeLa 세포를 분리 C는 세포 배양 플라스크에 트립신을 데워진 37 ℃에서 3 ~ 5 분 동안 품어
8. 10 ㎖ 37 ° C에서 다시 정지 세포는 16 % FBS와 보충 DMEM을 데워진.
9. 세포를 계산하고 준비 DMEM의 ML 당 12,000 세포의 세포 현탁액은 보충16 % FBS.
10. 384 - 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 50 μl를 추가합니다.
11. 세포를 배포하고 세포는 실온에서 10 분 동안 정착하게 앞뒤로 빠르게 판을 이동합니다.
12. 파라 필름과 플레이트를 밀봉하고 37 ℃에서 가습 5 % CO ₂ 함유 분위기에서 72 시간 동안 보관

3. 세포 감염 및 염색

1. 감염 전날, L.의 단일 식민지을 BHI 한천 플레이트에서의 monocytogenes 및 15 ml의 폴리스티렌 튜브에서 액체 BHI 배지 5 ㎖에 재현 탁.
2. 박테리아의 성장을 허용 동거 장치에서 37 ° C에서 밤새 품어.
3. 감염의 날, 하룻밤 L. 1 ㎖를 씻어 테이블 탑 원심 분리기에서 10,600 RCF에서 2 분 원심 분리하여 문화 모노 사이토 겐.
4. (분비 세포 독소의리스 테리 O를 포함) 상층 액을 버리고 PBS 1 ㎖ (반복 하오의 펠렛을 다시 일시 중지) 세척 단계 3 더 많은 시간을 t.
5. 600 nm에서 세균의 광학 밀도를 읽고 박테리아의 수를 (OD = 1 1E9 박테리아 / ㎖에 해당)으로 추정된다.
6. 적절한 L.에게 준비 1 % FBS와 보충 DMEM에 희석 모노 사이토 겐 : EGDe.PrfA *와 같은 고도의 침략 균주를 사용하여, 우리는 잘 당 매체의 30 μL에 5E4 박테리아의 사용을 (감염의 다중성이 2,000 셀 (25)로 추정된다)하는 것이 좋습니다.
7. 각 웰의 세포 배양 배지 (80 μL)를 제거하고 L.의 30 μl를 추가하여 교체 매체 모노 사이토 함유.
8. 감염 프로세스를 동기화하기 위해, 실온에서 5 분 동안 200 RCF로 플레이트를 원심 분리기.
9. 데워진 알루미늄 블록에 37 ° C에서 가습 5 % CO ₂ 함유 분위기에서 1 시간 동안 접시를 품어.
10. L.에게 제거 각 웰로부터 배지를 모노 사이토 겐을 함유하고 10 % FBS 보충 된 DMEM 데워진의 30 μL를 추가40 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 세포 L.를 죽일 모노 사이토 제네스.
11. 데워진 금속 블록에 37 ° C에서 5 % CO ₂ 함유 분위기에서 4 시간 동안 배양한다.
12. 8 %의 포름 알데히드 (오히려 파라 포름 알데히드 폴리머보다 포름 알데히드 단량체가 사용되도록이 솔루션은 신선한 준비를해야합니다)와 보충 PBS의 솔루션을 준비합니다.
13. 세포 배양 배지를 폐기하지 않고, 8 % 포름 알데히드 (최종 농도 4 %)으로 보충 된 PBS 30 μL를 추가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다.
14. 정착액을 제거하고 (물론 당 PBS 80 μL의 최종 볼륨에있는 세포를 유지) 잘 당 PBS 80 μL와 세포를 세 번 씻는다.
15. 준비 1:250는 PBS의 토끼 안티 InlC 혈청의 희석은 0.2 % 사포닌.
16. 잘 PBS를 제거한 후 각각 차 항체 용액 10 ㎕를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
17. 차를 폐기항체 용액과 잘 당 PBS 40 μL로 4 회 세척한다.
18. PBS에서 보조 알렉사 형석 546 커플 안티 - 토끼 항체 (1:250), DAPI 용액 (1:1,500) 및 phalloidin도 - Dy647 (1:150)을 희석하여 0.2 %의 사포닌.
19. 각 웰에이 보조 염색 용액 10 μL를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
20. 차 얼룩 솔루션을 취소하고 (물론 각 40 μL의 최종 볼륨을두고 판을 밀봉) 잘 당 PBS 40 μL로 4 회 세척한다.
21. 플레이트는 바로 몇 군데 있습니다 또는 후속 분석을 위해 빛으로부터 보호 4 ° C (알루미늄 호일로 커버)에 저장할 수 있습니다.

4. 이미지 수집 및 분석

1. 자동화 된 현미경에 장착 된 10 배 목표를 (물론 당 우선적으로 9 이미지를 얻기)를 사용하여 세 개의 서로 다른 채널 (350 nm의, 546 ㎚, 647 nm의) 이미지를 획득.
2. InlC 신호는 화상을 이용하여 측정 할 수있다각각 DAPI와 phalloidin도 염색을 이용하여 핵 및 세포 기관의 자동 분할 할 수 CellProfiler 같은 분석 소프트웨어.

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결과

세포질 InlC의 형광 표지는 L.에 의해 세포 감염에 대한 강력한 판독을 제공합니다 모노 사이토는,도 1에 도시 된 바와 같이 : 현미경의 중앙 셀은 높게 P14.PrfA는 * ²³ 균주에 의한 감염에는 위상 콘트라스트 화상 (화살촉,도 1a)에서 관찰 될 수 있으며, 이러한 DAPI 신호에 의해 확인 된 것처럼 여기서 개별 박테리아 깨끗이 (도 1b)를 구?...

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토론

몇개의 파라미터는 InlC 신호의 명확한 검출을 허용하기 위해 충분히 큰 세포질 표시 건강한 세포주의 사용을 포함하는 트립 InlC 검출 프로토콜의 성공에 중요하다. 분석에서 우리는 우리가 인해 세포질 공간의 확장에 대한 우리의 분석에 특히 적합하다 헬라 CCL2 세포의 사용을 제안하고이 문서에서 제시 등의 헬라 교토 세포와 같은 다른 헬라 클론 작은 세포질을 표시하지만, 사용할 수 있습니다 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Brain Heart Infusion	BD	237500	For liquid BHI preparation
Bacto Agar	BD	214010	Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	Biowest	51830-500
DMEM	Invitrogen	61965-026
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778-100
Gentamicin	Sigma	G1397-10ML
Formaldehyde (16%)	EMS	15710	Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546	Invitrogen	A-11035
DAPI	Invitrogen	D-1306
Phalloidin Dy647	Dyomics	647-33
siRNA Scramble	Dharmacon	D-001810-10
siRNA Met	Dharmacon	L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate	Corning	3985
AxioObserver Z1 microscope	Zeiss	431007 9901
sCMOS camera	Andor	Neo
Metamorph analysis software	Molecular Devices	4000
CellProfiler analysis software	Broad Institute	Public software available at http://www.cellprofiler.org/