복셀에서 지식 : 복잡한 전자 현미경 3D-데이터의 분할에 대한 실용 가이드

요약

셀룰러 차원 전자 현미경을위한 병목 고도로 복잡한 3D 밀도 맵에서 피쳐 추출 (분할)된다. 우리는 따라서 효율적인 세그멘테이션 대한 시작점을 제공하고, 분할 방식 (수동, 반자동 또는 자동으로)가 상이한 데이터 유형에 가장 적합 관한 지침을 제공하는 기준의 세트를 개발했다.

초록

현대 3 차원 전자 현미경 방식은 최근 이러한 접착 착체뿐만 아니라 고차 구조 등의 골격 등 및 셀룰러 소기관 큰 거대 분자 기계의 시각화를 가능하게, 세포 및 조직의 3 차원 미세 조직으로 전례 통찰력을 허용 할 그들의 각각의 세포 및 조직 콘텍스트. 셀룰러 볼륨의 복잡한 특성을 감안할 때, 먼저 자신의 3 차원 조직의 시각화, 정량화, 따라서 이해를 허용하기 위해 관심있는 특징을 추출하는 데 필수적이다. 각 데이터 세트는 데이터의 고유 특성, 예를 들면, 신호대 잡음비, 선명도 (선명도)에 의해 정의되고, 그것의 기능, 특징, 존재 또는 쉽게 식별 가능 특징 형상의 부재의 혼잡 및 백분율의 이질성 관심의 특정 영역이 차지하는 전체 부피. 이러한 모든 특성은 고려 될 필요결정할 때 분할에 대해 수행하는 접근한다.

세 가지 다른 영상으로 얻을 수 있었다 제시된 여섯 가지 차원 미세 데이터 세트 접근 : 수지 포함 된 스테인드 전자 단층 촬영, 이온 빔 - 직렬 블록 페이스 주사 전자 현미경 (FIB-SEM, SBF-SEM)을 집중 약간 스테인드 무겁게 스테인드 샘플 각각. 이러한 데이터 세트의 경우, 네 개의 다른 분할 방법이 적용되었다 : (1) 완전 수동 모형 구축 (3) 반자동 접근법 따라 표면 렌더링 뒤에 데이터 (2) 수동 추적 세그먼트, 모델의 시각화에 의해서만 이어 표면 렌더링, 또는 표면 렌더링 및 정량 분석​​ 하였다 (4) 자동 맞춤 설계 분할 알고리즘에 의해. 데이터 세트의 특성의 조합에 따라서는 이러한 네 범주 접근법은 일반적으로 하나의 성능을 능가 다른 것을 발견했지만, 기준 정확한 순서에 따라 MO다시 이상의 접근은 성공적 일 수있다. 이들 데이터에 기초하여, 우리는 서로 다른 데이터 세트의 분석을위한 객관적 데이터 세트 특성 및 개인 주관적인 기준을 모두 분류 선별 기법을 제안한다.

서문

전통적으로, 전자 현미경은 (EM) 필드는 1) 높은 초 고해상도 TEM을 사용하여 구조 생물학 분기로 분할되어, 일반적으로 내재적 또는 명시 적 데이터와 고분자 복합체의 3 차원 (3D) 구조를 조사하기 위해 평균화와 결합 정의 된 구성과 일반적으로 상대적으로 작은 크기 ^1-4, 및 전체 휴대 풍경이 ^1,5,6를 가시화되는 2) 세포 이미징 지점. 구조 생물학의 지점은 지난 40 년간 극적으로 발전을 겪은 반면, 세포 생물학의 지점은 대부분 종종 덜보다 최적으로 보존 샘플에 두 가지 차원으로 제한했다. 단지 지난 10 년간 전자 단층의 도래와 함께 일반적으로 셀룰러 경관, 따라서 관심의 기능으로서 수행 될 수 평균 제 ^5,7 차원으로 확장 된 미세 세포 생물학적 이미징을 가지며, 일반적으로 고유하다.

시각화 셀룰러 장면 눈에 종종 충격적 있지만 정확한 단백질 조성물은 일반적으로 알 수 없기 때문에, 관심과 같은 고도로 복잡한 셀룰러 볼륨 후속 정량 분석​​의 기능을 효율적으로 추출 따라서 이들 세포를 해석하기가 어려운하게 부분적 뒤쳐 3D 볼륨. 이 현재까지 광범위한 생물학적 지식은 종종 복잡한 단층 촬영을 해석, 또는 심지어 3D 볼륨에서 중요한 영역과 필수적 구성 요소를 식별하기 위해 필요하다. 또 다른 합병증으로, 3D 볼륨 시각화는 매우 사소하다. 3D 볼륨은 생각 때문에 2D 이미지의 스택으로 시각화 할 수 있습니다. 순차 차원 영상의 각 슬라이스 검사는 복잡성을 감소 시키지만, 이는 또한 제한이 치수로 추출하고, 따라서 정량 분석​​이 있습니다. 그러나, 대부분의 3 차원 오브젝트에 대한 3 차원 볼륨의 묘사는 단순히 연속 평면의 스택은 불완전한 리드특정 시스템의 3D 자연에 D 왜곡 된 관점입니다. 육안 검사의 대체 모드 셀룰러의 자주 밀도 자연 주어진 두 볼륨 렌더링 또는 표면 렌더링을 필요로 볼륨을 - 수 따라서 대화 형 수동 분할이 어려워 쉽게 중첩 된 객체의 방해보기로 이어질 또는 모두 사용자를 압도.

이러한 장벽, 자동화 된 특징 추출의 큰 다양성을 해결하기 위해 (분할) 방식은 일반적으로 density- 또는 그라데이션 기반 ^8-10 중 아르 개발되었다. 최근의 방법은 관심의 특정 기능을 대상으로 할 수 있지만, 그러나, 이러한 방법은 액틴 필라멘트 ^(11)로,에 관계없이 지역이나 기능은 전문가에 관심있는의 세그먼트에 전체 볼륨을 경향이있다. 또한, 자동 분할을 실행하는 프로그램은 때때로 예 유역 immersio 적용시 (서브 - 볼륨이 다수 생산 될 수있다종종 관심의 전체 기능을 포함하거나 추가적인 세그멘테이션을하여야 수동으로 다시 병합 될 필요 N 분할). 이 때문에 대부분의 렌더링 컴퓨터 알고리즘은 종종 원하는 분할 볼륨을 생성하는 데 필요한 전문가에 의해에만 충실하여 원하는 기능 및 실질적인 큐 레이션 노력을 추출 할 수없는, 특히 복잡하고 혼잡 한 데이터 세트도 마찬가지입니다.

또한, 매우 구체적인 문제에 대한 맞춤형 솔루션은 종종이 넓은 만들기에 더 중점이 거의 과학적인 회의 종이로 출판 수학, 컴퓨터 과학 및 / 또는 분야의 친밀한 지식이없는 연구자들에게 포괄적 인 도구에 액세스 할 수 있습니다 컴퓨터 그래픽입니다. 이미지 분석 라이브러리의 범위를 포함하는 맞춤형 프로그래밍 소프트웨어 환경, 사용자가 효율적으로 정확한 분할을 위해 자신의 모듈을 작성할 수 있도록 강력한 도구 설정 될 수있다. 그러나,이 접근법은 내선 필요ensive 교육 및 다양한 기능 또는 이미지 분석 기능을 활용하기 위해 컴퓨터 과학에 대한 배경. 하나는 자신의 주변 ^12,13에서 관심 물체를 분리하는 "템플릿"의 독특한 기하학에 의존 강력한 형상 기반 접근법을 이용하여, 예를 들어 기능이 더 드물다 특정 데이터 세트에 대해 그러한 다목적 소프트웨어 환경 내에서 작동 할 .

컴퓨터 그래픽 시각화 패키지 공정 다양한 대화 형 수동 분할 및 모델 구축을 위해 존재한다. 캘리포니아 샌프란시스코 대학 키메라 ^(14), 콜로라도 IMOD ^(15)의 대학과 텍사스 대학 오스틴 VolumeRover ¹⁶ : 다른 사람이 학문적 기원 아르와 같은 무료로 배포하면서 일부 패키지는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 프로그램이 보유 특성과 기능의 넓은 범위 및 복잡성은 EA에 대한 학습을​​ 가파르게채널. 특정 시각화 프로그램에는 공 및 복잡한 3D 용적의 단순화 된 모델을 생성하기 위해 밀도 맵에 배치 될 수있는 다양한 크기의 막대기 같은 단순한 기하학적 모델을 제공한다. 이 모델은 간단한 기하학적 및 체적 측정이 때문에 그냥 "예쁜 그림"을 넘어 수 있습니다. 개체의 그러한 설명서 추적 물체의 작은 번호를 추적 및 추출 할 필요가 볼륨에 대해 잘 작동한다. 그러나, 사용하는 대용량 차원 미세 화상의 최근 발전은 어느 집속 이온빔 스캐닝 전자 현미경 (FIB-SEM)을 ^17-20 또는 직렬 블록면을 주 사형 전자 현미경 (SBF-SEM)은 ^21은 3 차원 데이터의 크기가 추가적인 합병증을 제시 세트는 수십 기가 바이트와 기가 바이트의 수백, 심지어 테라 바이트에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 따라서, 그러한 큰 3D 볼륨 서, 피쳐 추출 사실상 액세스 할 수없는, 따라서 효율적인 사용자 유도 반자동 묘기우레 추출은 가까운 미래에 3D 볼륨의 효율적인 분석을위한 병목 현상 중 하나가 될 것입니다.

일상적으로 생물 이미지 형식의 넓은 범위에서 사용되는 네 가지 분할 방식이 여기에 표시됩니다. 이러한 방법은 다음 생물 학자들이 자신의 데이터의 효과적인 특징 추출을위한 최적의 분할 접근 될 것인가를 결정하는 데 도움을 참조로 컴파일 있도록 데이터 세트의 서로 다른 유형의 효과에 대해 비교된다. 자세한 사용자 매뉴얼에 설명 된 대부분의 프로그램에 사용할 수있는 바와 같이, 목표는이 특별한 패키지의 한 잠재적 인 사용자가 익숙하게하지 않는 것입니다. 대신, 목표는 다양한 특성을 가진 여섯 예시적인 데이터 세트에 적용함으로써 이러한 상이한 분할 전략의 각각의 장점과 한계를 보여주는 것이다. 이러한 비교를 통해, 일련의 기준은 하나의 대물 화상의 특성을 기반으로 개발되었다예컨대 분할에 대해 원하는 목표 주관적인 고려로부터 데이터 콘트라스트, 선명도, 혼잡, 복잡성, 또는 줄기와 같은 3 차원 데이터 세트는 기능의 모폴로지는의 분율을 의미 관심 특징 인구 밀도, 분단 할 관심의 기능을, 어떻게 일이 진행 최적의 같은 시간과 직원의 가용성 유한 한 자원에 의해 점유 된 볼륨을 설정합니다. 이러한 다양한 예시적인 데이터 집합이 객관적 및 주관적인 기준 데이터 세트를 특정 유형의 특정 피쳐 추출 방법의 페어링을 수득 다양한 조합을 순차적으로 적용 할 수있는 방법을 예시한다. 희망 초보자 도움이 될 것입니다있는 추천은 분할 옵션의 큰 다양성에 직면 자신의 3D 볼륨을위한 가장 효과적인 분할 방법을 선택합니다.

본 연구의 초점은 데이터 수집 및 사전 처리 데이터에 피쳐 추출 주목이지만 효율적인들에 중요egmentation. 종종 시료의 염색 불균일 할 수 있고, 따라서 잠재적 염색 아티팩트 분할 절차에서 고려되어야한다. 그러나, 얼룩은 대개 더 높은 신호 - 대 - 잡음을 제공하고, 따라서 더 적은 필터링 및 잠재적으로 아티팩트가 발생할 수 셀룰러 볼륨의 다른 수학적 처리를 필요로한다. 각각의 원시 화상 데이터 세트는 3 차원 체적으로, 정확한 콘트라스트 및 카메라 화소 설정 취득한 정렬 및 재구성 될 필요가있다. 단층 촬영의 경우, 정렬 된 이미지는 가중 역 투영을 사용하여 통상적으로 재구성되고, 그 데이터 세트는 일반적으로 비선형 이방성 확산 ^(22), 양자 필터링 ⁽²³⁾ 또는 ^(24)를 필터링 재귀 중앙값으로서 잡음 제거 알고리즘을 받는다. FIB-SEM 및 SBF-SEM 영상 데이터는 같은 ImageJ에 ²⁵ XY 활용 프로그램 간 상관 관계를 연속 조각으로 정렬됩니다. 콘트라스트 개선 및 필터링의 기능을 강화하기 위해 적용될 수있다관심 따라서는 화상 스택 잡음보기 해제한다. 필터링 방법은 계산 비용이 많이들 수 있습니다으로 필터링, 선택하거나 선택한 서브 볼륨에 서브 볼륨을하기 전에 전체 볼륨 중 하나를 수행 할 수 있습니다. 데이터가 크게 기대 해상도에 비해 오버 샘플링 된 경우 다운 샘플 때로는 소음 감소 및 / 또는 파일 크기 감소를 위해 사용되는 데이터 (비닝)의 단지 추천합니다.

노이즈 감소 후에, 처리 된 화상은 그 다음 다양한 방법으로 분할 될 수 있으며,이 연구의 초점은 다음의 네 가지에 : 공 - 및 - 스틱 모델을 만드는 과정 (1) 수동 추상화 모델 생성 (2) 수동 추적 프로젝트 특정 세그먼트에 대한 스크립트를 통해 관심, (3) 자동화 된 임계 값 기반 밀도, (4) 커스텀 메이드 자동 분할의 기능. 경계 분할 ^팔과 몰입 유역 분할 ^열은 단순 임계 값에 더 나은 대안이 있지만, t는이봐 같은 범주에 속하고,이 토론에 명시 적으로 포함되지 않았다.

밀도 수동 추적 슬라이스 슬라이스하여 각 서브 셀 영역의 원래 농도의 유지를 허용, 관심의 기능을 개략적으로 필요로한다. 이 방법은 세그멘테이션 프로세스의 최대 제어 할 수 있지만 번거롭고 노동 집약적 인 공정이다.

알고리즘은 사용자 정의 된 파라미터들의 세트에 기초하여 픽셀을 선택하는 곳에 자동 임계 값 기반 (그리고 관련) 밀도 세그멘테이션 방법은 반자동이다. 이러한 UCSF 키메라, IMOD, 피지 ²⁶ 및 VolumeRover 여러 대학 (프리) 시각화 패키지는, 패키지 (유료 라이선스를 필요로) 사용할뿐만 아니라, 상업용, 및 두 가지 유형은 일반적으로 이러한 세그멘테이션 방법 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 여러 가지 방법을 설명하기 위해이 작업에 사용되는 소프트웨어 패키지는 상용 프로그램과 교육 개방의 포함수동 추상적 모델뿐만 아니라, 수동 및 자동 밀도 분할을 생성하기위한 프로그램 ource. 그러나, 오픈 소스 소프트웨어는 종종 사용자 정의의 가능성을 통해 고급 옵션을 제공 할 수 있습니다.

데이터 세트의 다른 종류를 사용하여 이러한 기술의 비교는 우리의 지식에 아직 게시되지 않은 다양한 생물학적 데이터 3D 볼륨의 분할에 접근하는 방법에 대한 다음과 같은 규칙의 발표 및 안내되었다. 따라서,이 제 체계적 다른 접근법을 비교하고 서로 다른 목표와 사용자의 특성을 가진 다양한 데이터 세트에 유용성이있다.

프로토콜

1 수동 추상화 된 모델 생성

주 : 방법의 상세에 대하여 설명 키메라 특정하지만, 다른 소프트웨어 패키지 대신에 사용될 수있다. 유일한 목적은 오히려 물체의 체적 형상을 표시하는 것보다, 형상 측정을하기 위해 기하학적 모델 (예를 들어, 공 및 스틱 모델)을 생성 할 때이 방법을 사용한다.

1. 수동 추상화 모델 생성을위한 프로그램에 적합한 데이터 볼륨을 가져.
   1. 파일> 열기를 선택지도 파일 열기 대화 상자를 당겨. 원하는 맵의 파일 위치로 이동합니다.
   2. 다른 렌더링 스타일 데이터를 표시 할 수있는 볼륨 뷰어 (도구> 볼륨 데이터> 볼륨 뷰어) 선택 기능> 표시 스타일을 당깁니다.
   3. 볼륨 뷰어에서 히스토그램에 수직 막대를 드래그하여 디스플레이에 대한 임계 값을 조정창.
2. 3D 볼륨을 통해 이동 (예를 들어, 슬라이스 의한 슬라이스) 세그멘테이션에 대한 관심 영역을 선택하고, 필요한 경우 더 작은 서브 - 볼륨을 자르한다.
   1. 볼륨 뷰어 대화 상자에서 축을 클릭 한 다음 X, Y, 또는 Z를 선택합니다.
   2. 볼륨 뷰어 대화 상자에서> 비행기를 기능을 선택합니다. 왼쪽 상자의 번호에 해당하는 평면을 표시 깊이를 설정 하나를 클릭 한 모든 평면을 표시하려면 모두를 클릭합니다.
   3. 볼륨 뷰어 대화 상자에서 선택 기능> 아구를 선택합니다.
      1. 클릭하여 관심 영역 주위에 사각형 상자를 만들 끕니다.
3. 관심의 기능을 따라 마커를 놓고 모델이 완료 될 때까지 (종종 프로그램에 의해 자동으로 수행) 적절한 링커로 연결합니다.
   1. 볼륨 뷰어 메뉴 바에서 Tools (도구)>볼륨 추적기 대화 상자가 볼륨 추적기 대화 상자를 엽니 다. 볼륨 추적기 대화 상자에서> 새 마커 세트 파일을 선택합니다.
   2. 볼륨 추적기 대화 상자에서 데이터 평면에 마우스> 높은 품질에 장소 표시, 장소 마커를 확인으로 이동하고 마커의 크기를 조정, 링크 새로운 마커를 선택 마커 및 링크는 연속적으로 표시를 선택했습니다.
   3. 마커 색상 견본을 클릭하고 색상을 선택합니다. 링크 색상에 대해이 단계를 반복합니다.
   4. 마커 및 링크 모델 건물 요소에 대한 반경을 입력합니다.
   5. 볼륨 추적기 창에서 [오른쪽] 마우스 버튼을 사용하여 장소 마커를 선택하고 마커와 링크 반경을 삽입합니다.
   6. 오른쪽 마커를 내려 놓고 시작 볼륨 데이터를 클릭합니다. 마커가 자동으로 연결됩니다.
   7. 볼륨 추적기 대화 상자에서 파일> 현재 마커 세트를 저장 한 다음> 닫기 마커 세트를 파일.
4. 관심의 초 원하는 기능으로 모델을 구축하기 위해 새로운 마커 세트 (단계 1.3.1)를 엽니 다. 기능의 차이를 강조하기 위해 마커 세트 사이의 색상 대비를 이용한다.

관심의 특징 2 수동 추적

주 : 방법의 상세에 대하여 설명 아미라 특정하지만, 다른 소프트웨어 패키지 대신에 사용될 수있다. 인구 밀도가 상대적으로 작고, 피쳐 추출의 정확성이 가장 중요 할 때, 수동으로 추적 시간이 소요되는 방식 인 경우이 방법을 사용한다.

1. 수동 추적 옵션이있는 프로그램으로 가져 오기 볼륨 데이터. 이 기능을 가진 소프트웨어는 일반적으로 적어도 기본 페인트 브러시 도구를 제공합니다.
   1. 큰 볼륨이나 단층 촬영의 경우 (예를 들어, 16 비트 2048 X 2048 이상 .rec 또는 IMOD에 .mrc 생성 된 단층 촬영) : 열기를 선택 데이터> filename.rec>에서 마우스 오른쪽을 클릭 ...> LargeDiskData로 원료를 선택 > 옥>로드. 옥> 헤더 정보의 적절한 원시 데이터 매개 변수를 선택합니다. 새로운으로 전환하고 저장 filename.am의 다음 단계에 사용하기위한 파일입니다.
   2. 작은 3D 이미지 스택 파일의 경우 (예를 들어, 차원이 .tif 또는 .mrc 또는 .rec) : 오픈 데이터>를 선택 filename.tif 또는 filename.mrc. 전환하고 이름으로 저장을 마우스 오른쪽 클릭> filename.am . 오류가 발생하거나 프로그램이 응답하지 않는 경우, 파일이 너무 클 수 있고, 단계 2.1.1에 따라 개방 될 수있다.
2. 분할을위한 3D 서브 볼륨을 선택 조각을 통해 이동 한 다음 관심이 지역에 자릅니다.
   1. 3D 뷰어 창에서 이미지 파일을 열 수 Orthoslice을 선택합니다. 조각을 탐색 할 수 하단에 슬라이더를 사용합니다.
   2. > 풀 창에서 파일 이름 토글, LargeDiskData으로 열립니다 큰 데이터를 자르려면 마우스 오른쪽> LatticeAccess을 클릭합니다. 강한 게 아니R은 원하는 상자 크기> 적용합니다. 새 파일을 저장합니다.
3. 분할 파일을 만듭니다.
   1. 우측> 라벨> 레이블 필드를 클릭> 풀 창에서 파일을 움직입니다. 새 파일이 생성되고 자동 분할 편집기 탭에로드됩니다.
4. 관심 장편의 테두리를 추적 한 다음 손으로 사용되는 소프트웨어 또는 특정 명령을 사용하여 트레이스를 채운다. 모든 조각을 통해 관심의 기능에 따라 수동 추적 세그먼트를 반복합니다. 아미라를 사용하여 다음 명령을 사용하여
   1. 그림판 도구를 사용하기 위해, 필요에 따라, 다음 관심 피처의 경계를 추적하기 위해 마우스 포인터를 사용하여 브러시 크기를 변경.
   2. 바로 가기 "F"로 추적 영역을 채 웁니다. 더하기 기호 또는 바로 가기 ""로 버튼을 클릭하여 선택을 추가합니다. 필요한 경우, "U"는 취소하고, 빼기 또는 삭제하는 "S".
5. 시각화 및 기본 질적 또는 소프트웨어 사용자 설명서 명령어 당 정량 분석​​을위한 표면 렌더링을 생성합니다.
   1. 개체 풀 탭에서 마우스 오른쪽> SurfaceGen 클릭> 풀 창에서 파일 이름 - labels.am 움직입니다.
   2. 적용> 원하는 표면 특성을 선택합니다. 새 파일 filename.surf은 풀에 작성됩니다.
   3. > 마우스 오른쪽 클릭> 풀 창에서 filename.surf 토글, 서피스 뷰 SurfaceView를 분할 볼륨을 시각화합니다.
   4. , 이동, 회전, 3D 볼륨을 확대하기 위해 3DViewer 창에서 도구를 사용합니다.
6. 정확한 밀도를 추출하고 볼륨 또는 표면 영역으로 측정 값을 결정합니다. 고급 디스플레이, 분석 및 시뮬레이션을위한 다른 프로그램으로 내보내기.
   1. 3DViewer 창에서 적절한 옵션 (2D 길이와 2D 각도 측정을위한 하나의 2D 평면에 3 차원의 길이와 3D 각도를 선택> 측정 도구를 클릭합니다3D 볼륨에서 측정).
   2. 원하는 길이, 거리 및 각도를 측정하는 메쉬면을 클릭합니다. 값은 속성 창에 표시됩니다.

3 자동 밀도 기반의 분할

주 : 방법의 상세에 대하여 설명 아미라 특정하지만, 다른 소프트웨어 패키지 대신에 사용될 수있다.

1. 관심의 밀도를 철회 대비, 선명도, 또는 혼잡의 다양한 데이터 세트에이 방법을 사용합니다.
2. 자동 분할을위한 임계 마술 지팡이 나 다른 밀도 기반 툴 장착 프로그램에 오기 볼륨 데이터. 수동 추적을위한 방향으로 2.1-2.1.2에 설명 된 단계를 수행합니다.
3. 조각을 탐색 및 분할에 대한 영역을 선택합니다. 필요한 경우, 분할에 대한 작은 3D 서브 볼륨을 자릅니다. 수동 추적을위한 방향으로 2.2-2.2.2에 설명 된 단계를 수행합니다.
4. 의 농도를 선택관심의 기능, 일반적으로 클릭하거나 기능을 마크 또는 앵커 지점을 배치하여. 소프트웨어에서 허용하는 경우, 기능의 픽셀 강도를 포괄 번호 범위를 입력하고 원하는대로이 허용 오차를 조정합니다. 기능에 속하는 밀도는 앵커의 픽셀 또는 허용 오차 값의 강도에 따라 뽑힐 것입니다. 아미라를 사용하는 경우 다음 명령을 사용합니다.
   1. 구별 여백 기능에 대한 자동 선택 도구를 사용합니다.
      1. 관심 영역에 클릭 한 다음 기능이 완전히 강조되도록 값의 올바른 범위를 캡처하는 디스플레이 및 마스킹에서 슬라이더를 조정합니다. 바로 가기 ""로 선택을 추가합니다.
   2. 명확하게 구별 할 여백이없이 기능에 대한 임계 값 도구를 사용합니다.
   3. 임계 값 아이콘을 선택합니다. 관심의 기능 만이 마스크 될 수 있도록 바람직한 범위 내에서 농도를 조정하는 슬라이더를 조정합니다. 선택 버튼을 클릭 한 후 바로 가기로 선택 추가220; ".
   4. 세그먼트 전체 볼륨, 선택을 추가하기 전에 모든 조각을 선택합니다.
   5. 제도 및 / 또는 분할> 부드러운 라벨> 소음, 선택 분할을 삭제합니다.
5. 수동 추적 섹션 2.6-2.6.2에 설명 된대로 시각화 및 질적 분석을 위해 표면을 생성합니다. 원하는 경우, 적절한 3D 디스플레이, 정량 분석​​ 및 시뮬레이션을위한 다른 프로그램에 내보낼 수 있습니다.

4 사용자 정의 맞게 자동 분할

참고 : 큰 볼륨에서 정확한 밀도 모델을 생성 할 수있는 기능을 컴퓨터 과학의 배경 경험을 필요로하지만, 수 있습니다 자동 분할에 대한 사용자 정의 스크립트를 만들려면이 방법을 사용합니다.

1. 도구 (MATLAB ^(27)의 모양이 주관 분할의 구체적인 예)
   1. 이미지 전처리 : 수행 노이즈 제거, 배경 제거 및 이미지 향상다음 파이프 라인을 사용하여 :
      1. imread 명령을 사용하여 이미지를로드합니다.
         1. 명령 줄에서 다음을 입력합니다 >> 메신저 = imread $의의 image_path 분석 할 수있는 이미지의 위치의 ($의 image_path).
      2. 이미지 처리 도구 상자에서 추정 또는 알려진 잡음 전력에 대한 신호 비율 (NSR)를 사용하여 위너 필터를 호출합니다.
      3. 이전에 처리 된 이미지를, 그 후, 배경 레이어를 추정 imopen 화상 개구 함수를 호출 다른 마스크로 결과를 할당.
         1. 명령 줄에서 다음을 입력합니다. >> 배경 = imopen (메신저, strel의 ($ shape_string, $ 크기)),이 방법에서, $의 shape_string 크기가 분석기로 주어진 변수 $ '디스크'와 같다 즉 >> 배경 = imopen (메신저, strel ( '디스크', 15)).
      4. 배경으로 필터링 된 이미지를 뺍니다.
         1. >> IM2 = 메신저 - :를 명령 줄에서 다음을 입력배경
      5. 결과의 품질에 따라, 또는 이미지 처리 도구 상자에서 기능 imadjust를 사용하여 호출 할 수있는 적응 오츠의 방법 ^(28)없이 이미지 정규화를 수행합니다.
         1. 명령 줄에서 다음을 입력합니다 >> IM3 = imadjust (IM2)
      6. 정규화 된 이미지를 자르기로 관심의 영역을 제한, 분할에 대한 관심의 기능을 준비합니다.
         1. imtool 명령을 사용하면, 자른 될 관심 영역을 탐구하고 명령에 좌표를 제공 벡터 [1 개 Y1 2 배 Y2가]에 해당 >> im3_crop = imcrop (IM3, [1 개 Y1 2 배 Y2), 사각형 영역이 잘릴 수 있습니다.
   2. (관심 특징 걸쳐 2D 영상에 선형 흔적) 각 개체의 다른 카테고리에 대해 구체적인 예를 제공하여 알고리즘을 가르치 인식 / 감독 형상 분류 형상.
      1. VLFEAT ²⁹ API가 성공적으로 설치되어 있는지 확인하고보다 깊이있는 문서에 대한 VLFEAT의 웹 사이트를 방문하십시오.
      2. 명령 줄에서 다음을 입력 >> [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, $ K $ NLEAVES) $ K가 사용하는 클러스터의 수 또는 관찰자에 데이터를 정렬하고 싶은 클래스의 수입니다, 달러 NLEAVES 잎 클러스터의 원하는 번호가 즉입니다 >> [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4100)
      3. VLFeat의 입력으로 수동으로 분할 기능을 사용합니다.
         참고 :이 오픈 소스 C 기반 라이브러리가 데이터 집합에 대해 가장 잘 작동하도록 선택 방법의 종류에 따라 픽셀 패치, 패치 클러스터링 및 클러스터 중심 위치를 수행합니다. 가능한 옵션은 기반 texton하는 K-평균 클러스터링에서부터 ^{30에 접근하고,} 출력 특성이 주어진 모범 설명에 기초하여 원하는 수치 배열이다.
2. 분할이 쿵푸를 사용하여에서야 있지만 계산 비용, 자동화, 더 시각화 및 분석을위한 별도의지도로 기록 될 것입니다 동시에 객체의 세그먼트 여러 클래스에 접근.
   1. 이전에 생성 된 숫자 배열 (모델)을로드합니다.
   2. 입력으로 분할 될 모델과 이미지를 사용하여, VLFeat에서지지 벡터 머신 (SVM) 함수를 호출한다.
      1. 명령 줄에서 다음을 입력합니다 >> x는 원래 이미지 im2_crop 자른 y는 목표 이미지를 수동으로 분할 된 이미지입니다 = vl_svmtrain (X, Y, 0.1), [B, w]. 클러스터링에 의해 생성 된 레이블에 따라 결과 색상을 >> ISEG = VL_IMSEG (I, 라벨)를 사용합니다.
         주 : 모델의 특성들에 기초하여, VLFeat 클래스의 수에 처음부터 할당 (관심 기능) 화상을 분류한다. 원하는 정확도의 수준에 따라, 또는 다른 방법으로 추정 clust 방법이 조합 될 수있다등의 선체 및 클러스터 센터와 같은 어 매개 변수를 설정합니다. SVM 알고리즘의 출력은 확률 모델과 새로운 데이터 세트에 필요한 여러 종류의 이진 마스크​​이다.
   3. >> $ 형식은 '티파니'는 imwrite (메신저, $ 형식, $ 파일 이름)와 $ 파일 이름은 출력 파일의 경로입니다 : 명령을 입력하여 결과를 저장합니다.
   4. >> imshow (IM) : 이미지를 시각화를 들어, 명령을 입력합니다.

결과

그림 1은 전자 단층 촬영, FIB-SEM 및 SBF-SEM을 포함하여 3 차원 전자 현미경 세포 이미징을위한 일반적인 워크 플로를 보여줍니다. 워크 플로우는 선택한 분할 소프트웨어의 효율성을 최대화하기 위해 관심 영역 자르기, 원시 데이터 수집, 3D 볼륨에 데이터를 정렬하고 재구성, 필터링을 통해 노이즈 감소, 및 필요한 경우를 포함한다. 이러한 전처리 된 데이터는 특징 추출 / 분할을위한 다음 준비가되어 있습니다.

그림 2는 다른 두 FIB에 따른와 전자 단층 촬영 (그림 2A, 2B)에 의해 기록 된 수지 샘플이 내장 된 아르이있는 (아래에 더 소개합니다) 네 개의 다른 데이터 세트와 함께 그림 1에서 규정 된 워크 플로우를 보여줍니다 각각 -SEM 및 SBF-SEM, (그림 2C, 2D). 그림 2 열 1에서 이미지 투사 있습니다정렬 및 재건에 3D 볼륨으로 조립보기 각각 (그림 2A1, 2B1) 및 블록 표면 이미지 (그림 2C1, 2D1). 열이 필터링 (3 열)에 소음에 상당한 감소를 보여, 따라서 종종 더 선명 표시 등 3D 볼륨을 통해 조각을 보여줍니다. (칼럼 4)을 선택하고 관심 영역에 큰 볼륨을 3D 자르기 후이자 (컬럼 5)의 분할 기능 3D 렌더링은 정량적 분석 수득 또한 검사, 색 코딩 될 수있다.

여섯 3D 데이터 세트의 전체는, 어느 전자 단층 촬영 (3 데이터 세트)를 통해 얻어진 화상의 스택을 포함하고 각각은 FIB-SEM (2 데이터 세트), 또는 SBF-SEM (1 데이터 세트)의 방법을 각각 비교하는 데 사용 네 분할 방법 (그림 3)을 수행합니다. 데이터 세트는 실험실에서 다양한 연구 프로젝트의 다양한 줄기 때문에 아칸소 제공전형적인 실험 데이터 세트의 easonably 다양한 설정합니다. 모든 데이터 세트가 하나의 특정 접근법 가장 익숙한 이들 중 각각 4 개의 독립적 인 연구에 의해 조사 하였다, 이들은 여섯 각 데이터 셋에 대해 최상의 결과를 제공하는 충전 하였다.

다음과 같이 데이터 세트 샘플에서 아르 : 1도 3A1-3A5 : 고압 냉동, 치환 동결 및 수지 포함 된 병아리 내이 머리 세포 stereocilia ^31, 2도 3B1-3B5 : 고압 냉동, 동결 , 치환 및 수지 포함 된 식물 세포 벽 (미 출판) 3도 3C1-3C5 : 고압 냉동, 동결 치환 및 수지 임베디드 내이 머리 세포 kinocilium (미 출판) 4 그림 3D1-3D5 : 높은 압력 - 냉동, 동결 치환 인간의 유선 상피 세포 라미닌 풍부한 extracell에서 배양 된 HMT-​​3522 S1 꽈리에있는 미토콘드리아의 수지 임베디드 블록신경근 매트릭스 ^{32, 33,} 5도 3E1-3E5 : 흠 탁상용 가공, 황산 감속기 세균 생물막의 수지 매립 블록 (제조에서 원고), 및 6도 3F1-3F5 : HMT의 인접 셀들의 경계 막 -3522 S1의 꽈리.

도 3에서 알 수있는 바와 같이, 다른 분할 방법은 다른 데이터 유형에 대한 일부 데이터 집합 타입에 거의 유사한 결과이지만 전혀 다른 결과가 발생할 수있다. 예를 들어, 머리 셀 stereocilia 데이터 세트 (도 3a)을 해석하고 측정하기 위해 깨끗한 인 전문가가 사용자에 의해 생성 설명서 추상화 모델 네 합리적인 접근법 세그멘테이션 볼륨을 산출한다. 이 경우, 이러한 모델은 대응 밀도 맵의 누락 부분의 긴 필라멘트 사이에서 발견 링크의 수뿐만 아니라 결정 계수, 필라멘트 필라멘트 거리의 빠른 측정을 허용시편은 샘플 준비 ^34시 손상 위치에. 이러한 정보는 커스텀 메이드 자동 세그멘테이션 순수 농도 - 기반 임계 값보다 더 나은 결과를 제공하지만, 다른 세 세그멘테이션 방법을 이용하여 획득하는 것이 훨씬 더 곤란하다.

식물 세포벽 (도 3b)의 경우, 수동 모델 생성은 다른 접근 방식 중 어느 것도 달성하지 세포벽에 순서의 의미를 전달에 가장 효율적인 것으로 나타났다. 그러나, 추상화 모델은 데이터 세트의 오브젝트의 혼잡을 캡처하지 않는다. 수동으로 관심의 기능을 추적하는 것은 밀도 기반 또는 형상 감독 방법보다 더 나은 결과를 제공 할 것으로 보인다. 한편, 서, 추적은 매우 노동 집약적이며, 특징의 식별 테두리 다소 주관적이다. 따라서, 자동화 된 접근 방법은 정밀도와 간의 트레이드 오프 전위로 대량 분할하기 위해 바람직 할 수있다자원은 수동 분할에 보냈다.

kinocilium 데이터 세트 (도 3c)의 경우, 수동 추상화 모델 생성은 깨끗한 결과를 산출하고 kinocilium, 잘라낸 데이터에서 쉽게 볼 수있는 내용의 중심 세 미세 소관의 예기치 않은 구조를 보여준다 있지만, 모든 다른 접근법에서 분실 , 이질성 얼룩이 아마도 때문에. 그러나 밀도 맵의 기타 잠재적으로 중요한 기능은 추상 모델의 수동 생성에 누락되어 있습니다. 이는 수동 모델 형성의 주관적 자연 이상화 관찰 실제 밀도의 추상화에 이르게되므로 모델 형성시 주관적 해석한다는 사실이다. 따라서,이 예에서는 멋지게 추상화 모델을 생성 한 3D 볼륨의 특정 양태에 집중할 수있게하는 방법을 보여주는 설명서. 그러나, 선택적 지각과 단순화 모든 단백질의 공동의 전체 계좌를 제공하는 데 실패데이터 세트에 존재 mplexes. 목적은 데이터의 복잡성을 표시하는 경우, 따라서, 다음 하나 더 다른 세 가지 방법 중 하나로 제공된다.

3D 행렬 배양 유선의 꽈리 (도 3d)의 경우에, 높은 콘트라스트 미토콘드리아 너무 놀랍게도 오염의 최저 량으로 최상의 결과를 산출하지 기능 설명서 추적 (함께 쉽게 네 방식으로 분단된다 그림 3D3). 그러나 수동 추적은 매우 노동 집약적이고 많은 양에 따라서 사용이 제한됩니다. 정리를위한 더 트릭을 사용하는 경우 밀도가 임계 값 기반 및 형상 감독 자동화 분할 둘 다 아주 잘 미토콘드리아를 추출하고, 완벽에 가까운 세분화 될 것이다 (예를 들어, 복셀 밀도의 특정 임계 값 아래에있는 모든 개체를 제거)를 사용할 수 등을 다른 패키지. 이 경우, 수동 추상화 모델 구축은 수득되지 않았다일부 유망한 결과, 미토콘드리아 쉽게 공 및 스틱 모델에 근사 할 수 있기 때문이다.

박테리아의 토양 커뮤니티 / 바이오 필름 ​​(그림 3E)에 대해 사 방식의 세 가지 수동 모델 생성으로 인해 기하학적 모양으로 박테리아 같은 생물학적 개체를 나타내는의 도전에 실적이와 함께, 합리적인 결과를 얻을 수 있습니다. 박테리아 유래 세포 외 부속물이 아닌 아니라 수동 추적 기능의 자동 세그멘테이션 방법으로 검출 할 수있다. 형상 감독 커스텀 메이드 자동 세그멘테이션 더에도 매우 큰 데이터 세트를 쉽게 정량화를 허용 (데이터는 도시되지 않음)에도 불구하고 그들의 밀도 유사한 박테리아 세포 기능을 분리 할 수​​있다. 이것은 원래 매우 큰 데이터 세트이므로, 커스텀 메이드 자동 분할해도 다른 모든 접근법 outcompeted하지만 낮은 복잡도 혜택 수도관심 물체의 비교적 드문 드문 분포 (낮은 혼잡).

조직 형상 문맥 (도 3F)이 진핵 세포에서의 계면을 조사 할 때, 관심있는 특징 만 설명서 추적은 좋은 결과를 생성. 자동 밀도 계 분할 접근법은 모두 인접하는 셀 사이의 막 경계를 검출하는 데 실패하고, 전지의 형상은 쉽게 근사 또는 도형과 동등하지 않기 때문에 심지어 커스텀 메이드 접근법 박테리아에 대한 명확한 성공에도 불구하고, 부분적으로 실패 생물막에서 (그림 3E5).

세그먼트 화 접근법은 일부 데이터 세트에 있지만 다른 잘 수행하는 것이도 3에서 관찰은 이들 데이터 세트의 각각의 특징을 어떤 문제에지도, 및 데이터 특성이나 등장 개인 목표의 유형을 분류하는 것이 가능 여부 자신의 respectiv과 잘 일치전자 방식. 이 항목의 체계적인 연구는 이전에 수행되지 않은, 따라서 첫 번째 단계로서 화상의 특성 및 개인적인 목적 중 경험적리스트의 설정은 각 데이터 세트의 특징 추출을위한 최선의 방법을 찾을 수있는 그들의 시도 초보자 가이드있다.

상당한는도 4에 도시되는 8 개의 조건이 확인되었다, 그들은 두 개의 주요 카테고리로 나뉠 수있다 : (1) 데이터 세트에 내재하며, 기능 (2) 연구자의 ​​개인 목적 및 다른 고려 사항은 다소 있다고 주관적, 똑같이 중요한이기는하지만. 주로 세 개의 추가 데이터 세트가 도입되고 함께,도 3에 여섯 데이터 세트로부터 도출 제시된 예 : 하나 (도 4A1)는 애기 장대 식물 세포벽의 크라이 부의 크라이 단층이며, 제 (도 4A2 , 4B1, 4D1 NG>)도 3F1-3F5에 도시 범주에 적합하지만, 더 실질적으로 복잡 할 수있는 고도로 복잡하고 복잡한 조직이다 내이 강선 vascularis의 FIB / SEM 데이터 세트, 및 제이다 (도 4B2 , 4D2)는 피규어 2A1-2A5 및 3A1-3A5에서 세로보기에 도시 샘플 컨텐츠 유사한 단면도에서 내이 머리 셀 stereocilia의 수지 - 부 단층이다.

화상의 특성, 추천 객관적인 기준의 범주에 대한 데이터 집합에 내재 사 특성이 중요한 것으로 제시된다 :

1. 이러한 명확한 세포 기관 또는 다른 눈에 띄는 기능 서, 또는 (3) 높은과 휴대 풍경에서와 같이 (2) 중간 (그림 4A2)을 알아내는-EM 단층 촬영을위한 전형적인으로 데이터의 명암 (1) 저 (그림 4A1)이 될 수 있습니다 (도 4A3) kinoci위한 경우처럼z 방향 내에서 명확하게 분리 사상 요소의 배향에 의한 liary 단층 또는 단면 stereocilia.
2. 데이터는 선명하게 정의 경계를 조직, 또는 선명 (그림 4B2)의 세포로이 가까운 곳에 객체 사이에 눈에 띄게 명확한 경계가 퍼지 (그림 4B1)이 될 수 있습니다. 이것은 부분적으로 약 2-4 FIB-SEM에 비해 전자의 단층 촬영을위한 계수에 의해 본질적으로 높은 데이터 세트 해상도의 함수이다. 물론, 선명한 경계는 후자의 방법 모두 수동뿐만 아니라 자동 분할 접근하는 것이 바람직하지만 필수적이다.
3. 실질적으로 쉽게 이미지 분할을 자동화 렌더링 분리를 예시 콜로니에서 세균과 마찬가지로 밀도지도는 채워 띄엄 밀접 이격 식물 세포벽 성분에 의해 반사, 또는 어느 군집 (도 4C1) (도 4C2) 일 수있다.
4. 밀도지도는 강선 vascularis 혈관 주위 조직 (그림 4D1) 또는 단면 stereocilia와 유사한 조직과 잘 정의 된 세포 기관과 같은 개체 (자주 불규칙한 모양과 매우 다른 기능을 가진 매우 복잡 할 수 있습니다 그림 4D2).

또한 비교가 다소 어렵게, 다른 모든 예에서 매우 다른 스케일을 확인합니다.

외에도 같은 적절한 경로의 선택을 안내 할 것입니다 화상의 특성, 네 매우 주관적 기준으로보다 객관적인 기준에서 또한 제안 :

1. 원하는 목표 : 목적은 복잡성에 모발 다발 stereocilium 시각화 및 결정하고, 오브젝트 (도 4E1)의 형태를 검사하거나, 밀도 맵에 내장되어 단순하고 추상화 공 및 스틱 모델을 생성 할 수 있고, 수있는 빠른 계산기하학적 개체의 차 측정 (필라멘트의 길이, 거리, 연결 수) (그림 4E2).
2. 이 기능 형태가 매우 불규칙하고 같은 액틴 필라멘트와 크로스로 주로 세포 - 세포 상호 작용 등의 미토콘드리아 (그림 4F2)와 같은 다소 유사하게 일부 변형 모양 영역 (그림 4F1), 또는 동일 모양으로 세포처럼 복잡 할 수 있습니다 세로 방향 (그림 4F3)의 머리 묶음에 링크되어 있습니다.
3. 하나의 세그먼트로 3D 데이터 세트의 모든 기능을 할 수 있으므로 세포벽 (도 4G1), 또는 셀룰러 체적의 단지 작은 부분에 대한 경우와 같이 관심 (인구 밀도)의 형상의 비율이 중요 으로는 이종 세포 장면 (그림 4G2)에서 미토콘드리아의 경우입니다. 데이터 세트의 크기 및 분할을 요구 체적의 비율에 따라, 사용하는 것이 가장 효율적일 수있다수동적 인 접근 방법. 그러한 하나가 다양한 기능에 관심이있을 때와 같은 다른 경우에, 단지 반자동 분할 방식을 사용하는 다른 대안이 없다.
4. 또 다른 주요 주관적 기준은 하나의 분할 과정에 투자 할 용의가 자원의 양 및 충실도 어떤 수준의 생물학적 질문에 대답해야합니다. 더주의를 정확한 정량적 정보 (도 4H,)를 구하는 데 필요한 수 있으며,이 경우 하나는, 원하는 (등 다른 기능의 크기, 용적, 표면적, 길이, 거리 등) 기능의 용적 파라미터를 정량화 할 수도 또는 목적은 단순히 자사의 3D 모양 (그림 4H2)의 사진을 스냅 할 수 있습니다. 자원이 제한이 이상적으로, 하나는 분명하게 타협이 아니라 사용자 지원 설명서 특징 추출의 가장 정확한 경로를 선택할 싶지 않을 것이다. 이 많은 데이터 세트에 대해 작동 할 수 있지만, 가까운 장래에 3D 볼륨을 줘야 리터는 10,000 이상으로 10K로 10K의 순서로, 수동 분할은 더 이상 같은 거대한 공간을 분할에 중요한 역할을 할 수 없습니다. 데이터 및 기타 데이터 특성의 복잡도에 따라, 반자동 분할 될 필요가있다.

그림 5에서, 장점과 한계는 간단히 네 분할 방법에 대해 나와 있습니다. 각 방법 페어링 할 수 있습니다 그림 4에서 확인 된 개인 목표와 화상의 특성도 설명되어 있습니다. 그림 6에서 개인 목적과 육 데이터 세트의 이미지 특성 데이터를 분류합니다 및 최선의 방법을 결정하는 방법을 예시. 모두 5와 6이 토론에 따라 확장되는 수치입니다.

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생물학적 영상 재구성 및 분석을위한 그림 1 워크 플로우.이 차트 단층 촬영에 의해 수집 된 다양한 수집하기 위해 촬영 단계 및 프로세스 이미지에 대한 개요를 제공, 이온 빔 SEM 및 일련 블록 얼굴 SEM을 집중했다. 2D 틸트 시리즈 또는 직렬 섹션에서 원시 데이터 수집 결과. 이러한 2D 이미지 세트는 다음 노이즈 감소 및 관심 피쳐의 콘트라스트를 향상시키기 위해 필터링, 3D 재구성으로 정렬되어야한다. 마지막으로, 데이터를 분할 할 수 있으며, 궁극적으로 3D 모델의 결과로 분석했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2.. 단층 촬영 및 FIB-SEM 데이터 수집 후 워크 플로우의 각 단계에서 서로 다른 데이터 유형에 대한 워크 플로우의 예는 4 개의 데이터 세트 (행 AD)를 통해 표시되어 길이 방향으로 단면 stereocilia의 스테인드 단층 촬영 임베디드 수지, 수지는 식물 세포 벽의 스테인드 단층 촬영을 포함 E.의 셀룰로오스, 유방 상피 세포의 미토콘드리아 FIB-SEM 및 SBF-SEM 대장균 박테리아. 원시 데이터를 통해 2D 슬라이스가 컬럼 1에 도시되며, 정렬 및 3D 재구성 후의 데이터로부터 이미지를 따르고 2 열 3 열 적용 필터링 기술 단계는 메디안 필터 (A3)을, 비 등방성 확산 필터 (B3), 가우시안 블러 (C3) 및 MATLAB의 imadjust 필터 (D3). 이자 (4 열)의자를 영역에서 각 데이터 세트에 대한 최적의 분할의 예는 3D 열 5 스케일 바에서 렌더링으로 표시됩니다 : A1-A3 = 200 nm의, A4 = 150 nm의, A5 = 50 nm의, B1-B3 = 200 nm의 B4-B5 = 100 nm의, C1-C3 = 1mm, C4-C5가 = 500 nm의,D1-D3 = 2mm, D4-D5 = 200 nm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

사 분할의 그림 3 응용 프로그램은 예를 들어, 데이터 세트에 접근 식스 ​​예제 데이터 세트는 네 개의 방법으로 분단되었다 :. 수동 추상화 된 모델 생성, 수동 추적, 자동화 된 밀도 기반의 분할 및 커스텀 메이드 자동 분할. 정량적 목적을 위해 모델을 생성하는 것이 아니라 밀도를 추출하는 것이었다 수동으로 추상화 모델 생성은 stereocilia (A)의 단층 스테인드 매립 수지에 효과적이었다. 수지 식물 세포벽 (B), 자동 밀도 계 segmenta 스테인드 단층을 포함기 빠르게 수동 방법은 데이터의 단지 몇 조각에 더 많은 노력을했다 많은 슬라이스를 통해 셀룰로오스를 추출하는 가장 효과적인 방법이었다. 다른 분할 방법하지 않았다 동안 수동 추상화 된 모델 생성은 kinocilium (C)의 스테인드 단층 촬영에서 미세 소관 삼중 생성, 아직이 자동화 된 접근 방법이 더 빨리 밀도를 추출하기 때문에 선호 하였다. 인해 유방 상피 세포의 FIB-SEM (D)에서 미토콘드리아의 형상에 수동 추적 깨끗한 결과 및 신속한 분할 허용 보간 방법의 사용과 결합 된 낮은 인구 밀도를 제공했다. 분할 될하는 데 필요한 많은 양을 감안할 때, 커스텀 메이드 자동 분할은 SBF-SEM 박테리아 데이터 (E), 그러나 모두 자동 방식은 차이가 없었다 세그먼트에 가장 효율적인 것으로 판명. 많은 시간이 소요되지만, 유방 상피 세포막의 FIB-SEM (F)의 압축을 풀 수있는 유일한 방법은 수동 추적했다 스케일 바. :A1-A5 = 100 nm의, B1-B5 = 100 nm의, C1-C5 = 50 nm의, D1-D5 = 500 nm의, E1-E5 = 200 nm의, F1-F5, 바 = 500 nm의. 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 큰 버전.

그림 4 목표 이미지의 특성과 데이터 세트의 선별에 대한 주관적인 개인의 목표. 데이터의 예를 사용하여이 기준은 분할 방식을 사용하기로 결정을 알리기 위해 제안, 특성을 설정합니다. 객관적 특성과 관련하여, 데이터가 본질적으로 낮음, 중간, 높음 (A1-A3), 흐리거나 선명 (B1-B2)이 될 것입니다 대비를 가질 수 밖으로 간격 또는 (C1-C2) 혼잡하고 복잡하거나 단순히이 조직 기능 (D1-D2). 주관적 개인 목적은 원하는 O를 포함 bjective 관심 피쳐의 높거나 낮은 인구 밀도를 선택하여, 관심 (F1-F3)의 기능과 같은 복잡한 시트, 뒤얽힌 볼륨, 선형 형태를 식별하여 정확한 밀도 (E1-E2)을 단순화 된 모델을 대상으로하거나 추출 (G1-G2) 및 시간 (H1-H2) 스케일 바 등의 투자에 점감 반환을위한 고성능 및 높은 자원 할당 사이의 거래 (trade-off)에 따라 결정 :. A1 = 50 nm의, A2 = 1,500 nm의 , A3 = 100 nm의, B1 = 1500 nm의, B2 = 200 nm의, C1 = 100 nm의, C2 = 200 nm의, D1 = 10mm, D2 = 200 나노 미터, 100 나노 미터 = E1, E2 = 50 nm의, F1-F2 = 500 nm의, F3 = 50 nm의 G1 = 100 nm의, G2 = 1mm, H1-H2 = 100 nm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5의 비교 데이터 특성 테이블과 주관적 다른 분할 방법에 적합한 목표.이 표는 각 분할 방법의 장점과 한계를 요약 한 것입니다. 그림 4에서 기준은 분할 방법에 적합한하는 데이터 세트 식별 할 수 있습니다. 이러한 목적 화상의 특성 및 주관적인 개인의 목적은 각 방법의 최적의 사용을 위해 선택하지만, 방해 또는 분할의 효율성을 도움이 될 수 다른 조합. 된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

효율적인 t 그림 6 의사 결정 흐름도세분화 riage은 다양한 특성을 갖는 데이터 세트를 위해 접근한다. 특성은도 4에서 강조에 기초하여,이 도면은 네 개의 기준이 가장도 3에서 설정된 각 데이터에 대한 최적의 분할 방법에 관한 최종 결정에 기여하는 도면. 각 데이터 세트 인 컬러 빨리 또는 동일한 방식으로 이어지지 않을 수있다 대체 경로를 반영하는 기본 의사 결정 과정을 나타내는 굵은 선뿐만 아니라, 점선을 따라 부호화. kinocilium, 박테리아 및 식물 세포벽 데이터 세트는 최상의 접근법이 자동으로 분할 하였다. 대조적으로, 세포막 및 미토콘드리아 경로는 항상 그들의 어려운 특성 수동 추적로 이어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

3D EM 볼륨에서 관련 기능의 추출을위한 효과적인 전략이 시급히 최근 생물학적 영상을 강타했다 데이터 쓰나미와 유지하기 위해 필요합니다. 데이터가 시간 또는 일에 생성 할 수 있지만, 깊이 3D 볼륨을 분석하기 위해 몇 달이 걸립니다. 따라서, 이미지 분석은 과학적 발견을위한 병목 현상되었음을 분명하다; 이러한 문제에 대한 적절한 해결책없이, 영상의 과학자들은 자신의 성공의 희생자가되고 있습니다. 이는 또한 높은 데이터의 복잡성과 일반적으로 단백질 및 단백질 복합체 테두리 다른 하나와 본질적으로는 계조 농도 구배의 연속적으로 나타나는 생물학적 세포에서 발견되는 거대 분자 군집 부분적이다. 문제는 샘플 준비 및 이미징 결함에 의해 복잡하고, 어떤 경우에는 영상 재구성 유물에서 최고의 완전 자동화 된 접근 방식에 대한 문제를 제기 할 수 있습니다보다 완벽한 체적 데이터에있다에스. 가장 중요하지만, 샘플 준비, 촬상 한 생물학적 해석 전문가 좀처럼 잘 계산 과학에 정통한없고, 따라서 효과적으로 피쳐 추출 및 분석 접근하는 방법에 대한 지침을 요구된다는 사실이다. 따라서, 다양한 실시 예를 사용하여, 프로토콜은 세그먼트에 대한 데이터뿐만 아니라, 수동 추상화 모델 생성, 자동 밀도 계 분할 관심 기능 설명서 추적 및 커스텀 메이드 자동 세그멘테이션을위한 단계를 준비​​하는 방법을 설명한다. 절차에 설명 된 수동 및 자동 방법은 여기에 언급 된 일부 분할 소프트웨어의 많은 다양한에서 발견 될 수 있으나, 다른 유사한 기능을 수행하는 동등하게 적합하다.

결과는 3 차원 분할 방법의 각각의 효과는 데이터 집합의 각각의 서로 다른 유형의 다름을 증명한다. 에도의 서로 다른 접근 방식이 질적으로 생산하지만imilar 3D 렌더링은, 최종 생성물로서, 시간 및 노력의 양이 크게 변화 세그멘테이션 과정 각각에 보냈다. 해당 이미지의 특성과 분할 방식 별 개인 목표에 대한 권장 사항은 추가로 다음과 같은 네 가지 하위 절에 설명되어 그림 5에 요약되어있다. 이러한 기준은도 6의 판정 흐름도에 도시 된 바와 같이도 5 않는다., 여섯 데이터 세트에 적용하고, (6)은 단지 각 데이터 세트에 대한 이론적 근거를 제공하기위한 것으로 각 기준 의사 결정 과정에서 가중 된 방법, 그들은만으로는지도 않고, 시작점을 제공하지 않는다. 의사 결정 과정에 영향을 미치는 너무 많은 기준이 단순히있다 : 다른 사람은 원하는 목적 등의 주관적 기준, 반면 일부는 이러한 데이터 세트 특성과 같은 객관적인 기준입니다. 그것은 높은 레프를 표시하는 데이터 세트 말을하는 것이 안전합니다날카로운 선명한 경계와 대비 엘, 잘 분리하고 (너무 다양하지 않음) 상대적으로 균일하며, 많은 수의 개체에 대한 밀도 모델을 표시하는 목적으로 처리하는 기능을 가지고, 자동화 된 접근 방식이 우수한 것입니다하지 않는 경우 수동 접근법은 단순히 자원 (시간) -prohibitive 것이 사실. 콘트라스트가 낮은 경우, 다른 한편으로, 데이터를 퍼지하며, 따라서, 오브젝트가 혼잡하고, 특징이 높은 다양성을 보여 주며, 따라서 이질적 전문가의 지식을 필요로 한 수동 피쳐 추출 이외의 선택이 없을 수 / 분할.

수동 추상화 된 모델 생성

수동 추상화 된 모델 추적, 선형 요소를 분할 자동으로 (스틱) 연결할 수있는 씨앗 포인트 (공을) 제공에 특히 효과적이다. 이러한 공 및 스틱 - 모델은 길이를 측정 할 매우 강력한 될 수 있습니다차와 같은 모델의 방향과는 질적 검사 및 정량 분석​​을 모두 적절하게 추상화 된 모델을 제공합니다. 분석에 소요되는 리소스를 최소화 할 때 일반적으로 사용되는 수동 추상화 모델 생성은 원래의 데이터의 형태로 절대 정확도보다 더 중요하다. 그것은 관심의 선형 및 균일 한 기능 (예를 들면, 필라멘트, 튜브)를 가장 성공적이다. 데이터 콘트라스트, 선명도 및 혼잡이 한 사람의 눈으로 관심 물체를 인식 할 수있는 바와 같이, 이러한 방법의 성공을 결정하는 중요한 역할을하지 않는다. 때로는 그러한 모델들은 세그먼트 골격 골격 주위 영역의 3 차원 맵으로서 이용 될 수있다. 추상적 모델보다는 정확한 밀도 반사이지만, 그것은 3D 밀도 골격 화 된 버전을 나타내고, 따라서 혼란없이 시각화 및 정성 분석을 허용한다. 이러한 길이 정량적 측정은 또한 근사 모델로부터 결정될 수있다. 용수동 추상화 된 모델 세대 소프트웨어의 예는 온라인 키메라의 자세한 사용 설명서를 참조하시기 바랍니다 http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html .

관심의 특징 수동 추적

수동 그림판 추적은 거의 모든 데이터 특성과 잘 작동하지만, 그것은 또한있어서 가장 시간이 소요된다. 때때로, 이러한 얇은 뒤얽힌 세포막 등의 기능의 넓은 다양성을 포함하는 복잡한 이미지 집합에서 관심 특징을 추출하기위한 유일한 방법이다. 관심의 기능이 원활하게 변경 될 때 일부 프로그램에서 사용할 수있는 하나의 유용한 도구가 일시적으로 분할 된 조각 사이의 보간 수 있습니다. 데이터가 선명하고 콘트라스트가 높은 매질에있는 경우 수동 추적은 가장 효율적으로 적용 할 수 있지만, 또한 사용될 수있다사용자만큼 더 도전 데이터 세트에 대한 관심의 대상이 익숙하다. 데이터 복잡성은 객체가 밀접하게 포장 복잡하고 혼잡 한 데이터 세트에 개별 개체에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 자동 접근 방식은 종종 세그먼트에 원하는 볼륨 투쟁 너무 많이 또는 너무 적게 추출로 후자의 경우, 수동 분할은 유일한 선택이 될 수 있습니다. 이러한 뒤얽힌 시트 또는 볼륨과 같은 어려운 기능 형태학은,이 방법으로 추출 할 수 있습니다. 관심의 기능의 높은 인구 밀도의 분할은 시간이 금지되면서 관심의 기능의 인구 밀도가 낮은 경우, 사용자는 여러 가지 어려운 특성을 가진 데이터 셋은 분할 될 수 있음을 알아 두셔야합니다. 수동 추적과 소프트웨어의 예를 들어, 온라인 아미라의 상세한 사용자 설명서를 참조하시기 바랍니다 http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.

자동화 된 밀도 기반의 분할

수동 기법과 대조적으로, 자동화 된 접근 방식은 일반적으로 이미지의 큰 스택을 분할 할 때 고려해야 할 중요한 요소이다 덜 시간 소모적이다. 그러나, 단순 임계 값은 정확하지 않을 수 있습니다, 그리고 훨씬 더 많은 시간이 자동으로 분할 된 볼륨의 정제 및 큐 레이션에 지출 할 수있다. 자동화 된 밀도 기반의 분할은 모든 분할을 요구하는 관심의 비슷한 기능의 큰 숫자를 표시하는 데이터 세트에 가장 잘 작동합니다. 데이터가 더 복잡하면, 이러한 자동화 된 기술은 아직 초기 단계로서 사용될 수 있지만, 가능성이 관심 피쳐를 포함하는 서브 볼륨을 지정하기 위해 라인 아래 일부 수동 개입을 필요로한다. 이 전략은 일반적으로 선형 또는 모폴로지 뒤얽힌 볼륨에서 잘 작동하지만, 같은 회선 얇은 시트와 거의 성공세포막. 고 충실도에 대한 보답으로 같은 시간과 같은 몇 가지 사용자 자원을 늘리지 동안 자동화 된 방식으로 사용자 개입을 최소화는 크고 작은 볼륨을 분할 할 수 있습니다. 자동화 된 밀도 기반의 세분화와 소프트웨어의 예를 들어, 온라인 아미라의 자세한 사용 설명서를 참조하시기 바랍니다 http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf .

커스텀 메이드 자동 분할

커스텀 메이드 자동 세그멘테이션은 특정 데이터 세트에 대한 알고리즘의 전력 지정을 허용하지만, 종종 기능 특성의 제한에 적합한 데이터 세트 또는 데이터 타입을 특정하며, 쉽게 일반화 될 수 없다. 여기에 전시하는 절차는 유역 침수 및 다른 레벨과 일반 자동 분할 방식과는 다릅니다 이러한 시드 포인트에서 고속 행진 큐브 확장 하였다 임계 시드 포인트의 판정에 의존하는 프로그램 집합 방법. 이 테마의 변형은 그라데이션 벡터 정보 기능 경계를 알리는 경계 분할이다. 대조적으로, 여기에 사용되는 사용자 정의 스크립트는 사용자가 수동으로 몇 가지 예를 추적 훈련 단계에 의존한다. 기계 학습을 통해 특정 알고리즘을 감지하고 독립적으로 지속적으로 추적에있는 속성 및 데이터 특성을 인식하는 방법을 배웁니다. 알고리즘을 재교육 더 예를 포함하여 분할의 정밀도를 향상시킬 수있는 전문 사용자는 기능 기준 큰 집합을 제공하도록 추적. 큐 레이션은 단지 수동 추적 등 노동 집약적으로 할 수있다 전반적으로, 임계 값 및 관련 접근 방식, 또는 커스텀 메이드 방식은, 세포 내 소기관이나 모양의 복잡한 다양성 이미지에서 관심의 단일 기능을 추출 유용하지 않을 수 있습니다.

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데이터의 선별 및 분할 접근법을 선택을위한 전략

그림 5와 그림 4와 적절한 데이터 세트의 요약에 나와있는 주관적이고 객관적인 기준을 감안할 때, 그림 6에 도시 된 의사 결정 방식은 데이터 세트의 큰 다양한 기능을 추출 전략의 효과적인 평가를 지원할 수 있습니다. 데이터 세트는도 4에 도입 사 각각의 목적뿐만 아니라 사 주관적인 기준 중 어느 하나를 포함 할 수있다 각각의 네 개의 연속적인 결정에 triaged된다. 예로서,도 6는 여섯 데이터 각각의 선별을위한 합리적 세트는 (그림 3). 의심 할 여지없이, 거기에 하나의 고유 한 경로가 아니라 각 데이터 세트에 대한 t을 발생할 수 있습니다 의사 결정을위한 다른 기준 다음이 행렬을 통해 오히려 다른 경로데이터 세그먼트에 대한 동일하거나 상이한 추천 오. 모든 데이터 세트가 예상 할 수없는 속성의 그것의 자신의 세트를 가지고 동안, 여섯 예는 각각 선호하는 기능을 추출 / 분할 방식 뒤에 이론적 근거에 대한 설명과 쌍을, 주어진다. 또한 대부분의 다른 의사 결정 경로는 동일하거나 다른 분할 방법의 사용에 하나 결과는 (그림 6)에 대한 제안을 포함한다.

kinocilium 자동화 된 접근 가능성이 성공할 수 있습니다 명확하게 정의 된 경계를 설정 선명 데이터입니다. 관심의 모든 기능은 물론 다시 자동화 된 접근 방식을 선호, 분리된다. 또한, 관심있는 특징은 커​​스텀 메이드 분할 비교적 균질 데이터 세트 이상적으로 서로 유사하다. 마지막으로, 목적은 반자동 방식 호의 전체 피쳐를 추출하는 것이었다. 결과적으로, 그것은 체결 한 것 자동 임계 값 (초록색 라인)뿐만 아니라 맞춤 설계 (예) 감독 세그먼트를 형성 방식 (녹색 점선)은 모두이 데이터 세트에 잘 할 가능성이 높다.

결정 네트워크에서 다른 순서로 배치되지만 유사 기준은, 박테리아의 경우에 적용된다. 이 데이터 세트가 매우 큰 때문에 커스텀 메이드 접근 방식은 부분적으로 추천합니다; 따라서, 한정된 자원은 노동 집약적 인 수동 작업 / 분할 방식을 금지하고 있습니다. 임계 값이 허용되는 결과를 산출 한 것입니다 동안, 주문 제작 방식은 박테리아 사이 또는 오른쪽 옆에있는 세균 중 하나에있는 세포 외 금속 예금에서 둥그스름한 박테리아 모양을 분리하는 연구의 주요 목적을 수행 할 수 있었다, 따라서 커스텀 메이드 방식이 선호되었다.

stereocilia 데이터 세트의 경우, 첫 번째 고려 사항은 원하는 목적이었다 목표 전체 농도를 표시 할 수 있습니다또는 기하학적 모델을 만들 수 있습니다. 관심 용적은 혼잡 영역이고, 상기 대물은 세그먼트에 후속 등 것이 도움이되었다 길이, 번호, 거리, 방향을 포함하여 정량적 체적 분석을 실행하기 위해 분리 된 개체와 같은 개체의 다수였다 그 개체 관심은 주로 선형이었고, 이것은 선택의 방법을 추적 기하학적 모델을 만들었다. 그러나, 대신에 목표가 자동 임계 프로토콜을 가능하게 할 선명하게 정의 경계 전체 밀도, 다음 선형 피쳐 형태뿐만 아니라 비교적 높은 콘트라스트를 표시되었을 경우.

세포막과 미토콘드리아 데이터의 경우 인해 기능 형태의 자신의 범주에 자동화 된 접근 방식에 대한 도전 아르 : 뒤얽힌 시트와 볼륨을 각각. 정확하게 목표 셀 또는 미토콘드리아 윤곽을 추적하는 것이지만, 그렇게 할 경우에만 한정된 자원이있다. 인터의 또한, 기능추정은 복잡하며 미토콘드리아 데이터는 아마도 상기 커스터마이즈가인가 될 수있다 박테리아 걸리는 맞춤 스크립팅 접근법 세트이지만, 쉽게 자동으로 검출 또는 모양 부호화 없다. 다행히도, 미토콘드리아 막 자체는 단지 전체 부피의 작은 부분을 나타내고, 따라서, 수동 추적은 시간이 많이 소요되는 방법이라도 간단하다. 콘트라스트가 다소 낮고 경계가 아니라 퍼지 때 수동 추적은 또한 이러한 데이터 세트에 대한 선택의 방법이다. 그들은 데이터 세트의 상당한 부분을 구성하는 경우에도 결과적으로, 이러한 복잡한 시트는 단순히 수동으로 인해 더 나은 대안의 부족으로 추적해야한다.

목표는 세그먼트 조밀 한 간격 및 붐비는 풍경을 구성하는 모든 개체를에 때문에 공장 데이터 세트는 자신의 문제를 제기했다. 밀도를있는 그대로 표시 형상과 물체의 조직,하지만 B에 대한 측정을 가능하게 할여를 수동으로 각 사상 객체가 자동 임계 값 대신에 비용이 너무 많이 사용되었다됩니다 분할.

3 차원 모델을 만드는 다양한 단계 및 대응 결과는 여기에 표시되어 있지만, 더 중요한 것은, 검색된 데이터 및 개인의 특성 기준 세그먼트의 최적 경로가 또한 밝혀져있다 결정하는데 결정적인 것으로. 화상 데이터 자체의 특성이 중요한 반면, 혼잡, 선명도 및 다른 모양 또는 (예 소기관, 필라멘트, 막 등)의 기능의 수로서 여기에 설명 된 것을 포함한다. 주관적 기준 (측정 / 계산, 골격 화 표현 데이터 / 3D 렌더링의 볼륨 표시), 관심있는 기능의 형태 학적 특성 (선형, 연장 된 네트워크, 복잡하고, 복잡한)의 밀도 분할의 원하는 목적을 포함 고려 전체 볼륨 (아르 개체의 분율에 관하여 관심 기능중요한)를 추출 할 필요가 있고, 원래의 데이터의 세그먼트의 충실도에 자원을 늘리지의 장단점 및 자원 할당을 위해 실질적으로 더 높은 증분 개선 결과 투자 수익률 감소를 분산.

영상 분할의 분야는 크게 최근 몇 년 동안 성숙, 아직 특효약, 모든 것을 할 수있는 알고리즘이나 프로그램이 없다. 데이터 세트 크기에 정기적으로 수십 기가 바이트의 수백 메가 바이트에서 성장, 그들은 이제 불가능 가까운 수동 분할을하고, 테라 바이트를 초과하기 시작했다. 따라서, 더 많은 리소스가 인간의 의사 결정 프로세스를 모방 영리한 및 시간 효율적인 피쳐 추출 방법에 투자 할 필요가있다. 이러한 노력은 (Google 어스 유사) 시맨틱 계층 데이터베이스는, (2) 데이터 추상화 기법 (즉, 천이 기반 (1) 지리 정보 시스템 (GIS)과 결합 될 필요컴퓨터 보조 설계 (CAD) 소프트웨어들이 자주 사용되는 바와 같이, (3) 시뮬레이션 기술, 크게 데이터의 양을 감소시키고, 따라서 더 큰 볼륨 ^(35)의 디스플레이를 가능하게하기 위해 호환 형상 / 체적 표현 복셀) 발 엔지니어링 분야뿐만 아니라 (게임 산업을 위해 개발되는 것과 유사한) 플라이 스루 애니메이션을 포함하여 (4) 고급 애니메이션과 영화 제작 기능.

확실히, 효율적으로 피쳐 추출 및 분할은 다른 데이터 유형에 대해 수행 하였다 셀룰러 고해상도 영상이 오는 회전의 중심에 더 나은 방법이 항상 필요한 반면, 그리고, 원리 여기서 제시뿐만 아니라 어떤 방식의 예를 속인다 , 걸릴 접근하는 결정을하기위한 몇 가지 유용한 정보를 제공 할 것입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira	FEI Visualization Sciences Group		http://www.vsg3d.com/amira/overview
Chimera	UCSF		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Fiji/ImageJ	National Institute of Health		http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/
IMOD	Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells		http://bio3d.colorado.edu/imod/
Photoshop	Adobe		http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html
MATLAB	MathWorks		http://www.mathworks.com/
VLFeat	VLFeat		http://www.vlfeat.org/