다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

요약

세균 mechanosensitive 채널은 생체 분자 장치에서 mechanoelectrical 트랜스 듀서로 사용할 수 있습니다. 물방울 인터페이스 이중층 (DIB의), 이러한 장치에 휴대 영감 빌딩 블록, 통합 및 mechanosensitive 채널을 자극하는 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 여기서 우리는, DIB의 형성 기계적인 자극에서 mechanosensitive 채널의 연구를 허용하는 새로운 마이크로 피펫 기반 방법을 보여줍니다.

초록

후 MsCl는 큰 전도도 mechanosensitive 채널 (MSC)는 박테리아가 갑작 저자 삼투 충격을 생존하는 데 도움이되는 유비쿼터스 osmolyte 릴리스 밸브입니다. 그것은 발견 엄격 거의 30 년 동안 패치 - 클램프 기술을 이용하여 연구되었다. 투자율 응답으로 세포막에인가 장력 번역 기본적인 역할은 인공 막 기반 장치에 생체 분자 mechanoelectrical 변환기 역할을 유력하게. 이러한 장치에 빌딩 블록으로서, 액적 인터페이스 이중층 (DIB의)는 후 MsCl 채널의 혼입 및 자극 새로운 플랫폼으로 사용될 수있다. 여기서는 인용 후 MsCl 채널의 활성을 DIB의 형성과 측정 마이크로 피펫 기반 방법을 설명한다. 이 방법은 두 상대 (동축 위치) 붕규산 유리 마이크로 피펫의 팁에 고정 지질 쌌다 수성 방울로 구성되어 있습니다. 물방울이 접촉 될 때, 지질 이중층 인터페이스이다형성했다. 이러한 기술은 화학 성분과 각각의 액적 크기를 제어 할뿐만 아니라, 이중층 인터페이스의 크기를 제공한다. 고조파 압전 액츄에이터에 연결된 마이크로 피펫 중 하나를 갖는 원하는 진동 자극을 전달하는 기능을 제공한다. 변형 동안 방울의 형상을 분석 한 결과, 계면에서 생성 된 장력을 추정 할 수있다. 이 기술을 사용하여, DIB 시스템 후 MsCl 채널들의 제 활성이보고되어있다. MS 채널 외에 채널의 다른 유형의 활동이 플랫폼의 다중 기능을 증명하는,이 방법을 이용하여 연구 할 수있다. 여기에 제시된 방법은, 기본 막 특성의 측정을 가능하게 대칭 및 비대칭 막의 형성을 통해 더 큰 제어를 제공하고, 자극 mechanosensitive 채널을 연구하는 또 다른 방법이다.

서문

지난 10 년간, 인공 지질 이중층의 조립체는 실질적 액적 인터페이스 이중층 방법의 개발로 발전되고있다. 안정적이고 견고한로 알려진, DIB의은 (뮐러) 그린 고전 접혀 (Montal - 뮐러) 평면 이중층 ¹ 대안 모델 시스템으로 자신을 부과했다. 지질 이중층을 만드는 방울을 사용하는 개념은 1960 년대로 거슬러 ² 있지만, 최근까지 인기를 얻고 않았다. 최초의 성공적인 시도는 베일리 그룹 ^4-6에 의해 소적의 네트워크를 사용하는 이중층의 형성을 보여주는 여러 연구 하였다 Takeushi 군 ^(3)에 의해보고되었다. 보다 최근에는, 밀봉 기술은 새로운 자극에 반응하는 물질 시스템 ^(10)의 빌딩 블록으로 DIB의 사용의 개념을 개척 레오 그룹 ^7-9에 의해 제안되었다. 이전 연구에서, DIB의 전기 ^9,11, 화학 반응 할 수있는 능력을 입증^{10, 12의} iCal, 광 자극 ^(13). DIB ^{10, 14에서} 재구성 할 때 다른 자극에 반응하는 기능을 가진 다양한 생체 분자를 효과적으로 자극하고있다. 중요한 문제가 발생이 성공적인 시도에 비추어 : 기계적인 자극에 DIB의 응답이 때 적절한 생체 분자가 포함되어 있을까? DIB에 작용하는 계면 힘은 다른 이중층 시스템 ^{(15, 16)과} 다를. 따라서, 액적 보유한 이중층에 장력 물 지질 오일 계면 장력을 조절함으로써 제어 될 수있다; 페인트 또는 접힌 이중층 시스템에 적용 할 수없는 개념입니다.

널리 osmolyte 릴리스 밸브와 세균의 세포질 막의 기본 요소로 알려진 후 MsCl 채널은, 증가 된 장력 막 ^{(17, 18)에} 반응한다. 하이포 삼투압 충격의 경우에, 여러 개의 채널이 작은 셀에 존재하는 막 ^(19)을 생성 할 수 MAS시브 투과성 반응은 신속하게 용해 ⁽²⁰⁾ 박테리아를 저장, 이온과 작은 분자를 분리합니다. Biophysically, 후 MsCl 잘 연구하고 눈에 띄는 패치 클램프 기법 ^21-23을 통해 주로 특징. 후 MsCl의 게이팅 메커니즘 ^{(24, 25)을} 설명하는 신뢰할 수있는 구조 모델의 동체의 크리스탈 ⁽²⁸⁾ 모델링 구조 ^{26, 27,} 및 광범위한 실험 ^24,29-31의 결과를 바탕으로 제안되고있다. ~의 적용 긴장에서 10 mN의 / M, 횡단 나선의 꽉 번들로 구성되어 닫힌 채널은 ~ (28)의 물이 채워진 도전 기공 ^21,24,32를 형성 크게 기울어 나선의 고리로 변환합니다. 또한 내측 TM1 도메인의 교차점에 위치하는 게이트 타이트의 소수성은, 채널 ^(33)의 작동 임계 값을 결정하는 것으로 확립되어있다. 이에 대응하여, 그 발견 된 해당 게이트의 소수성을 감소시킴으로써, 장력N 임계 값 ^(22)을 낮게 할 수있다. 의 MsCl이 속성은 주로 약물 전달을 위해, 다양한 제어 밸브 ^(34)의 설계 가능. 모든 전술 특성 및 전기 생리 활동에 세포막 과도한 긴장을 번역하는 근본적인 역할에 따라, 후 MsCl는 DIB의에서 mechanoelectrical 변환기로 좋은 착용감을합니다.

이 글에서, 우리는 기계적인 자극에서 통합 후 MsCl 채널의 활동을 DIB의 형성 및 측정하는 원래의 마이크로 피펫 기반 방법을 제시한다. 우리는 처음과 DIB의 기계적 자극 ^(35)의 MsCl V23T 낮은 임계 변이체의 기능적 재구성 DIB의 행의 응답을보고한다.

실험 시스템은 두 개의 반대 붕규산 유리 마이크로 피펫의 팁에 고정 지질 쌌다 수성 방울로 구성되어 있습니다. 물방울이 접촉 될 때 지질 이중층 인터페이스는 fo를 인rmed. 이 기법은 각각의 액적 (벌크)의 화학 조성과 크기를 제어 할뿐만 아니라, 이중층 인터페이스의 치수를 제공한다. 또한, 각 전단 각종 지질 조성물 비대칭 막을 용이하게 형성 할 수있다. 고조파 압전 액츄에이터에 연결된 마이크로 피펫 중 하나를 갖는 미리 프로그래밍 된 단일 사이클 또는 진동 자극을 적용 할 수있는 능력을 제공한다. 장력을지지 두 방울의 압축을 통해 인공 막에 전달된다. 액적 변형의 결과로, 수분 - 지질 오일 인터페이스 증가와 동시에 물방울이 이루는 각의 영역은 막의 장력 과도 후 MsCl 활성의 증가를 초래 감소한다. 변형 동안 방울의 형상을 분석 한 결과, 계면에서 생성 된 장력을 추정 할 수있다. 이 문서의 초점은 DIB의 메카 - 전달 특성에 비록, 우리는 또한 강조 다른 종류의 바이오이러한 alamethicin 같은 분자는이 다기능 플랫폼에 의해 활성화 될 수있다. 우리는, 제조, 조립, 및 단계적인 방식으로이 새로운 방법으로 측정을 모든 기술적, 여기에 제시한다.

프로토콜

PEG-DMA 히드로 겔 1. 준비

1. 응용 프로그램에 대한 적절한 측정 / 혼합 용기 (플라스크, 비커, 등.)을 선택합니다. 세제와 물을 사용하여 철저하게 청소하고 보풀이없는 조직 와이퍼로 닦아주십시오.
2. 손끝에서 오일 유리 오염을 막기 위해 장갑을 착용 할 것. 세제 잔류 물을 제거하기에 충분한 탈 이온수로 린스 용기.
3. 다음, 물을 없애 이소 프로필 알코올 (IPA, 99.5 %)와 스프레이 청소까지 닦아 보풀이없는 조직과 컨테이너를 닦습니다. 모든 IPA가 완전히 증발 할 수 있도록 진공 챔버에 넣습니다. 증류수 하이드로 겔 형성 공정에 사용되는 실험 장치의 나머지 부분을 청소한다.
4. 실험실 규모를 사용하여 중합체; 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 메타 크릴 레이트 (MW = 1,000g / 몰 PEG-DMA) 4 g을 무게, PEG-DMA 하이드로 겔 용액 (V / W) 40 %를 제조 하였다.
5. 4에서의 초음파 목욕을 사용하여 플라스크 열로 무게 PEG-DMA를 배치고체 PEG-DMA까지 5-55 ° C는 액화했다. 이 과정에서 물을 유지하는 파라 필름 / 왁스 종이와 플라스크의 개방을 커버합니다.
6. PEG-DMA가 액화되면, 완충 용액 (500 mM의 KCl을 10 mM의 MOPS, 산도 7.0) 전체 볼륨이 ~ (여섯 달 동안 여러 실험을위한 충분한) 10 ml에 도달 할 때까지를 추가합니다.
7. 0.5 %의 경화제를 추가 (W / V). 이 경우에, 10 ml의 혼합물에 경화제 0.05 g을 추가한다. 다시 초음파기 욕조에 플라스크를 놓고 구성 요소 (10 분, 250w 정도) 솔루션에 용해 할 수 있습니다.

주 : 경화제가 첨가 된 후 충분한 시간을 위해 모든 광원에 노출되는 경우, 하이드로 겔 (응고)을 치료한다. 이를 방지하기 위해 검은 테이프와 유리 병 / 컨테이너를 포장하고 어두운 장소에 보관하십시오. 이 용액을 실온 (22 ℃로) 여러 주 동안 저장 될 수있다.

Lipos 2. 준비OMES

1. 1,2- diphytanoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (DPhPC)의 합성 20 mg의 완충액 10 ㎖ (500 mM의 KCl을, 10mM의 MOPS, pH를 7.0)을 추가하여 2 ㎎ / ㎖ 지질 용액 10 ㎖를 준비 지질은 동결 건조 분말로 구입. 반드시 모두 지질 소포 및 완충 용액을 충분히 (모든 것이 용해 될 때 혼합물이 균일 헷갈리는 찾아야한다)를 혼합합니다.
2. 동결 (-20 ° C)와 완전히 여섯 배의 총 새로운 지질 혼합물을 해동. 절대 가열 된 환경에서 실온에서 혼합 해동하자.
3. 시판되는 압출기를 사용하여, 0.1 ㎛의 멤브레인 필터를 통해 제 0.4 ㎛의 폴리 카보네이트 멤브레인 필터를 사용하여 다음 여섯 번 전체 지질 현탁액을 강제로 지질을 돌출. 이 프로세스는 (필터의 기공 크기와 동일) 100 nm의 직경에 가까운 입자를 산출한다.

주의 : 다른 지질 및 지질 비율이 나에게을 사용하여 제조 될 수있다THOD. 리포좀은 몇 주 동안 4 ℃에서 보관해야합니다.

3. 후 MsCl 절연 및에서 재구성

1. 온도 아가로 오스 판 밖으로 행진 포함 100 μg의 / ㎖ 암피실린, E. 3 '말단 (C- 말단)에 6 그의 태그로 확장 V23T 후 MsCl 유전자를 운반하는 pB10b 플라스미드와 대장균 MJF465 세포. 고정 배양기에서 37 ° C에서 문화 하룻밤 (12-16 시간)에 판을 허용합니다. 플라스미드를 선택하고 표준 LB 배지에 100 μg의 / ㎖의 앰피 실린과 세포에서 유지된다. 배양 소포 100 μg의 / ㎖ 암피실린과 LB 미디어의 다음날 장소 20 ㎖ (50 ㎖ 플라스크 또는 무엇을 볼 수는 문화를 유지하기 위해). 하룻밤 배양 접시를 타고 멸균 접종 막대기로 제조 된 20 ㎖의 LB 미디어 (접종) 전송 플레이트에서 식민지를 선택합니다. 20 ml의 문화 진탕 배양기에서 250 rpm으로 37 ℃에서 하룻밤 (12 ~ 16 시간)을 성장하도록 허용합니다.
2. 20 ㎖ overn을 가만히 따르다LB 배지의 2-4 L로 ight 문화. 암피실린은 더 이상 필요하지 않습니다. OD _(600)는 0.5에 도달 할 때까지 37 ℃에서 250 rpm으로 진탕 배양기에서 진탕 플라스크. 0.6 mm의 최종 농도 이소 프로필 β-D-1-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 추가하고 문화 (OD ₆₀₀ = 0.8 ~ 1.0까지) 다른 시간에 갈 수 있습니다.
3. 문화를 진정 한 후 원심 분리하여 박테리아를 수집하는 얼음에 플라스크를 넣습니다. 박테리아 펠렛에 충분하다 7438 XG에 5-8 분 동안 원심 분리 (사용 된 회 전자에 의해 허용 또는 많은) 여섯 400 ML 원뿔 튜브를 사용합니다. 뜨는을 가만히 따르다, 미디어의 모든 세포가 수확 될 때까지 절차를 반복합니다. 필요한 스핀의 수는 증가 된 양의 배양과 사용에 따라 달라 로터. 2 L 배양 대 번만 세포를 스핀 다운하는 데 필요하다. 하나의 원심 분리기 튜브에 수집 된 모든 세포를 전송합니다.
4. ~ 프렌치 프레스 버퍼 (100 mM의 KP 20 ㎖를의 세포 펠렛을 재현 탁I 및 5 밀리미터의 MgCl _2, pH를 7.4). 서스펜션은 (크림이나 우유 등) 조밀해야한다. 즉시 현탁액 2 mM의 최종 농도로 프로테아제 억제제 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF)를 첨가하고, 격렬히 혼합 불어 가압 전에.
5. 프랑스 프레스 10,000 16,000 PSI에 35 ml의 프랑스 압력 셀의 문화. 7438 XG, 4 ° C에서 10 분에 끊어지지 세포를 분리하기 위해 서스펜션을 스핀 다운.
6. 별도의 튜브에 뜨는을 넣고 거기에 라이소자임과의 DNase (0.2 mg의 / ㎖ 각)를 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 텀블 상등액하자.

참고 : DNase의 선택 사항입니다; 그것은 고속 원심 분리를위한 점도를 감소시킨다. 라이소자임은 중요하다; 또한 칸막이 벽의 잔재 소화 및 비 - 변성 중성 세제로 이루어 멤브레인의 추출 수율을 높일 수.

7. 두 초 원심 분리기 튜브로 상청액을 혼합 분산하고 그들을 스핀40 분 동안 4 ° C에서 (회 전자)에 따라 106,883-153,911 XG. 원심 분리 후 상등액을 경사 분리하고, 하단 갈색 펠렛 (전체 막 분획)는 장기 보관을 위해 튜브에 고정 될 수있다 (- 80 ° C) 또는 즉시 단백질 정제에 사용.
8. 높은 이미 다졸 완충액 0.5 L 제조 : 100 mM의 NaCl을 + 500 mM의 이미 다졸을 농축 HCl로 pH를 7.2-7.4로 적정한다. 이미 다졸은 그 자체로 좋은 완충 물질합니다.
9. 적절 100 mM의 염화나트륨과 위의 버퍼를 희석하여, 100 mM의 NaCl을, + 15 mM의 이미 다졸 : 낮은 이미 다졸 버퍼의 0.5 L를 준비합니다. 어떤 pH 조정이 필요하지 않습니다.
10. 별도의 병에 각 버퍼의 100 ~ 150 mL를 취하여, 및 B-옥틸 글루 코피 라노 시드 (OG) (/ V W) 1 %를 추가합니다. 잘 솔루션을 저어 0.22 μm의 필터를 통해 필터링합니다. 이러한 솔루션은 저 높은 이미 다졸 크로마토 그래피 솔루션입니다.
11. , 추출 버퍼를 준비 낮은 이미 다졸 완충액 50 mL를 취하여, 3 %를 추가 (W / V)OG 및 완충액을 필터.
12. 단백질 분리를 위해 0.5 g의 습 중량의 막 펠렛을 사용합니다. 추출 완충액 5-7를 가하여 펠렛을 재현 탁하고, 30 ㎖ 유리 손 구동 피스톤 균질 기에서 균질화. 5-10 부드러운 스트로크 덩어리가없는 균일 한 현탁액을합니다. 주의하십시오, 전단 응력은 단백질 변성을 일으키는 것으로 알려져있다.
13. (15 분 동안 4 ° C에서, 미드 레인지 원심 분리기, 고정 각 로터, 38,478-68,405 XG) 불용성 입자를 스핀 다운. 한편, 니켈 NTA 비즈 (정지 6 ㎖)의 3 mL를 취하여 저 이미 다졸 버퍼 15 ㎖에 그들을 흔들어 (/ OG O를 W) 스크류 캡 튜브로 한번 씻어. 구슬이 바닥에 (~ 5-7 분) 정착 또는 4 ℃에서 일분에 대한 129-201 XG에 그들을 스핀 다운 보자. 펠릿을 형성 한 후에 심하게 손으로 상청액을 가만히 따르다하고 절차를 반복한다. 3 % OG 추출 버퍼의 2-3 ml의 구슬을 평형.
14. (3)로부터 균질화 액 (막 펠렛 추출 완충액)을 혼합한다.3-3.5 ml의 니켈 NTA 구슬 (12). 60 분 (배치 로딩)에 대한 스크류 캡 튜브에 믹스 전락하자. 201 XG (30 초)에서 구슬을 스핀 다운 손으로 뜨는을 가만히 따르다, 한 번 1 % OG 낮은 이미 다졸 버퍼 구슬을 씻는다. 다시 3.13에서와 구슬 펠렛 신선한 낮은 이미 다졸 버퍼의 20 ~ 30 ㎖에 그들을 재현 탁.
15. 니켈 NTA 구슬 (상부 흐름 어댑터 장착) 작은 열을 포장하고 구슬을 통해 추출 흐름을 (구슬 건조하는 것을 허용하지 않습니다) 수 있도록 꼭지를 열어 해결 할 수 있습니다. 오픈 스톱 콕 10 ml의 낮은 이미 다졸 버퍼 (1 % OG) 중 하나를 나누어으로 구슬을 씻으십시오.
16. 시스템 정의 된 유속 순수 및 하이 - 이미 다졸 버퍼의 각각 약 25 ㎖를 크로마토 그래피 시스템을로드 (기계마다 다름); 이 먼저 시스템을 통해 낮은 이미 다졸 버퍼를 전달하여 수행됩니다. 제로 외경 ₂₆₀ (기준)의 광학 레코더. 저급 다졸 나가 있기 때문에 버퍼 물 상당히 다르다 유의자외선을 흡수 mpurities. 컬럼 흐름 어댑터를 삽입하고는 컴퓨터에 연결합니다.
17. 저 이미 다졸 버퍼 다시 열을 씻어 기준에 도달 제공을 통해 흐름의 외경까지 (1 ml / 분에서 ()는 10 ~ 20 ml에 걸릴 수 있음). 이 열에서 언 바운드 단백질을 제거합니다.
18. 1 ㎖ / 분으로, 30 분 동안, 500 mM의 이미 다졸 (20)의 선형 구배를 적용. OD _600의 증가를 나타낸다 때 4 mL의 분획 수집을 시작. 후 MsCl-6His 선형 그라데이션의 40 % ~에서 용출을 시작하는 반면, 처음 두 분획, 느슨하게 결합 된 단백질들로 가득합니다. 단백질의 대부분은 3~8 분획에 나타난다.
    주 : OD의 선형 증가로 인해 이미 다졸 증가 %로 관찰한다.
19. 3-4, 5-6, 7-8가 함께 분수를 풀. 임의로, 개별적 분획을 농축시킨다. 분수를 원심 필터를 사용하여 6 ~ 10 배 농축. 804 XG에 4 ° C에서 20 분 스핀 후, 조심스럽게, 농축 된 단백질을 재현 탁단백질은 필터에 집중하는 경향이있다.
20. 50 μL 분취 액을 철회 SDS 샘플 버퍼를 혼합, 페이지 겔 전기 영동을 사용하여 단백질 순도를 확인합니다.
    참고 : 후 MsCl이 겔의 바닥에 약 17 kDa의의 퍼지 밴드로 마이그레이션합니다.
21. 제조자의 지시에 따라, 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질을 정량 농축 분획을 사용한다. 0.8 G 막 펠렛에서 전형적인 수율이 결합 된 분수의 순수한 단백질의 0.2 mg의 몫이다.
22. 투석을 통해 DPhPC 리포좀에 V23T 후 MsCl을 복원합니다. 세 일회용 둥근 바닥 (12 X 130mm) 유리 튜브에 그것의 10 ㎎ / ㎖ 클로로포름 DPhPC의 솔루션과 나누어지는 0.5 ㎖ (지질 즉, 5 mg)을 가져 가라. 질소의 흐름에 따라 지질을 건조 및 진공 (4-6 시간)에서 클로로포름의 잔재를 제거합니다.
23. 투석 버퍼 (100 밀리미터의 KCl, 5 mM의 핵심 성과 지표 (KPI), 산도 7.2), 소용돌이, 그리고 미 2 ㎖에 용해, 각 튜브에 건조 지질에 분말 OG의 15 ~ 20 mg을 추가ldly 초음파 처리. OG-가용화 지질 맑은 용액을 형성한다.
24. 100 1 : 300, 1 : 1을 달성하기 위해 각 튜브로 농축 후 MsCl V23T 솔루션을 추가 1,000 단백질 대 지질의 비율을 잘 소용돌이. (준비 번호가 클립 세 쌍을 가지고, MWCO 8000, 7.5 mm 직경을.) 잘라 투석 튜브의 세 가지 (~ 12cm 길이)을 씻어
25. 주의 깊게 클립 끝을 닫고, 네 변경 4 ℃​​에서 48 시간 동안 버퍼의 2 L (100 밀리미터의 KCl, 5 mM의 핵심 성과 지표 (KPI), pH7.2)에 대해 투석, 튜브 내부의 가용화 지질 단백질 혼합물을 배치 매 12 시간 버퍼. 투석 후, proteo - 리포좀은 준비가되어 있습니다.

주 : 리포좀 용액 NaN3를 2 mM의 (아 지드 화 나트륨)로 보충하고 4 ℃에서 저장 될 수있다. 냉동하지 마십시오.

석유 저수지 4. 제조

1. 2 인치 직경의 벽을 통해 대향하는 2 개의 구멍 (직경 1.0 mm) 줄곧 드릴, 1.5 cm 길이 아크릴 CYL바닥 (그림 1A)에서 1cm에서 인디언 자리.
2. 동심 드릴 두 4mm 구멍은 이전에 1mm 구멍을 드릴. 구멍의 깊이는 1mm 각 (모든 방법을 드릴 수 없습니다 확인)해야합니다. 이 구멍은 고무 가스켓에 맞게 만들어집니다.
3. 오일 누출을 방지하기 위해 더 큰 구멍에 1mm의 내경을 갖는 접착제 및 장소 두 고무 개스킷.
4. 10cm X 10cm 어떤 다목적 에폭시를 사용하여 얇은 아크릴 판 (그림 1)로 가공 된 실린더 접착제.

실험의 날 :

전극 5. 준비

1. 실버 클로라이드 (AgCl을) 코팅을 형성하기 위해 2 시간 동안 표백제에 자신의 팁을 담가 두 개의 250 μm의 직경은 와이어 7cm 길이를 잘라합니다. 회색 색상은 AgCl을 코팅 (그림 2E)을 형성되었음을 나타냅니다.
2. 유리 커터를 사용하여, 10cm 길이 / 0.58 1 OD / ID mm의 붕규산 클래스 capil 분할두 5cm의 모세 혈관에 라히.
3. 34 게이지이 Microfil 바늘이 PEG-DMA 하이드로 겔과 모세 혈관을 채우기 사용. 모세관에서 팽창에서 수화 겔을 방지하기 위해, 끝에서 3mm의 간격을 유지하고 모세 혈관에 기포가 없는지 확인합니다.
4. 하이드로 겔 충전 모세 혈관 (그림 2E)에 자세 / AgCl을 전극을 삽입합니다.
5. 자외선 스폿 총을 사용 W 1에서 2 분 동안 자외선에 노출시 자유 라디칼 광중합을 통해 PEG-DMA 하이드로 겔을 치료.

6. 실험 설정하기

주 : 실험 패치 앰프 접지에 접지 패러데이하에 설치된다.

1. 남성 커넥터 (그림 2E)가 직선 미세 전극 홀더에 마이크로 피펫 중 하나를 연결합니다.
2. 패치 증폭기 (그림 2A)의 headstage에 미세 전극 홀더를 연결합니다. 난방을 연결하려면접지 dstage는 headstage위한 적절한 커넥터에 18 게이지 절연 된 구리 와이어를 납땜.
3. 3 축 수동 미세 조작기에 headstage를 탑재합니다. headstage 장착 판을 부착 (이 미세 조작기와 함께 구입 또는 사용자 정의 기계 공장에서 만들어 져야한다) 미세 조작기에 다음 적절한 나사를 사용하여 장착 판에 headstage 연결합니다.
4. 실험실에서 만든 커넥터를 통해 리니어 액츄에이터 두 번째 마이크로 피펫을 첨부 한 후 두 번째 미세 조작기 (그림 2B)에 모두 탑재. 마이크로 피펫 정렬, 서로 대향하며 수평으로 평평해야한다. 참고 : 조작기의 브랜드와 스타일은 중요하지 않습니다.
5. 유리 바이알에서의 V23T 후 MsCl proteoliposome 용액 0.01 ㎖로 DPhPC 리포솜 0.1 mL를 섞는다.

주 :이 단계는 안정된 bilaye 지질의 형성에 중요한 단백질 - 대 - 지질 비 (~ 0.0002)을 감소시키기 위해 필요아르 자형.

6. 34 게이지이 Microfil 바늘을 사용하여, proteoliposome 솔루션 (그림 3A)이 모두 가능한 Micropipette의 팁을 입력합니다.
7. 직립 현미경 위에 저수지를 놓고 반대 1mm 구멍 (그림 2B)를 통해 마이크로 피펫을 공급. 주 : 현미경가 한 방울 명확하게 볼 수있다 사용할 수 있습니다.
8. 헥사 데칸 (99 %)와 표면에 저수지를 입력합니다. 헥사 데칸 추가의 정제가 필요하지 않습니다.
9. 제 10 μm의 직경 붕규산 유리 마이크로 피펫을 사용하여, 마이크로 피펫의 선단에 구형의 물방울을 형성하기 위해, 마이크로 피펫의 선단 희석 V23T 후 MsCl의 proteoliposome 용액 (~ 0.00052 ㎖)에 분배하고을 형성하기 위해, 제 미세 조작기에 장착 방울 (그림 3).
10. (F를 원하는 (감소 또는 볼륨을 증가시킴으로써) 방울의 크기를 제어하고이를 단일 층이 완전히 형성하도록 10 분간 쉬게igure 3).
11. 접촉 방울을 가지고, 이중층의 형성은 1 내지 2 분 내에 발생한다.

7. 소프트웨어 및 장비 설정

1. 컴퓨터, 현미경, 압전 발진기 제어기, 함수 발생기, 패치 증폭기 및 저잡음 데이터 수집 시스템을 켜서 소프트웨어를 준비한다.
   참고 : 어떤 패치 앰프는 사용할 수 다음과 같은 지침은 재료 및 장비 목록에 나열되어 우리가 사용하고 하나를 위해 특별히입니다.
2. 패치 앰프의 전면 패널에서 VHOLD / IHOLD 및 V-CLAMP에 "모드"노브를 설정합니다.
3. 전면 패널의 "로우 패스"베셀 2 1 kHz 및 출력 게인을 필터로 설정합니다.
4. 전 세포 β = 1 "구성"을 설정합니다.
5. 노브의 나머지 부분은 제로 또는 중립 위치에 설정되어 있는지 확인합니다.
6. 5 kHz에서 모든 DIB 전류 측정 샘플1 kHz의 베셀 앤티 앨리어싱 필터.
7. 바탕 화면에있는 아이콘을 두 번 클릭하여 소프트웨어를 실행합니다.
8. "치기"대화 상자를 엽니 다 "구성> 디지타이저"를 클릭 한 다음 "변경"버튼을 클릭합니다.
9. "변경 디지타이저"대화 상자에서 "디지타이저 유형"목록에서 "Digidata 1440 시리즈"를 선택합니다.
10. 디지타이저를 검출하기 위해 스캔 버튼을 클릭합니다.
11. "변경 디지타이저"대화 상자를 종료 한 다음 "치기"대화 상자를 종료하려면 "확인"을 클릭 "확인"을 클릭합니다.
12. "설정> 실험실 벤치"를 클릭합니다.
13. 실험실 벤치의 입력 신호 탭에서 디지타이저 채널 아래에서 아날로그를 선택합니다. 0.002에 축척 비율을 설정합니다.

지질 이중층의 8 형성

1. BNC 케이블을 사용하여, AW의 출력을 연결외부 명령 입력 전면 aveform 발생기 (데이터 획득 시스템의 후면 패널) 스위치. headstage에 10 Hz에서 500 MV PK - 투 - PK 삼각 파형을 보냅니다.
2. 미세 조작기를 사용하여, 그들은 약간 터치 (일반적으로 약 1 분 ~ 2) (도 3C 및 3D)를 발생 숱이 이중층을 기다릴 때까지 접촉 방울을 가지고 수평 유리 마이크로 피펫을 이동합니다.

주 : 이중층 형성 공정의 진행은 현미경을 통해 육안으로 볼 수있는 전류 측정 (도 4)에 의해 모니터링 될 수있다.

3. 이중층의 크기를 조정 (~ 250 μm의 직경) 미세 조작기를 사용하여, 상기 액츄에이터에 장착 된 액체 방울의 위치를​​ 제어함으로써. 참고 : 이중층 크기는 시각적으로 현미경을 통해 추정 할 수있다. 이 방법은 쉽게 연구자가 용이하여 이중층의 크기를 제어 할 수있게미세 조작기를 사용하여 액 적을 이동.

9. 동적 여기 및 후 MsCl 게이팅

1. 이중층을 형성하고 (즉, 이중층 또는 도전성 파괴되지 않음) 안정되면, 함수 발생기를 이용하여 정현파 신호를 전송하여 소적을 자극한다.
2. 이중층에 통합 후 MsCl 단백질을 자극하는, 압전 서보 컨트롤러 175 μm의 피크 - 투 - 피크 진폭, 0.2 Hz의 주파수 및 50 % 듀티 사이클을 가진 정현파를 송신. (다양한 형태의 파형은 상이한 진폭, 주파수 및 듀티 사이클과 함께 전송 될 수있다)

10. 처리 및 해석 결과

1. 가 .abf 형식으로, 데이터 수집 시스템을 이용하여 기록 전류 측정을 저장한다. 함수 파일 "abfload"를 사용 matlab에 가져 오기 데이터 (가 .abf 형식) 후 분석하고 데이터를 처리한다. "abfload"파일은 무료 온라인 사용할 수 있습니다.
2. 예상 T적절한 카메라를 사용하여 기록 된 전체 작동 사이클 동안 방울의 비디오를 사용하여 이중층과 방울의 면적 확장에 그는 긴장.
3. 물 / 오일 계면의 면적뿐만 아니라 액적 사이의 각도를 추정하는 화상 처리 기술을 이용하여 각각의 프레임을 처리함으로써 매트랩 프로세스 비디오. 주 : 비디오에서 가져온 2D 프레임을 이용은, 유수 인터페이스 (즉, 액체 방울의 가장자리)를 검출하고 회전에 의해 표면적을 측정.

결과

도 1 및 지질 이중층 막의 기계적 자극의 과정에서 단백질 활성을 기록하는 2 디스플레이 실험 장치 및 장비를 사용 하였다. 우리의 측정에 전기 노이즈를 최소화하기 위해, 워크 스테이션이 실험실 만든 패러데이 케이지 내에 배치되고, AxoPatch 200 B 앰프의 접지 연결에 접지.

안정적인 절연 지질 이중층의 형성은이 연구에서 핵심적인 단계이다. 이러한 구성에서, 지질 단층은 유기 용매 조에 침지 수성 액적 오일 / 물 계면에서 조립. 물방울이 접촉하여 배치되는 경우, 과량의 오일을 제거하고, 두 분자 두께의 지질 이중층에 대향 지질 단층 얇다. 이중층 특성화에 사용되는 가장 일반적인 방법은 전압 클램프이다. 전류를 측정하면서, 전압 클램프, 이중층 양단의 전압은 일정한 값으로 유지된다.도 4 초기 이중층 형성의 전형적인 실시간 현재 녹화를 그렸다. 특정 용량 (~ 0.6 μF / cm ²⁾ DPhPC 지질 이중층 ^5를 알면, 이중층의 형성 영역을 산출 할 수있다. 이중층 영역 방울 (도 4A)의 위치를 변화시킴으로써 제어 될 수있다. 압전 액츄에이터를 이용하여, 상이한 주파수, 진폭과 듀티 사이클에서의 파형 (정현파, 사각형, 삼각형, 등.)의 종류가 가로로 물방울인가 축 방향 그들을 진동하므로, 이중층 장력 영역은 변경 될 수 될 수있다 (그림 4B).

DIB 기계적 자극되면 막을 가로 질러 일정한 DC 전위를 유지하면서,의 MsCl 낮은 임계 (기능 획득) V23T 돌연변이는 주로 서브 도전 상태와 때때로 전체 개방 이벤트를 포함하여 안정적인 작업을 생성한다 (도 5) . 이 EV엔트는 정제 후 MsCl V23T으로 재구성 그대로 내부 대장균 및 리포좀 막에서 패치 - 클램프 기술을 이용하여 기록 된 것과 동일하다. 도 5의 결과는 모든 전류 스파이크가 압축 피크에서 관측되기 때문에 그 게이트는, 장력의 증가에 반응하여 발생 증명. 최대 압축에, 물방울의 상대 면적 확대가 최대이므로, 계면 장력은 최대이다.

DC 전압이 막 ^(36)을 가로 질러인가 될 때 Alamethicin, 전압 관문 이온 채널과 가장 공부 펩티드 중 하나는, 세포막 투과성을 증가시킨다. 막 횡단 단백질 및 펩티드를 호스트 지질 이중층 인터페이스의 능력은 또한 펩티드 alamethicin 사용 전압 게이팅 현재 녹화를 수행함으로써 테스트된다. Alamethicin 100 NG / ml의 최종 농도 인지질 용액과 혼합된다. (6)는 아래에 전류 측정을 보여준다 전압 클램프 (115 MV). 이 실험에서 작은 방울 이중층 인터페이스 따라서 더 높은 저항 및 더 작은 커패시턴스를 달성하기 위해 이격 당겨진다. Alamethicin 펩타이드의 게이팅 동작 전류 (그림 6)의 분리 단계를 통해 표시됩니다. 플롯의 우측의 막대 그래프는 기본적 채널 자체의 제 컨덕턴스 레벨 인 기준 레벨 (0.0962하고 nS)의 컨덕턴스 변화를 나타낸다.

그림 1. 주요 부품, 오일 저장소의 크기를 설명하기위한 개략 오일 리저 버지니아 테크 기계 공장에서 제조된다. 그것은 아크릴 시트의 표면에 접착 가공 원통형 아크릴 튜브로 구성되어 있습니다. 치수 및 디자인은 다른 응용 프로그램 또는 두 개 이상의 마이크로 피펫을 수용하도록 변경 될 수있다./53362/53362fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 실험 장치 및 마이크로 피펫 제조 (A) 기계적으로 형성하는 자극과 인터페이스 이중층을 특성화 표준 워크 스테이션 현미경, 3 축 매니퓰레이터, 디지털 카메라, 압전 진동자, 방진 테이블 및 패러데이 케이지를 포함 (도시되지 않음). (나) 실험 장치는 수평 헥사 데칸 오일 목욕 내에 위치이 반대 PEG-DMA 하이드로 겔 충전 가능한 Micropipette로 구성되어 있습니다. 마이크로 피펫의 각각은 전기적인 접속을 제공하는 Ag / AgCl 전극 포함. proteoliposome 용액으로 채워진 마이크로 피펫 셋째는 다른 마이크로 피펫의 선단에 액 적을 형성하기 위해 사용된다. (C) DIB 전류 반응을 측정 할 수 있었다패치 증폭기 및 저잡음 데이터 획득 시스템의 조합을 사용. (D)는 마이크로 피펫의 끝 부분에 형성된 수성 방울을 보여주는 그림을 마감했다. (E)의 Ag / AgCl을 전극에 표백제 개의 250 ㎛의은 와이어의 선단을 침지하여 제조된다. 전극은 고화 UV 광 경화 PEG-DMA 하이드로 겔로 충전 두 보로 실리케이트 유리 모세관을 통해 공급된다. 남성 커넥터 직선 미세 전극 홀더는 패치 증폭기의 headstage에 가능한 Micropipette 중 하나에 연결하는 데 사용됩니다.

도 3 :. 액적 인터페이스 이중층의 형성을 도시하는 이미지 (A) 테오 가득 10 μm의 마이크로 피펫을 마이크로 피펫 팁 부근의 현미경으로 위치된다. 마이크로 피펫에 연결된 주사기를 사용하여, 작은 양을 분배테오의 원하는 볼륨으로 구형의 물방울을 형성한다. 방울 10 분 동안 앉아있을 수 있도록하여 단층 양식을 보자. 접촉에 방울을 가져; 계면에서의 모든 오일이 제거 된 후에는 이중층 형성 할 것이다. 이중층이 형성되어 있지만, 인터페이스의 양측 화학 성분은 마이크로 사이즈의 마이크로 피펫을 이용하여, 원하는 약품 주입에 의해 제어 될 수있다 (B). (C) 제의 접촉 순간 방울. (D) 지질 이중층을 형성 방울.

도 4 : 실시간 측정은 초기 씨닝 및 인터페이스의 후속 팽창 모두 표시 삼각 전위의인가를 통해 이중층의 형성 과정에서 측정 (A)를 현재.. 측정 된 전류의 크기 capaci 정비례tance 및 이중층 인터페이스 따라서 영역. 인터페이스와 그 반대의 지역 더 큰, 작은 물방울이 함께하게된다 가까이. 기계적 자극인가시 (B)는, 이중층 계면의 면적이 증가하고, 자극 신호와 동일한 주파수에서 감소한다.

도 5 :. 실시간 측정은 기계적 자극에 이중층의 응답뿐만 아니라의 MsCl V23T 변이체 게이팅 표시 전류 응답의 형상의 결과로서 이중층 커패시턴스에 정현파 변화에 관한 것으로, 이는 사인파 이중층 지역 변경. 전류 스파이크는, 각 사이클의 피크에서 발생, V23T 돌연변이의 하위 전도 게이팅을 나타냅니다. 상기 극성 플롯 게이팅 이중층 계면 장력의 증가를 반영하는 피크 압축 발생 것을 나타낸다.

그림 6 :. 전압 클램프 및 통합 Alamethicin 채널의 게이팅 활동에 대한 전도도 수준의 대응 히스토그램에서 전류 측정 Alamethicin 펩타이드의 게이팅 동작 전류의 이산 단계적인 증가를 통해 표시됩니다. 전도 수준은 버지니아 공대 ^7에서 우리의 연구 그룹에 의해 수행 이전의 측정과 매우 잘 일치합니다.

토론

Mechanosensation는 생물 진화 최초의 감각 전달 경로 중 하나를 의미한다. 공부와 DIB의 전기 - 기계 특성을 이해하는데이 현상을 이용하여, 자극 - 반응 기능성 물질 향해 중요한 단계이다. 그것은 mechanoelectrical 변환기 및 지질 이중층 인터페이스 장력 증가를 검출하는 변형 게이지로서 DIB에 mechanosensitive 채널, 후 MsCl의 결합 및 활성화를 수반한다. 다른 주에, MS 채널의 기능은 두께, 극한 곡률 및 압축성을 포함한 지질 이중층의 기본 물성을 통해 조절 될 수있다. 전술의 관점에서, 마이크로 피펫 기반 기술 연구원 DIB의에서 MS 채널을 연구 및 지질 이중층의 구조뿐만 아니라, 지질 - 단백질 상호 작용에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 능력을 허용하는 유용한 도구를 제공한다.

지난 3 년간 이상들, 패치 클램프는 전압과 긴장 모두의 클램핑을 할 수 있기 때문에, MS 채널을 연구하는 기본 방법이었다. 그러나, 패치 클램프는 부피가 큰 장비 소형화, 감각 및 변환 장치의 설계에 필요한 속성에 대한 적합하지가 ​​필요합니다. 그 단순성과 안정성, 소형화로 인해의 MsCl은 DIB의 활성을 연구하기에 적합한 환경을 나타낸다. 여기서는 액적 및 이중층 인터페이스의 크기, 각각의 방울의 화학 조성 및 동적 자극을 통해 계면 장력을 제어 할 수있는 능력과, 마이크로 피펫 기반 기술을 제안하여 DIB 형성 기법 이전 진보를 연장한다. 기술은 동축 유리 모세관 대향 팁, 테오 함유 수성 액 적을 고정 이루어져있다. 접촉 계면에서의 지질 이중층을 형성하게 할 때, 유기 용제 액의 욕조에 넣고있다.

P는 마이크로 피펫에 부착된다방울의 수평 변위를 허용 iezoelectric 발진기. 동적 물 오일 계면에서 계면 장력의 증가에 따라서 이중층 장력의 증가 방울 결과를 압축. 두 가지 주요 측면은 유사과 최근 발표 된 연락처 거품 이중층 (CBB) 기술 ^{(37)에서이} 방법을 차별화. 여기에 제공된 기술을 사용하여, 이중층의 크기가 미세 조작기를 이용하여 제어되고, 이에 따라 액 적의 볼륨 CBB 방법에서와 달리, 일정하게 유지. 또한, CBB 기술은 단순하고 구축하기 쉬워 본 논문에서 제시된 방법에서 필요하지 않은 가압 펌프를 요구한다.

우리는 통합 및 패치 피펫 또는 화학적 변형 ^(38)의 사용없이 처음 세균성 후 MsCl을 자극 할 수있다. 시스템은 강력한 지질 이중층 비대칭 막의 형성을 용이하게하므로,보다 밀접 L을 모방생물 세포막에서 발견 IPID 비대칭. 이것의 MsCl 활동 제어 막 조성물 또는 비대칭의 효과를 연구하기 위해있게 해준다. 또한, 화상 처리 기술을 통해,이 방법은 이중층 계면 장력을 추정 할 수 있습니다. DIB에서 벌크 및 표면 세력 사이의 상호의 원리를 이해하는데이 기술 어시스트, 기본적인 막 특성의 측정을 용이하게하고, 긴장을 막 후 MsCl 응답의 이해를 향상시킨다.

이 방법은 후 MsCl을 연구 걸음 더 가까이 생체 분자 자극 - 반응 물질 시스템을 향한와 다른 생리 학적 환경에 우리가 걸립니다 만, 시스템에 대한 제한 사항이 있습니다. 이 시스템에서의 장력으로 인해 오일 / 물 계면 장력을 완화하는 경향이 각 액적에서 리포좀 형태의 지질 저장소의 존재에 클램프 될 수 없다. 따라서, 현재의 mechanosensitive 채널에서 자극 할 수있다단지 동적 정권에서 DIB의에. 시스템에서의 기포의 존재는 상당히 실험의 정밀도 및 재현성에 영향을 준다. 하이드로 겔에 존재하는 기포는 전기 연결의 경우 손실이 발생할 수 있습니다.

우리의 MsCl 자극 마이크로 피펫 기반 방법의 사용을 설명하지만,이 기술은 MS 채널들의 다른 유형을 연구하기 위해 사용되며, 생체 분자의 다양한 연구하는 연구자에 의해 사용될 수있는 잠재력을 보유 할 수있다. 예를 들어, 유사한 설정이없는 채널 액적 인터페이스 이중층 막의 mechanoelectrical 반응을 연구하기 위해 실험에 사용되었다. 다양한 단백질을 재구성하고 각 생체 분자의 재구성 환경 변화를 고려하여 복용이 높은 제어 설정을 사용하여 활성화 할 수있다. 이 문서에서 설명하는 방법은 연구자의 상상력에 제한되어 상당히 넓은 응용 가능성에 감동.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filter	Corning	430624
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)	Avanti Polar Lipids	850356P	Purchased as lyophilized powder
34-gauge microfil	World Precision Instruments	MF24G-5
400 mL Centrifuge bottels	ThermoFisher	3141	Nalgene
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz	Keysight Technologies	33220A
Ampicillian	ThermoFisher	BP1760	ACS Grade
Avanti® Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids	610000
Axio Scope.A1	Carl Zeiss	-
AxioCam HSm	Carl Zeiss	-
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	-
BCA protein assay kit	Pierce	23225
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator	Digi-Key	BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Dialysis tubing	7 Spectra/Por	132113	MWCO 8000, 7.5 mm diameter
DigiData 1440A system	Molecular Devices	-
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
DPhPC	Avanti	850356C
E-625 PZT Servo-Controller	Physik Instrumente	E-526
FPLC System	Pharmacia Biotech	-
HCl	J.T. Baker	9535-33
Hexadecane, 99%	Sigma-Aldrich	544-76-3
Homoginizer	Wheaton	357426	15 mL
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513
IPTG	Affymetrix	17886
IRGACURE® 2959	IRGACURE®	555047962
Isopore Membrane Filters	EMD Millipore	VCTP02500
Isopropyl Alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACS Grade
KH2PO4	Mallinckrodt	7100	ACS Grade
Kimble-Chase	Kontes	420401-1515	Flex-Column
LED-100 UV Spot Curing System	Electro-Lite, corp.	81170
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
Manual Patch-Clamp Micromanipulators	Thorlabs	PCS-520N
MgCl2	ThermoFisher	M33	ACS Grade
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MEH1S
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000
MOPS, minimum 99.5% titration	Sigma-Aldrich	M1254-100G
N2 Gas	Airgas	UN1066
NaCl	EMD	SX0420-1	ACS Grade
Ni NTA agarose beads	Qiagen	1000632
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID	McMaster-Carr	8486K545
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator	Physik Instrumente	P-601
PAGE gel	Bio-Rad	456-9033
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film	Parafilm®	PM999
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate	Polysciences, Inc.	15178-100
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk	Sterlitech Corporation	PCTB0425100
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405-500G
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves	VWR International	CA89-38-272
Replacement Gasket 1.0mm	World Precision Instruments	GO1-100
SDS	Sigma-Aldrich	L5750
Silver wire	GoodFellow	147-346-94	Different diameters could be used depending on the application
Sodium Azide	Affymetrix	21610
Test tubes	ThermoFisher	14-961-27	12 x 130 mm
Tryptone	ThermoFisher	BP1421
Ultracal 30K	Millipore	UFC803024	Amicore Ultra 30 MWCO
VWR Light-Duty Tissue Wipers	VWR International	82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner	VWR International	13089
Water Purifier	Barnstead	D11931
Yeast	ThermoFisher	BP1422
β-octylglucopyranoside	Anatrace	O311S