펩타이드를 결합 형광 단백질 DNA와 표면 닿는 큰 DNA 분자의 시각화

요약

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

초록

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

서문

유리 구슬 표면에 닿는 큰 DNA 분자의 시각화 DNA 기판 ^1,2- 고분자 물리학 DNA - 단백질 상호 작용, 단백질 역학 조사에 이용되었다. ^3,4- 단일 닿는 큰 DNA 분자를위한 플랫폼 구별 몇 갖는다 이점, 다른 DNA의 고정화 방법으로 비교 하였다. ⁽⁵⁾ 우선, 표면에 닿는 큰 DNA 분자의 결합 부위를 인식하는 DNA 결합 단백질에 대한 중요하다 전단 흐름없이 자연스러운 임의 코일 형태를 갖는다. 둘째, 유동 챔버에서 일련의 효소 반응에 대한 DNA 분자 주위의 화학적 환경을 변경하는 것은 매우 쉽다. 셋째, 미세 유체 전단 흐름 대안 DNA 신장을 사용하여 달성하는 것은 매우 어렵다 전체 윤곽 길이의 100 %까지 연신 분자량 DNA는 표면 고정화 ⁶ 및 나노 채널 가둠으로 접근 ^{유도한다.도 7a} stretche 완전히D DNA 분자는 게놈지도에서 효소의 움직임을 모니터링하는 데 유용 할 수의 위치 정보를 제공한다.

그럼에도 불구하고, DNA 테 더링 방식은 YOYO-1은 일반적으로 닿는 DNA 분자가 용이 형광 여기 광에 의해 파손되게로서 그 인터 염료의 중요한 단점을 갖는다. 일반적으로, 많은 DNA 분자는 형광 현미경 시각화 형광 염료로 염색 될 수있다. 이를 위해, YOYO-1 또는 다른 TOTO 계 염료는 이중 가닥 DNA를 층간 삽입 할 때 이러한 염료 만 형광 때문에 주로 사용된다. ⁽⁸⁾ 단, 비스 인터 염료 광 - 유도 DNA의 광 분열로 인해 발생하는 것이 잘 알려져 형광체의 인터. ⁹ 항, 표면에 닿는 형광 염색 DNA 분자는 전단 흐름이 자유롭게 DNA 분자 이동에 힘을 깨고 발휘할 수 있기 때문에 더 약하고. 따라서, 우리는 새로운 D-FP로 DBP 개발표면에 닿는 큰 DNA 분자 이미징 NA 단백질 염색 염료. FP-DBP를 사용하는 이점은 그것이 바인딩하는 DNA 분자의 광 분열이 발생하지 않는다는 것이다. ⁽¹⁰⁾ 또한 비스 인터 염료 윤곽 길이를 증가하면서, FP-DBP는 DNA의 윤곽 길이가 증가하지 않는다 약 33 % 정도.

이 비디오 방법은 PEG-비오틴 표면에 큰 DNA 분자를 테 더링에 대한 실험 방법을 소개합니다. (1) 평활 말단 스티커 끝으로 DNA를 테 더링의 서로 다른 접근 방식을 보여줍니다. 따라서, 이러한 착색 방법은 DNA 분자의 모든 유형에 적용 할 수있다. 2 DNA 분자를 늘릴뿐만 아니라 화학적 및 효소를로드하는 전단 흐름을 생성하기 위해 주사기 펌프에 의해 제어 될 수 유량 용기 조립체의 개략적 인 표현을 도시 한 도표 솔루션을 제공합니다. 그림 3은 PEGylat에 닿는 완전히 뻗어 DNA 분자의 현미경 사진을 보여줍니다에드면 ⁽¹¹⁾ 및 FP-DBP로 염색.

프로토콜

1. DNA 바이오 티 닐화

1. 터미널 트랜스퍼하여 블런트 엔드 DNA의 바이오 티 닐화 (TDT)
   참고 : 무딘 엔드 DNA이다 사용 T4 DNA (166 KBP)를.
   1. 2.5 _{밀리미터의의 CoCl2,} 10 × 반응 버퍼의 5 μL, 10 mM의 비오틴-11-dUTP를 0.5 μL, 터미널 전이 0.5 μL (10 대), 및 T4 DNA의 0.5 μL (0.5 μg의 / μL)을 5 μl를 추가 반응 혼합물에 관한 것이다. 물 38.5 μL를 첨가하여 50 ㎕의 최종 부피로 만든다.
   2. 1 시간 동안 37 ℃에서 반응 혼합물을 인큐베이션.
      주의 : 연장 반응 시간, 즉 이중 닿는 DNA를 얻을 수 있고, biotins이 양단 태그 것이 가능하다.
   3. 0.5 M EDTA, pH가 8의 5 μl를 추가하여 반응을 중지합니다.
   4. 4 ° C에서 튜브를 유지합니다.
2. DNA 리가 제를 사용하여 접착 종단 DNA의 바이오 티 닐화
   참고 : 끈적 엔드 DNA이다 사용 λ DNA (48.5 KBP). <올>
3. T4 DNA 리가 아제의 1 μL, 10 × 내고 버퍼의 5 μl를 25 ng의 1 μl를 추가 / λ 파지 DNA μL, 50 μL의 최종 부피를 만들기 위해 물을 43 μl를 추가합니다.
4. 4 ° C에서 튜브를 유지합니다.

2. 기능화 표면 유도체 화

주 :.도 1에 도시 된 바와 같이 유리 표면에 DNA 분자의 말단 밧줄하기 위해, 차 아민기를 바이오틴 PEG 코팅 하였다 커버 슬립에 실란 화되고 이는 PEG 화 과정은 단일 분자 DNA 이미징에 중요한 그 때문에 크게 표면에 원하지 않는 분자의 부착에 의해 생성 된 랜덤 노이즈를 감소시킬 수있다.

1. 피라냐 청소
   참고 : 피라냐 솔루션 따라서는 적절한 안전 지침에 따라주의하여 취급해야한다, 유기 물질과 격렬하게 반응한다.
   1. 장소는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 랙 된 커버, 및 B을 길게Y PTFE 길이 스레드 인감 테이프, 랙에 표면의 가장자리 반에 반. 래핑 후, 세정 과정에서 랙을 처리 테이프의 긴 조각 (~ 5cm)를 떠난다.
   2. SO H ₂ O _{2의 4,} 150 ml의 흄 후드에서 피라 솔루션을 만들기 위해 H _2의 350 ml의 1 L의 유리 비커를 입력합니다. 2 시간 동안 피라냐 용액에 선반을 두십시오.
   3. 비커에서의 pH까지 탈 이온수로 철저하게 빈 비커에서 피라 솔루션 및 린스 된 커버는 중립에 도달한다. 산도 종이 스트립을 사용합니다.
   4. 30 분 동안 비이커에서 물을 함유 커버 슬립의 랙 초음파 처리. 비커에서 불과 아미노 실란 화하기 전에 빈 물. 유리 기판 청소 및 유도체 화하는 초음파 전력 75 W를 사용합니다.
2. 유리 표면에 Aminosilanization
   1. N 2 ㎖를 추가 - [3- (트리 메 톡시 실릴) 프로필] 에틸렌 디아민, 200 mL의 빙초산 10 ㎖aminosilanization 용액을 제조 깨끗한 폴리 프로필렌 용기에 메틸 알콜.
   2. 폴리 프로필렌 용기에 세척 된 커버를 놓습니다. 30 분 동안 100 rpm으로 실온에서 그들을 흔들어.
   3. W. 적어도 30 분 동안 100 rpm으로 실온에서 그들을 흔들어 75에서 15 분 동안 유도 된 커버 슬립으로 비이커를 초음파 처리.
   4. 에틸 알코올로 두 번 비커에서 솔루션을 비우기, 메틸 알코올로 한번 신중 된 커버를 세척합니다. 저장 에틸 알콜 된 커버와 2 주 내에서 사용합니다.
3. 커버 슬립의 PEG 화
   1. 0.1 M 중탄산 나트륨 10 ㎖ _{(의 NaHCO3)을} 만든다. 0.22 μm의 주사기 필터 솔루션 필터.
   2. 비오틴-PEG 숙신 카보네이트 _{(비오틴-PEG-SC)과의} NaHCO3 350 μL에 PEG 숙신 발레 레이트 80 mg의 (MPEG-SVG)의 2 mg을 녹이고. 가벼운 보호 튜브를 사용합니다.
   3. 1 적극적으로 튜브를 와동0 초 원심 분리는 1 분 거품을 제거하는 10,000 × g에서.
   4. 에틸 알콜로 세척 한 다음 아세톤 유리 슬라이드를 헹군다. 공기 슬라이드가 완전히 건조 할 수 있습니다.
   5. 깨끗한 유리 슬라이드에 PEG 용액의 방울 (50 μl를) 놓습니다. 모든 거품을 생성하지 않고, 아미노 실란 화 커버 슬립으로 부드럽게 방울을 커버.
   6. 3 시간 동안 장소 슬라이드 밤새 어둠 속에서, 실온에서 습기 챔버를 잘 평준화합니다. 바닥에 물 챔버로 빈 피펫 팁 홀더를 사용합니다. 튜브에 잔류 PEG 용액을 밀봉하고 4 ℃에서 보관하십시오.
   7. 탈 이온수로 철저하게 PEG 화 coverslip에 린스. 사용할 때까지 어둡고 건조한 장소에 보관하십시오.

3. 유량 용기를 조립

1. .도 2에서와 같이, 펀칭 아크릴 홀더를 제작 튜브 인서트의 직경이 0.762 mm 인 것을 확인하고 하나의 구멍 입구 인 지정 다른 것은출구 (그림 2).
2. 모든 채널에 구멍을 교란하지, 입구와 출구 구멍에 수직으로 정렬 양면 접착 테이프 스트립 아크릴 홀더 (폭 5-6mm) (그림 2)를 놓습니다. 멀티 채널 벽 챔버를 만들기 위해 이러한 테이프 스트립을 사용합니다. 피펫 팁을 사용하여 테이프를 스크럽.
3. 인쇄면이 밑으로 가도록 PEG 화면이 흐름 챔버를 만들기 위해 상단에 PEG 화 커버 슬립을 놓습니다.
4. 누출되는 모든 솔루션을 방지하기 위해 양면 테이프가 배치되는 지역을 통해 커버 슬립의 상단을 누릅니다. 상단 및 하단 (그림 2 노란색)에서 챔버의 가장자리를 닫습니다 속건 에폭시 접착제를 추가합니다.
5. 기밀 주사기에 튜브 (외경, OD, 0.042 ")의 짧은 조각 (2.5 cm)를 연결하고 에폭시 접착제와 공동 인감.
6. 주사기에 연결된 튜브와 에폭시 접착제와 공동 밀봉 : 긴 유연한 튜브 (0.03 "OD)을 연결합니다.
7. TUBI 채우기NG는 DI 워터와 주사기에 연결. 공기 거품이없는 것을 확인합니다.
8. 에폭시 접착제로 밀봉 유량 용기의 구멍에 튜브를 삽입합니다.
9. 저수지와 다른 구멍에 노란색 팁 (200 μL 팁)을 놓습니다.

유량 용기에 4 샘플로드

주 : 뉴트라 비딘는 스트렙 아비딘과 같은 다른 단백질로 대체 될 수있다. 이 언급하지 않는 한 모든 반응을 실온에서 수행 될 수있다. 노란색 끝에서 시료 용액을 가지고, 아크릴 홀더 (그림 2b)의 구멍에 솔루션과 팁을 설치합니다.

1. / min로 50 μL로 시린지 펌프의 유량을 설정한다. 로드 아비딘 단백질의 20 μL (T50 용액 25 μg의 / ㎖, 10 mM의 트리스, 50 mM의 염화나트륨, pH가 8), 10 분 동안 유지.
2. 로드 (20) 비오틴 올리고 데 옥시 뉴클레오티드의 μL (1 × TE 100 μM), 10 분 동안 유지. 터미널 트랜스퍼가 사용되는 경우,로드를 건너올리고 데 옥시 뉴클레오티드의.
3. 부하 (20) 10 μL / 분의 유속으로 유동 챔버로 1 단계의 DNA 용액 μL, 30 분 동안 유지.
4. 1 × TE와 유량 용기를 세척하고, FP-DBP ⁽¹⁰⁾ (~ 80 nm의) 40 μl를로드합니다.
5. 60X 대물 렌즈에 1 × TE에서 염색 분자의 연속적인 흐름과 형광 현미경으로 DNA를 관찰한다. FP (eGFP는) -DBP의 여기에 대한 488 nm의 고체 레이저를 사용합니다. DNA 분자의 전체 신장을 위해 사용되는 DNA의 길이에 따라 서로 다른 유속을 적용한다. 예를 들어, T4 DNA의 166 KBP에 대한 λ DNA의 48.5 KBP, 100 μL / 분 동안 50 μL / 분을 적용합니다.
   1. 아크릴 홀더의 재활용, 가정용 세제 ^(12)에 조립 흐름 챔버를 흡수. 완전히 벗고 손으로 면도날과 마찰와 테이프와 에폭시를 제거합니다. 주사기 바늘 구멍을 방해를 없애기. 더 사용할 때까지 탈 이온수의 소유자를 유지합니다.

결과

도 1은도 1b도.도 1a는 스티키 종단 DNA 분자가 아비딘 코팅 된 PEG 상에 고정화 상보 오티 닐화 올리고 뉴클레오티드 혼성화 방법을 도시한다. DNA 분자의 말단 구조에 따라 두 개의 서로 다른 DNA 테 더링 방법을 도시의 첨가를 보여준다 바이오틴 어떤 ddNTP 또는 터미널 전이에 의해 무딘 엔드 DNA의 3 '히드 록실 그룹의 dNTP. ...

토론

여기에 우리가 표면에 고정을 위해 비오틴 긴 DNA 분자를 시각화 플랫폼을 제시한다. 우리는 바이오틴 소 혈청 알부민과 아비딘 단백질이 코팅 된 표면에 닿는 DNA 분자에 대한 접근 방식. ⁶ 이전 방법에서보고, 우리는에 닿는 DNA 분자를 얼룩 비스 - 인터 염료에 의한 DNA의 사진 분열의 중요한 문제를 발견 표면. 이러한 지속적 여기 형광체는 여기 광 전력이 광 분열을 방지하기 위해 최소화?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase	New England Biolabs	M0315S	Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S	Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip	Marienfeld-Superior	0101050	22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack			Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™ tape
Sulfuric acid	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35% in water
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine	Sigma-Aldrich	104884
Glacial Acetic Acid	Duksan Chemicals	414	99% Purity
Methyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	99.9% Purity
Polypropylene Container	Qorpak	PLC-04907
Ethyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	A300202	99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe Filter	Sartorius	16534----------K
Biotin-PEG-SC	Laysan Bio	Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetone	Jin Chemical Co. Ltd.	A300129	99% Purity
Microscope Slides	Marienfeld-Superior	1000612	~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support			Custom Fabrication
Double-sided Tape	3M		Transparent type
Quick-dry Epoxy	3M
Polyethylene Tubing	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe	Hamilton	81165
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizma base
Microscope	Olympus	IX70
EMCCD Camera	Q Imaging	Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.