투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현은 포유 동물 숙주 세포에서 분비 세균 독소의 효과를 연구하기

요약

여기서, 케 라티노 사이트에 Streptolysin S, 그룹 A 연쇄상 구균에 의해 생성되는 독소 분비 효과를 연구하기 위해 투과성 막 삽입 계 감염 시스템을 사용하는 방법을 설명한다. 이 시스템은 용이하게 감염 동안 각종 숙주 세포 유형에서 다른 박테리아 분비 단백질의 연구에 적용 할 수있다.

초록

대부분의 세균성 병원균 강력한 독소는 숙주 세포에서의 신호 변화를 개시하거나 감염 과정 동안 면역계 반응을 조작 숙주 조직의 파괴를 도움 분비. 방법이 성공적으로 정화하기 위해 개발이 중요한 독성 인자를 많이 생산되고 있지만, 여전히 그 독특한 구조 또는 광범위한 번역 후 변형 정화 및 체외 시스템에서 공부하기가 어려워 많은 박테리아 독소가 있습니다. 또한, 순수한 독소를 얻을 수있다하더라도, 중요한 생리 학적 조건하에 독소의 구체적인 효과를 연구와 관련된 많은 문제점이있다. 숙주 세포에서 분비되는 박테리아 독소의 효과를 평가하기위한 시험관 내 세포 배양 모델에서 대부분 독소 일회 투여로 숙주 세포를 배양 포함한다. 이러한 방법은 불완전 독소 지속적으로 생성되는 감염 동안 실제로 어떤 숙주 세포 경험 근사균체 및 감염 과정 동안 점진적으로 축적시켰다. 이 프로토콜은 인간의 상피 각질 세포에 Streptolysin S, 그룹 A 연쇄상 구균에 의해 생성 된 강력한 독소의 효과를 연구하기 위해 투과성 막 삽입 기 세균 감염 시스템의 설계를 설명한다. 이 시스템은 더 가깝게 순수 독소 나 세균 상층 액을 직접 숙주 세포에 적용하는 방법보다 감염시 자연 생리적 환경을 모방. 중요한 것은,이 방법은 또한 박테리아와 숙주 세포 사이의 접촉을 지시하기 때문이다 숙주 반응의 바이어스를 제거한다. 이 시스템은 호스트 효과적으로 막을 무결성 세포 생존율 및 세포 시그널링에 응답 Streptolysin S (SLS)의 효과를 평가하기 위해 이용되고있다. 이러한 기술은 용이하게 분비되는 박테리아 인수 D의 특정 역할을 조사하기 위해 포유 동물 숙주 세포 유형의 다양한 다른 분비 독성 인자의 연구에 적용 할 수있다감염 과정 uring.

서문

숙주 세포 감염의 맥락에서 박테리아 독성 인자의 기능을 이해 세균성 병인 연구의 주요 초점이다. ^{10 -} 많은 세균 병원체 적극적 숙주 세포에서의 신호 변화를 개시하거나 감염 ^한 과정에서 면역계의 반응을 조작 숙주 조직의 파괴를 도움 독소 및 기타 가용성 인자를 분비한다. 방법이 성공적으로 정화하기 위해 개발 및 연구를위한이 중요한 독성 인자를 많이 생산되고 있지만, 일부 박테리아 제품은 체외 시스템에서 사용하는 격리에서 공부 할 수 없습니다, 따라서 정제 방법에 대한 그들을 완강히 저항하는 후보를 만들어 독특한 구조 나 광범위한 번역 후 변형이 . 예를 들어, 그룹 A 스트렙토 코커스, 인두염에서 괴사 성 근막염 독성 쇼크 증후군 감염에 이르는 수많은 책임이있는 세균 병원체, 분비 생산^{17 -} Streptolysin S (SLS) ^(11)로 알려진 박테리아 독소. 이 ribosomally 생성 펩티드는 Streptolysin S 관련된 유전자 (처짐) 클러스터에 의해 인코딩되고, 성숙한 제품은 크기 ¹⁴ kDa의 2.7을 추정된다 ^{- 17. 17 -} 사가로 인코딩 된 독소 (protoxin)는, 성숙, 함수 형태 ^(15)을 생산하는 여러 효소 (SagB, SagC 및 SAGD)로 번역 후 변형된다. 독소의 특이 아미노산 서열과 결합 된 이러한 번역 후 변형의 복잡성 ^{15,17 데이트} 시도 된 모든 정제 및 구조 해명 노력과 호환 독소 렌더링있다. 이 문제는 호스트의 발병 기전에서이 독소의 구체적인 역할을 결정하기 위해 복잡한 노력이 있습니다.

정제 된 독소 또는 다른 분비 요인의 준비가 가능 복잡하거나하지 중 하나 인 경우에 메커니즘에서^{20 -} 이들 제품의 기능은 전통적으로 한 다음 셀 ^(18)을 호스팅인가 여과 세균 상층 액의 제조를 통해 연구되었다 명료. 이 기술과 관련된 여러 가지 문제가 있습니다. 저장하고 나중에 숙주 세포에 적용 첫째, SLS 포함이 분비 요인의 대부분은 최대 또는 일관된 활동을 유지하지 않습니다. 상청액은 단일 시점에 수집 한 후 숙주 세포에 적용되는 경우 또한, 그 생리 학적 관련성을 결정하기 위해 분비 인자는에 감염 과정에서 축적 할 수있는 자연적인 감염 과정에 대해 직접적인 결론을 도출하기 어려운 생리 학적으로 관련 농도. ^{3,8 -이} 두 번째 도전은 세균 상층 액의 사용뿐만 아니라 숙주 세포 연구 ^1에서 정제 된 독소의 사용뿐만 아니라 적용됩니다. 이러한 문제를, 투석막을 INSE를 해결RT 계 감염 시스템은 최적의 독소 활성을 유지하고, 또한 박테리아 및 숙주 세포 간의 직접적인 접촉의 변수를 제거하는 방법으로 숙주 세포에서 SLS의 효과를 평가하기 위해 개발되어왔다. 이 시스템에서, 인간 상피 세포가 아니라 두 개의 챔버의 하부 챔버 내에서 단층으로 성장하고, 박테리아 같은 웰의 상부 챔버로 도입된다. 다공질 막 (0.4 ㎛의 세공) 분비 인자는 두 챔버 사이에서 교환 될 수있게하지만, 박테리아의 흐름을 방지하는 상부 및 하부 챔버를 분리한다. 이 시스템은 그룹 A 연쇄상 구균 감염시 직접 접촉을 통해 발생할 수있는 응답을 제거하면서 유일하게 지속 분비 세균의 구성 요소에 기인 호스트 응답의 효과 평가를 위해 허용했다. SLS 외에 다른 분비 세균 요인 또한 다공성 막을 통과 할 수 있지만, 야생형 (WT)를 포함하는 동종 돌연변이 패널의 사용, SLS-KNockout (ΔsagA)와 사가 보완 변형 (ΔsagA + 사가)를 엄격하게 SLS 의존 ^(21)이다 호스트 응답의 정확한 평가를 할 수 있습니다.

유사한 투과 막 삽입 시스템 분비 바이러스 감염에 관여하는 인자의 암 생물학 및 면역 세포 이동 ^(22)의 연구에 이용되었지만, ^- 숙주 세포와 세균의 상호 작용을 포함하는 ^26, 몇몇 연구이 방법 ^6,27,28을 이용했다. 세균과 숙주 세포 사이의 상호 작용을 탐구하는 이러한 시스템을 채용 한 경우에도 연구는 주로 투과 막 삽입에 도금 상피 또는 내피 세포 단층을 통해 염증 세포 또는 박테리아의 이동에 초점을 맞추고있다. 본원에 기재된 투과성 막 삽입 계 감염 시스템은 EFFE을 평가하는 다공성 막을 통해 박테리아 숙주 세포의 분리에 의존하는 간단하고 효과적인 방법숙주 막 무결성 세포 생존, 세포 신호 전달 및 분비 숙주 세포 인자의 분비 독소 SLS의 CTS. 이 방법은 감염 과정에 걸쳐 특정 박테리아 인자의 역할을 조사하기 위해 포유 동물 숙주 세포 유형의 다양한 다른 분비 독성 인자의 연구에 적용 할 수있다.

프로토콜

1. 세균성 문화

1. 동종 변이주를 생성하는 관심 ^(21)의 특정 분비 인자의 연구에 사용될 수있다.
   참고 : 포함이 실험에 사용 된 GASM1T1 5448 균주를 WT GAS '는 사가 Δ 고양이 (Δ 사가 같은 텍스트로 약칭 함) SLS 결핍 돌연변이 및 사가 보완 변형 ²¹ (Δ 사가 + 사가로 텍스트로 약칭 함).
2. 관심의 박테리아 균주의 하룻밤 액체 문화를 준비합니다. 이전에 인간 세포를 감염에 16 ~ 20 시간 동안 37 ° C에서 가스 M1T1에게 토드 - 휴이트 국물의 -10 ml의에서 5448 균주를 성장.
3. 신선한 세균 배지에서 원심 분리기 밤새 박테리아 문화 (10 분 동안 2,400 RCF)과에 resuspend.
   주 : 동일한 볼륨에 재 부유를 밤새 문화가 (5 ~ 10 ㎖)에서 재배 된 바와 같이 일반적으로 바람직 초기 광학 밀도를 생성합니다.
4. 에 박테리아 문화를 정규화모든 균주 (OD 약 1.0 _(600)의 편의를 위해 권장) 시험 될 600 내지 (OD _600)에서 동일한 광학 밀도까지 추가의 세균 배지에 다시 현탁 배양 물을 희석하여 동일한 출발 농도가 얻어진다.
   주 :이 연구에서, 고정상 세균 배양 바로 다음 정규화 된 숙주 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. 그러나, 박테리아 출구 정지상 일부 균주 비동기 적으로는 이는 관심의 균주 경우가 발견되면 로그 상 문화와 호스트 감염을 시작하기 위해 더 적합 할 수있다.
5. 추가 분석에 앞서, 감염의 다중성 (MOI) 또는 숙주 세포 당 세균의 비율이 결정될 수 있도록 시작 배양에 밀리리터 본 당 집락 형성 단위 (CFU)를 결정하기 위해 분석을 세 콜로니를 수행한다.
   1. 1 ml의에게 소정의 광학 densi에 정규화 된 세균 배양의 연속 희석을 준비TY 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 적절한 박테리아 성장 배지 (토드 - 휴이 브로스는이 연구에서 사용 하였다). 가산 콜로니 (30-300 콜로니)와 아가 플레이트 중 적어도 하나의 세트를 생성하기 위하여 ^{10-1 10-6} 이르기 희석액을 준비. 세중의 모든 희석을 수행합니다.
   2. 세균 종에 적합한 매체를 포함하는 한천 플레이트가 분석되고에 각 시리얼 희석 100 μl를 전송합니다.
      주 : 토드 - 휴이 한천이 연구에 사용 하였다.
   3. 균일 한천 플레이트의 전체 표면에 걸쳐 100 μL 분취를 분배하고, 액체 한천에 흡수 될 때까지 계속 확산하는 유리 또는 플라스틱 박테리아 확산기를 사용한다. 멸균 기법을 사용하여 불꽃 하에서 수행한다.
   4. 하룻밤 또는 가산 식민지가 나타날 때까지 37 ° C에서 한천 플레이트를 품어.
   5. 각각의 접시에 성장 식민지를 계산하고 다음 formu에 의해 원래의 문화에서 CFU / ㎖를 계산라 : 식민지의 수는 밀리리터에 도금 용액을 희석 / 문화 볼륨의 역을 X.
      예를 들어 (200 식민지 X 1/10 ^-5 희석) / = 2.0 × 10 ⁸ CFU / ㎖ 도금 0.1 ml의

2. 호스트 세포 배양

1. 원하는 분석을위한 적절한 숙주 세포 라인을 얻습니다.
   참고 :는 HaCaT 인간 상피 각질 세포 ^(29), V. Nizet에서 일종의 선물은,이 연구에 사용되었다.
   1. 10 %의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM) (FBS)에서 100mm 문화 요리는 HaCaT 세포를 유지한다. 5 % CO _2와 37 ° C에서 품어.

투과 막 삽입 시스템 3. 숙주 세포 감염

1. 그들은 90 %의 포화 상태에 도달 할 때까지 적절한 조직 배양 접시에 플레이트 세포와 그들이 성장 할 수 있습니다.
   주 : 일반적으로 2-3 D에서 포화 상태에 도달이 연구에 사용 된 세포는 HaCaT도금 후 AYS.
   1. 해물 컬렉션의 경우 (예 : 분석 및 아데노신 삼인산 (ATP) 결정 분석 신호) / 웰 약 3 × 10 ⁵ 세포의 파종 밀도로 6 웰 요리는 HaCaT 세포를 접시.
   2. / 웰 약 3 × ¹⁰⁵ 세포 접종 밀도로 6 웰 접시 내 멸균 유리 커버 슬립에 면역 촬상 실험 플레이트 세포.
   3. 티듐 호모 다이머 막 permeabilization 및 젖산 탈수소 효소 (LDH) 분석법 분리 / 웰 약 5 × ¹⁰⁴ 세포 접종 밀도에서 24 웰 요리는 HaCaT 세포 접시.
2. 치료 직전에, 1 배 멸균 PBS로 세포를 씻어.
3. 세포에 신선한 성장 매체를 적용합니다. 여기에 설명 된 조건의 경우, 6 웰 플레이트 또는 24 웰 플레이트에 잘 당 0.5 ml의 매체 잘 당 2 ml의 매체를 적용합니다. 약물 치료가 테스트되는 경우, 새로운 배지와 혼합이 인트시에 적용피.
   참고 : 일부 분석은 대안 미디어가 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 페놀 레드와 높은 혈청 농도의 LDH 방출 분석을 방해 할 페놀 레드없는 DMEM 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) (w / v)를, 2 mM L- 글루타민으로 보충하고, 1 mM의 피루브산 나트륨이었다 이 실험에 이용.
4. 신선한 배지를 적용한 후에,주의 깊게 각각의 웰에 0.4 ㎛의 멸균 투과성 멤브레인 삽입물을 놓는다. 층류 후드에서이 단계를 수행하고, 각 웰에 투과 막 삽입을 전송 멸균 집게를 사용합니다.
5. 제조자의 지시에 따라 각 웰의 상부 챔버로 신선한 세포 배양 배지를 적용한다. 여기에 설명 된 조건의 경우, 6 웰 플레이트 또는 24 웰 플레이트에 잘 당 0.1 ml의 매체 웰 당 1 ml의 매체를 적용합니다.
6. 투과성 막 삽입 시스템의 상부 챔버로 정규화 세균 배양 (제 1 참조)의 적절한 양을 적용한다. 감염되지 않은 제어 방식에 대한 세균 매체를 사용하여올 트리트먼트. 여기에 설명 된 결과를 24 웰 플레이트에 대한 챔버 당 정규화 문화의 25 μl를 추가하고 6 웰 플레이트에 대한 챔버 당 문화의 100 μl를 추가합니다.
   주 :이 연구에서, 야생형 또는 돌연변이 GAS는 숙주 세포에 도포 10 MOI의 MOI 최종 진핵 세포 수에 기초하여 산출 하였다에서 (예를 들면 2 × ¹⁰⁶ 세포 / 웰) 10 배 많은 박테리아 감염 기간의 시작 부분 (예를 들어 2 개에 숙주 세포에 따라 첨가되도록, 물론 당 10 ⁷ CFU). 적절한 MOI는 다른 박테리아 종 원하는 후속 분석에 따라 달라집니다.
   주 : 비감염 컨트롤 가열 사망 또는 세균 비교 소비 박테리아 매체를 포함 할 수있다이 방법의 특정 응용을위한 다른 유용한 컨트롤 세균 배지를 사용하는 것 외에도.
7. 5 % CO _2와 37 ° C에서 감염된 세포를 품어.

4. 샘플 컬렉션

<올>

신중 멸균 집게 투과성 멤브레인 삽입물을 제거하여 분석하기위한 후속 손상 세포를 세포 배양 배지, 숙주 세포 용 해물, 또는 커버 글라스를 수집.

분비 호스트 Protiens 평가의 경우 :

1. 1.5 ml의 튜브에 하부 챔버에서 매체를 수집합니다. 를 수집하는 동안 단일 층을 방해하지 마십시오.
2. 4 ° C에서 10 분 14,000 RCF에서 원심 분리기 샘플은 세포 파편을 제거합니다.
3. -20 ° C에서 신선한 1.5 ML 튜브 및 저장소에 뜨는 50 μl를 제외하고 모두 제거하거나 즉시 사용할 수 있습니다.

호스트 셀 Lystates 평가의 경우 :

1. 부드럽게 숙주 세포를 단층 위에 배지를 흡인. 이 샘플 손실이 발생할 수 있으므로, 단일 층을 방해하지 마십시오.
2. 1X PBS로 한 번 세포를 씻어.
3. 부드럽게 PBS를 대기음. 즉시 원하는 단백질 농도를 달성하기 빙냉 용해 완충액의 적절한 양을 적용하여 부화15 분 동안 얼음에 샘플. 0.5와 1.5 ㎎ / ㎖ 사이의 단백질 농도를 달성하기 위해 200 ㎕를 각 6 웰 플레이트의 웰 당 용균 완충액 350 μL 사이에 적용된다.
   주 :이 연구에 사용 된 용해 완충액하는 것은 탈 이온수로 구성하고, 1 % (V / V)의 Nonidet P40 대용하는 포스파타제 억제제 칵테일, 및 프로테아제 억제제 칵테일. 특정 시약은 재료 및 장비 섹션에 나열되어 있습니다.
4. 각 웰의 판 표면으로부터 세포를 분리하는 셀 스크레이퍼를 사용하여 잘 1.5 ㎖의 튜브에 각각의 전체 내용을 피펫.
5. 원심 분리기 샘플을 4 ℃에서 20 분 동안 14,000 RCF에서.
6. 수용성 해물 구성 요소를 평가하기 위해, -20 ℃에서 신선한 튜브 및 저장소에 뜨는을 제거하거나 즉시 사용할 수 있습니다.
7. 핵 또는 기타 불용 해물 구성 요소를 평가하기 위해, -20 ℃에서 펠렛 및 저장을 예약 또는 즉시 사용할 수 있습니다.

면역 형광 이미징에 의해 평가의 경우 :

1. 같이해적 매체는 1 배 차가운 PBS에서 세포를 씻는다.
2. PBS에서 밤새 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액에 세포를 고정 (W / V).
   참고 :이 연구에서, PFA 1 ㎖를 각각 6 웰 플레이트의 웰 당 하였다.

5. 추천 응용 프로그램

1. SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅에 의해 신호 전달 분석 호스트
   1. 4.3 절에 설명 된대로 숙주 세포 용 해물을 수집합니다.
   2. bicinchoninic 산 (BCA) 분석 또는 동등하여 단백질 수준 ^(30)에 의해 각 시료 용 해물의 단백질 농도를 결정한다.
   3. 사전로드에와 4-15 %의 폴리 아크릴 아미드 겔 또는 적절한 대안 ^(31)에 샘플을 실행 샘플 간의 단백질 농도를 정상화.
      1. 샘플 량 - 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 각각의 시료 (20 μg의 예)의 동일한 단백질 양을 피펫 가변 용해 완충액의 양 (버퍼 량 = 총 부피를 첨가하여 시료의 농도를 정상화샘플들에 걸쳐 총 체적 (예를 들면 50 μL) 및 최종 단백질 농도에 상응하도록 각 튜브)를 첨가.
   4. 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인 (또는 동급)로 전송 샘플. 여기에 설명 된 결과를 추가로 45 분 동안 70 볼트의 전압을 증가시키기 전에 2 시간 동안 25 볼트에서 샘플을 전송합니다. 200 mM 트리스베이스, 1.5 M 글리신 및 탈 이온수 20 % 메탄올 (v / v)로 구성된 전송 버퍼를 사용합니다.
   5. 트리스 5 % BSA + 0.1 % 트윈 20 블럭 막은 식염수 (TBS)을 버퍼링. 항체가 사용하는 조정 따라서 제조업체 권장 사항에 따라.
   6. 밤새 4 ℃에서 일차 항체와 세포막을 품어. 제조 업체에서 사용 희석을 권장합니다.
   7. TBS + 0.1 % 트윈 20 1.5 시간 동안 세포막을 씻으십시오; 매일 10 ~ 15 분 버퍼를 새로 고칩니다.
   8. 방 temperat에서 1.5 시간 동안 5000 : 서양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)와 함께 인큐베이션 한의 희석 차 항체를 π 공역URE.
   9. TBS + 0.1 % 트윈 20 1.5 시간 동안 세포막을 씻으십시오; 15 분 - 매 10 버퍼 새로 고칩니다.
   10. 종래 제조업체의 지시에 따라 막에 화학 발광 현상을 검출 시약 막을 인큐베이션. 원하는대로 다른 검출 방법들이 사용될 수있다.
2. 숙주 세포 면역 형광 염색 및 이미지
   1. 4.4 절에 설명 된대로 숙주 세포가 포함 된 커버를 고정합니다.
   2. 세척 사이에 흡입, PFA 솔루션을 제거하고 PBS로 처리 된 세포 두 번 포함 된 커버를 씻는다.
      참고 : PFA는 매우 독성이 적절하게 처리해야합니다.
   3. 1 % PBS로 실온에서 2 시간을위한 커버 슬립을 차단 정상 염소 혈청 (/ V w), 2 % (v / v) 트리톤 X-100 및 0.5 % (v / v)의 트윈 20.
   4. 버퍼마다 10 분 새로 고침, 30 분 동안 PBS로 된 커버를 씻으십시오.
   5. 시 50 분 비율로 차 항체로 된 커버를 품어 (또는 제조업체에서 권장) 졸 차단에의 ution 밤새 4 ° C에서.
   6. (가) 30 분마다 버퍼 새로 고침, PBS에서 1.5 시간의 커버 슬립을 씻으십시오.
   7. 이차 항체를 실온에서 2 시간 동안 배양 한 커버 슬립 (염소 항 - 토끼 IgG를 AlexaFluor488이 연구에 사용 하였다)를 이용한 1 : 용액 차단 항체 (200)의 비율.
   8. 워시 버퍼마다 20 분 새로 고침, 1 시간 동안 커버 슬립.
   9. 원하는 얼룩을 적용합니다.
      참고 : 차단 솔루션에서 1,000 : DAPI (핵 염색) 1의 비율에서 로다 민 - 팔로이 딘 (액틴 얼룩을) 이용이 연구.
   10. 실온에서 30 분 동안 핵 및 굴지의 얼룩 된 커버를 품어.
   11. (가) 10 분마다 버퍼 상쾌하고 실온에서 30 분 동안 PBS로 커버 슬립을 씻는다.
   12. 설치 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 커버 슬립을 탑재합니다.
   13. 된 커버가 밀봉 및 이미징에 밤새 전에 슬라이드에 설정할 수 있습니다. 여기에 기재된 결과를 형광 현미경 USI의 이미지를 수집 할표준 20 배 목표를 ng를. 촬영 된 이미지를 처리​​하기 위해 ImageJ에와 현미경 이미징 소프트웨어를 사용합니다.
3. 에티 디움 호모 다이머 세포 죽음 분석
   1. 각이 잘 멸균 PBS로 두 번 세포를 씻어에서 대기음 매체.
   2. PBS에서 4 μM의 에티 디움 호모 다이머-1을 적용합니다.
   3. 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 세포를 인큐베이션.
   4. 528 nm의 여기 및 590 ㎚의 컷오프 값과 617 nm의 방출로 설정된 플레이트 판독기를 사용하여 형광의 레벨을 결정한다.
   5. 사포닌 (/ V w) 각 웰에 다음과 같은 초기 독서에 0.1 %를 추가하고 판은 동일한 설정에서 접시를 두 번 읽기 전에 (락)와 실온에서 추가로 20 분 동안 품어 할 수 있습니다.
   6. (포스트 사포닌)를 읽고 두 번째 형광하여 초기 형광 읽기 (후 처리)로 나누어 각 웰에 대해 개별적 %의 막 permeabilization을 결정합니다.
4. ATP 판별 분석
   1. 위의 4.3 절에 설명 된대로 해물를 수집합니다.
   2. BCA 분석 또는 유사한 ³⁰ 통해 해물에서의 단백질 농도를 정상화.
   3. 발광 기반 ATP 결정 키트 또는 제조업체의 지침에 따라 동등한를 사용하여 세포의 ATP 수준을 결정합니다.
   4. 해당 감염되지 않은 컨트롤 샘플을 처리 값을 정규화.
5. LDH 릴리스 분석
   1. 4.3 절에 설명 된대로 감염 후, 상층 액을 수집합니다.
   2. 제조업체의 지침에 따라 LDH 방출에 대한 세포 독성 검출 키트를 사용하여 LDH 자료를 평가합니다.

결과

분비 된 박테리아 인자의 연구 개발 투과 막 삽입 계 감염 시스템 프로토콜이 경우도이 시스템 분비 박테리아 인자의 효과를 평가하기 위해, 다공질 막을 통하여 세균 숙주 세포의 분리에 의존 1. 세밀 Streptolysin S (SLS) 등의 호스트 막 무결성 세포 생존, 세포 신호 전달 및 분비 숙주 세포 인자로서 숙주 반응에.이이 시스템은 접촉의 활성 변화를 평가하기 위해 사용될 수 있음을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯 데이터를 제공 도표 -independent 호스트 신호 단백질. 즉, 대표 데이터는 상당히 SLS GAS 생산 균주의 존재는 p38 MAPK의 활성화를 강화 나타낸다. 이 시스템은 또한 <면역 형광 현미경으로 숙주 단백질 국산화 박테리아 분비 인자의 효과를 (시각적으로 적용 할 수있다강한> 그림 3). 데이터는 활성화 ^21시 핵 세포질에서으로 전위 키 염증 매개체 핵 인자 카파 B (NFκB)의 SLS 종속 활성화를 보여줍니다. 도 2 및도 3의 결과는 모두 SLS 의존한다는 염증성 신호 전달 반응은 세균 숙주 세포 간의 직접적인 접촉을 필요로하지 않는 나타낸다. 이전 실험은 이미 증명 된 바와 같이 SLS 의존 P38 및 직접 감염 모델 ^(21), 투과 막 삽입 기반 시스템의 3 GAS 균주 중 P38 또는 NFκB 활성화 비슷한 수준에서 NFκB 활성화는 응답이 직접 접촉을 요구 것을 나타낼 것 박테리아 숙주 세포를 포함한다.도 4는이 시스템이 감염에 티듐 호모 다이머 및 LDH 방출 분석을 통해 숙주 세포 독성 독소 의존성 변화를 평가하기 위해 적용될 수 있다는 것을 보여준다. 이것은 상당한 증가의 난에 의해 입증된다막 permeabilization와 SLS 결핍 균주에 노출 된 감염되지 않은 세포 또는 세포에 비해 SLS를 포함하는 가스 균주에 노출 된 숙주 세포에서 LDH의 릴리스의 n은 모두. 심각한 영향이 12 시간 후 막 permeabilization의 경우 감염 및 LDH 방출의 경우 16 시간까지 분명하지로 세포 독성에 이러한 변경 사항은 즉시되지 않습니다. 대표 데이터가 이들 숙주 반응의 평가를 위해 적절한 시점 감염 조건 선택의 중요성을 나타낸다. 호스트 시그널링 변경 및 독성 평가를 허용 이외에, 투과 막 삽입 계 감염 시스템은 숙주 세포 용 해물의 세균 오염을 방지함으로써 그러한 호스트 ATP 수준의 정확한 결정과 같은 대사 변화의 연구에 적용 할 수있다 (도 5) . 이러한 데이터는 향상된 ATP 손실 감염을 게시 16시간 GAS 의한 감염에 반응하여 각화 세포 ATP의 상당한 감소를 보여준다 IN SLS의 존재. 이러한 결과는 호스트 스트레스 응답 시그널링 및 세포 독성의 관찰 독소 의존성 증가와 일치한다.

그림 1 : 다이어그램 침투성의 막 삽입 기반 감염 시스템 프로토콜은 호스트 세포에서 분비 세균 요인의 영향을 평가하는 인간의 각질 세포는 바닥 구획에 도금 및 90 %의 합류로 성장하고 있습니다.. 0.4 ㎛의 기공을 갖는 콜라겐 코팅 된 멤브레인은 상부 및 하부 챔버를 분리하고, 세균 감염이 원하는 기간 동안 투과 막 삽입 시스템의 상부 챔버에 첨가된다. 세포 배양 상층 액과 숙주 세포는 감염 기간 다음의 수집과 분석의 다양한 활용 될 수있다. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의.

그림 2. 투과성 막 삽입 기반 감염 시스템은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅에 의해 숙주 세포 용 해물 분석에 이용 될 수있는 대표적인 데이터 SLS 감염된 각질 형성 세포에서 P38의 MAPK 경로의 활성을 개선하는 것이 증명한다. (MOI = 10시) (A) HaCaTs은 투과 막 삽입 감염 시스템으로 7 시간 동안 GAS 감염시키고 해물 P38의 활성화를 평가 하였다. 3 개의 독립적 인 서양 오 점에서 (B) 비중계는 GAS'infection에 대한 응답으로 P38의 상대적 활성화를 정량화 하였다. 세 생물 복제의 평균 표준 편차를 나타내는 오차 막대로 표시됩니다. P38의 상대 활성화는 인산화 / 총 단백질 수준으로 표시됩니다. 통계적 유의성을 비교하여 결정 하였다감염되지 않은 세포. 전체 p- 값은 ANOVA (P = 0.0063)로 측정 하였다. 던넷 테스트는 의미 대응 감염되지 않은 컨트롤에 각 조건을 비교하는 사후 하였다. *, P = 0.01-0.05; **, P = 0.001-0.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, p <0.0001. 이 그림은 레어 외. 2015 ^21에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 :. 투과성 막 삽입 기반 감염 시스템 면역 형광 현미경에 의해 호스트 시그널링 변경의 시각화를위한 수 있습니다은 대표적인 데이터는 Streptolysin S가 NFκB의 활성화를 통해 염증성 신호 전달을 향상을 보여준다. 는 HaCaT 인간의 각질 세포는 M에서 GAS에 감염되었다 투과성 막 삽입 기반 감염 시스템을 사용하여 8 시간 동안 10 OI. NFκB의 (A 및 B) 핵 이행은 면역 영상화에 의해 평가 하였다. 핵 국부 세포의 비율은 NFκB는 주어진 필드에 대한 핵 세포질에서 전좌 했었던 셀의 수를 카운트하고, 동일한 필드에 대한 세포의 총 수에 의해 그 수를 나눔으로써 계산 하였다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. (A)는 세 가지 생물 복제의 평균 표준 편차를 나타내는 오차 막대 각 조건에 대해 표시됩니다. 전체 p- 값은 ANOVA에 의해 결정되었다; P <0.0001. 던넷 시험은 감염되지 않은 대응하는 제어 조건을 각 조건을 비교 하​​였다. *, P = 0.01-0.05; **, P = 0.001-0.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, p <0.0001. 이 수치는 레어 등. 2015 ^21에서 수정되었습니다./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4 :. 투과성 막 삽입 기반 감염 시스템은 박테리아 숙주 세포 간의 직접적인 접촉의 부재하에 세균 - 매개 멤브레인 Permeabilization 세포 독성의 측정을위한 허용은 대표 데이터는 각질 세포 생존 활성 SLS 독소의 존재가 감소 함을 입증 . GAS - 유도 된 세포 사멸은 WT의 존재는 HaCaT 세포에서 평가하고, SLS 결핍 또는 사가 GAS 보완 각질 10의 MOI (에 8-16 시간 동안 투과성 멤브레인 삽입물 계 감염 시스템을 사용하는 가스에 노출시켰다. A) 생존 티듐 호모 다이머 분석 또는 (B) LDH 방출 분석으로 평가 하였다. 두 패널에서, 3 재plicates는 평균과 오차 막대는 표준 편차를 나타낼 수 있습니다. 각 시점에 대한 유의성은 ANOVA (A) 8 시간, p = 0.0241에 의해 측정 하였다; 12 시간, p <0.0001 (B) 8 시간, P = 0.0287; 12 시간, P = 0.1977; 16 시간, P = 0.0031. 던넷 시험은 대응하는 시점에 대한 야생형 감염 각 조건에서 방법을 비교 하​​였다. *, P = 0.01-0.05; **, P = 0.001-0.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, p <0.0001. 이 그림은 레어 외. 2015 ^21에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 : 투과 막 삽입 기반 감염 시스템 BACT를 방지하여 호스트 ATP 수준의 정확한 측정을 허용합니다숙주 세포의 erial 오염은 해물. 대표 데이터는 그룹 A 연쇄상 구균 감염시 ATP의 SLS 의존 손실을 보여줍니다. 는 HaCaT 세포 투과성 멤브레인 삽입물 계 감염 시스템을 사용하여 8-16 시간 동안 가스로 감염시켰다. 기술 복제 (N = 3) 하나의 대표 생물 복제 (샘플 당 2 × 10 ⁶ 세포) 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께, 각각의 조건에 대해 평균되었다에서. 전체 페이지 값은 ANOVA에 의해 결정되었다 (12 시간, P <0.0001, 16 시간, p <0.0001). 던넷 시험은 대응하는 시점에 대한 야생형 감염 각 조건을 비교 하​​였다. *, P = 0.01-0.05; **, P = 0.001-0.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, p <0.0001. 이 그림은 레어 외. 2015 ^21에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기서 시험 관내 시스템에서 인간의 상피 각질 세포에 박테리아 독소 Streptolysin S의 효과를 조사하기 투석막 인서트 계 감염 시스템을 사용하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 다른 분비 박테리아 독성 인자의 연구뿐만 아니라 다른 숙주 세포 유형에 대해 적응 될 수있다. ^{3,8,18 - - (20)이} 최근에 개발 된 시스템은 정제 된 독소 또는 여과 박테리아 상층 액 ^1을 이용하여 실험 방법에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 투과성 막 삽입 기반 시스템은 최대 독소 활성이 유지 될 수 있도록이 생성되는 세포로 유치 관련 박테리아 독소를 일정하게 유지 용량을 제공하고, 또한, 실험 사이의 일관성을 증가시킨다. 또한,이 시스템은 더 가깝게 감염이 진행 분비 인자는 시간이 지남에 따라 누적있게되고 elimi으로 생리적 조건을 모방임의의 특정 독소 농도를 선택 할 필요가이 없습하는 숙주 세포에 적용 할 수 있습니다. 연구자들은 관심 박테리아 인자 접촉 의존적으로 숙주 세포에 전달되는지 여부를 평가하기 위해 또한, 본 시스템은 의미를 제공하는 것이다. 접촉 의존성은 종종 접착 또는 부착 방지 시약의 사용을 통해 동질 결핍 돌연변이 세균의 발생을 통해 테스트된다. 여기에 설명 된 시스템은 보완 또는 이러한 기존의 방법을 대체 할 수있는 간단한 대안을 제공한다.

프로토콜의 섹션 5에 기술 된 테스트 애플리케이션 외에, 다른 애플리케이션은 쉽게 적응 될 수있는이 감염 시스템은 사이토킨 어레이 및 ELISA 분석을위한 시료의 컬렉션을 포함한다. 두 경우 모두, LDH 방출 분석에 대해 기재 한 것과 유사한 프로토콜을 따라야한다. 여기에 도시되지 않았지만,이 시스템을 효율적으로 숙주 세포 샘플을 수집하기 위해 사용되어왔다유동 세포 계측법에 의해 nalyzed. 본 출원에서, 투과 막 인서트 감염 기간 후의 제거하고, 세포를 세포 배양 배지를 제거하는 세정하고, 트립신은 분석을 위해 세포를 수집 할 수 있도록 적용된다. 이렇게하지 ​​않으면 흐름 cytometer하여 정확한 셀 카운팅을 방해 할 수있는 접착 박테리아 숙주 세포로 이루어진 큰 응집체의 형성을 방지 할 수 있기 때문 숙주 세포에서 세균의 물리적 분리는이 애플리케이션에 특히 유용하다.

기존의 직접 감염 연구와 투과성 막 삽입 계 감염 실험의 결과를 비교했을 때 매우 일관된 호스트 응답이 관찰되었다하더라도, 이러한 숙주 반응의 반응 속도에 주목할만한 차이점은 ^21을 관찰 하였다. 예를 들어, 호스트 신호 및 멤브레인 기반의 세포 독성의 변화는 코르보다 투과 막 삽입 기반 감염 모델에서 발생하는 이상 30 % ~ 50 %을직접 감염 모델을 응답. 투과성 막 삽입 기반 시스템의 각 웰의 상부 및 하부 구획실에 적용되는 매체가 필요하기 때문에, 여기에서 설명 된 연구를 위해 개발 된 시스템은 잘 비교 당 직접 감염 모델은 이전에 사용 된 대응하는 총 배지 용적의 30 % 증가를 필요 ^21. 직접적인 접촉이 금지 될 때 세균 숙주 세포의 증가 된 거리와 결합 총 배지 용적의 차이는 아마 SLS가 숙주 세포에 도달하는 매체를 통해 확산 및 관찰 된 효과를 유도하는 데 걸리는 시간을 증가시킨다. 또한, 투과 막 삽입 기반 시스템은 세포 손상을 호스트에 기여할 가능성이 많은 가스 독성 인자를 제거한다; 이 시스템이 추가적인 요소의 부재는 또한 숙주 세포 사멸 및 직접 감염에 비하여 ²¹ 호스트 시그널링 이벤트의 개시의 지연에 기여할 것으로 예상된다. 이러한 요소가 고려되어야실험을 설계 할 때 기타 분비 박테리아 성분을 평가한다.

숙주 세포에서 분비 된 박테리아 인자의 효과를 테스트 권장 투과 막 삽입 계 감염 시스템의 어플리케이션마다 시점의 범위를 시험하기위한 가장 의미있는 조건을 식별한다. 이 조건이 관심있는 특정 독성 요소가 최적으로 성공적으로 그 효과를 관찰하기 위해 (특정 환경 신호에 응답하여 예를 들어, 로그 상, 정지상, 등) 생산 무엇에 따라 고려하는 것이 중요합니다. 호스트 시그널링 단백질의 변화를 평가 집중 실험에서는 SLS가 숙주 세포에 도달하는 시그널링 ^(21)을 변화를 유도하기에 충분한 양으로 제조 할 수 있도록 충분한 시간을 허용 시점을 선택하는 것이 필요했다. 동시에, 필요한 시그널링 호스트 변화의 평가는 이러한 효과가 C로, 종래 SLS 유도 막 permeabilization로 수행 될분석을 위해, 숙주 세포 용 해물의 컬렉션 omplicates. SLS에 의해 유도 된 세포 사멸 최적 몇 시간보고 시그널링 이벤트 ^(21)의 개시 이후에 모두 직접 투과 막 삽입 계 감염 모델에서 관찰 할 수있다. 또한, 관심있는 시점을 선택하는데, 이는 연구되고 박테리아 연구 기간 동안 상기 다공성 인서트 막을 투과 할 수없는 것을 보장하는 것이 중요하다. 연장 된 기간 동안 어떤 박테리아 성분의 제조는 막 완전성을 파괴 및 하부 구획실에 박테리아의 통과를 허용 할 수있다. 이러한 관심의 시스템에서 잠재적 인 문제인지 여부를 결정하기 위해 조사되는 균주는 시점의 범위에서 투과 막 삽입 기반 시스템의 상부 챔버에 적용될 수있다. 각 시점에서, 삽입 조심스럽게 제거 될 수 있고, 하부 챔버로부터 배지를 수집하고, 표준 콜로니 공동으로 사용될 수있다unting 분석 (섹션 1.5 참조). 더 콜로니 하부 구획에서 세포 배양 배지로 형성되지 않으면, 삽입 막을 효과적으로 테스트 시점 세균 부하에서 박테리아의 통과를 방지하는 것으로 간주 될 수있다.

박테리아 분비 인자의 효과적인 분석을 위해 최적화를 필요로 할 가능성이있는 다른 실험 설계 요소 감염 (MOI)의 다양성이다. MOI는 숙주 세포 당 세균 세포의 비율을 의미하며, 따라서 감염시 박테리아 집락 형성 단위의 수 (CFU)가 숙주 세포의 생장에 영향을 셀에인가된다. 이러한 연구에서, 각질 세포는 이러한 세포를 그대로 견고 연접과 응집력 단층을 형성 할 수 90 % 컨 플루 언시까지 성장시켰다. 연구하고자하는 숙주 세포의 생체 조직에의 배려 감염 실험에 적합한 포화 상태를 선택하는 것이 필요하다. appropr 번웰 당 판정 숙주 세포 늦었 수가 적합한 박테리아 CFU 산출 목적 MOI를 기반으로 할 수있다. 여기에 설명 된 연구에서, GAS 다른 박테리아 원하는 후속 분석에 따라 달라질 적절한 MOI 10의 MOI에서 숙주 세포에 적용 하였다. 낮은 시작 MOI는 일반적으로 더 생리 학적으로 관련 및 분명하다 숙주 세포의 생존에 극적인 변화하기 전에 숙주 세포 신호 전달의 미묘한 변화를 포착 할 천천히 충분히 축적 관심의 세균 계수 수 있습니다. 높은 MOIs는 세포 독성을 평가하는 많은 연구에 사용되지만,이 효과는 낮은 MOI로 시작 감염 긴 시간 동안 진행하게함으로써 달성 될 수있다. 모든 균주가 테스트 될 때까지 동종 변이체는 야생형 박테리아에 비해 변경된 성장을 지닐 수 있으므로, 광학 밀도가 필연적으로 정확한 CFU를 결정하는 것이 중요하고, 따라서 더 높거나 낮은 CFU가 웰 당 첨가 할 것을 요구할 수있다균주의 숙주 반응의 적절한 비교를 보장한다. 연구되는 포유 동물 숙주 세포는 세균을 죽이거나 그 성장을 억제 또는 균주 간의 비동기 성장이 의심되는 경우, 또한 감염 기간의 끝에 최종 세균 부하를 평가하기 위해 연구를 수행하는 것이 유용 할 수 할 수있는 경우. 이는 투과 인서트의 내용을 수집하는 절차의 섹션 1.5에서 설명 된 것과 유사한 콜로니 계수 분석을 수행함으로써 달성 될 수있다.

원하는 분석을 위해 적절한 크기의 웰을 선택하면 최적의 결과를 얻기 위해 중요하다. 투과 막 삽입은 다양한 크기에서 사용할 수 있지만 여기에 표시된 연구를위한 가장 일관된 결과 24 잘 6 잘 조직 배양 플레이트 용으로 설계된 인서트를 사용하여 관찰 하였다. 이 인서트 크기는 멸균 집게로 처리하기가 비교적 용이하고, 조작의 용이성 방지에 중요하다우물의 아래 칸에 상부 구획에서 박테리아의 불필요한 전송을 보내고. 숙주 세포 용 해물의 컬렉션을 포함하는 실험을 위해, 6 잘 요리는 대부분의 분석을위한 조건에 따라 적절한 세포 수를 제공하고 샘플 수집을위한 세포 스크레이퍼를 수용 할 수있을만큼 크다. 숙주 세포가 접착을 유지하고 (예를 들어, 에티 디움 호모 다이머 분석, 트립 판 블루 배제 분석법)를 플레이트 판독기로 측정 할 수있는 형광 colorometric 염료로 표지 된 세포 독성 분석에 대해 해당 인서트있는 24 웰 플레이트의 사용은 좋습니다. 세포 배양 배지를 수집하고 분석한다되는 실험 (예 LDH 방출 사이토 카인 연구) 용 중 24 작은 우물 일반적 이러한 분석에 적합한 양의 샘플을 제공하고 필요한의 사용을 최소화하지만 웰 또는 6 웰 플레이트가 사용될 수있다 시약. 전반적으로,이 방법은 다용도이며 SAMPL을 제조하기 위해 필요에 따라 적응 될 수있다수많은 후속 응용 프로그램 말이지.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt broth	Acumedia	7161A	Use appropriate broth for bacterial species of interest.
BioSpectrometer	Eppendorf	basic model	Any UV-Vis spectrophotometer is suitable.
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875713	Other brands are suitable.
Agar	Sigma	A1296-1kg	Other brands are suitable.
HaCaT human epithelial keratinocytes			Gift from lab of Victor Nizet.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11995-073	Use appropriate media for cell line of interest.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biowest	S162H	Use appropriate media additives for cell line of interest.
10 cm tissue culture dishes	Nunc	150350	Other brands are suitable.
6 well tissue culture dishes	CytoOne	cc7682-7506	Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
24 well tissue culture dishes	CytoOne	cc7682-7524	Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
Glass coverslips	Fisherbrand	12-541-B	These must be autoclaved prior to use for cell plating.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phenol Red Free DMEM	Life Technologies	31053028	Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100
L-glutamine	Gibco	25030149	Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Sodium pyruvate	Gibco	BP356100	Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (6 well)	Corning	3540
Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (24 well)	Corning	3595
Forceps	Fisher	3120018	These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts.
Cell scrapers	Fisherbrand	08-100-241	These are only required for the collection of cell lysates.
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	04042-500	TOXIC.  This is only required for immunofluorescence imaging.
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit	Pierce	23227	Other protein quantification assays may be used.
Tris-glycine 4 - 15% polyacrylamide gels	BioRad	4561083	Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest.
Electrophoresis cassette supplies	BioRad	1658063	Only required for Western Blotting.
Electrophoresis power supply	BioRad	1645050	Only required for Western Blotting.
Western blot transfer cassette	BioRad		Only required for Western Blotting.
Polyvinylidene (PVDF) Membrane	EMD Millipore	IPVH00010	Only required for Western Blotting.
Tween 20	Sigma	P1379-500ml
Rabbit IgG-HRP secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc2030	The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection.
Mouse IgG-HRP secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc2031	The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection.
Phospho-p38 (T180 + T182) MAPK antibody	Cell Signaling	4511	Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Total p38 MAPK antibody	Cell Signaling	8690	Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor 488	Molecular Probes	A-11034	Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection.
LumiGLO Detection Reagent	KPL	54-61-00	Only required for Western Blotting with detection on film.
Detection film	Biodot	BDB57	Only required for Western Blotting with detection on film.
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope	Nikon		Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses.
Normal goat serum	Thermo Scientific	31873
Triton X-100	Sigma	T9284-500mL
DAPI nuclear stain	Cell Signaling	4083	Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Rhodamine-phalloidin actin stain	Molecular Probes	R415	Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Only required for immunofluorescence imaging.
Ethidium homodimer 1	Molecular Probes	E1169	Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Spectramax M5 Microplate Reader	Molecular Devices		Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable.
Saponin	Sigma	47036-50G-F	Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Molecular Probes ATP Determination Kit	Life Technologies	A22066	Other kits are likely to be suitable.
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release	Roche	11644793001	Other kits are likely to be suitable.
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385-1L	Other suppliers are suitable.
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420B	Other cocktails are likely to be suitable.
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free	Sigma	S8830-2TAB	Other cocktails are likely to be suitable.