비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

요약

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

초록

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

서문

다세포 생물의 세포는 특정 세포에 대해 고유 될 적어도 세포의 고유 한 그룹에 속할 수 많은 개인 기능을 가지고 있습니다. 자신의 다양한 형태에 의해 입증도 배양 복제 된 세포는 각각의 특성을 보여줍니다. 또한, 셀의 개성이 분비 제품에 반영된다. 바이러스 감염의 경우, 바이러스 입자들을 생성 세포로부터 단백질을 수행 할 수있다. 예를 들어, HIV 많은 숙주 세포 단백질은 바이러스 외피에 포함되어 다른 셀들에 의해 생성 된 바이러스는 단백질 특성이 ^{1, 2} 또는 "셀 서명"을 운반 할 수있다.

심지어 감염없이, 세포는 주변 매체 작은 세포 외 소포 (전기 자동차)에 놓습니다. 이 소포 많은 경우에 그 구조의 생합성은, 바이러스의 특히 레트로 바이러스를 그 유사. 최근 몇 년 동안이 명백 해졌다초기 "혈소판 ^{먼지"(3)로} 간주 하였다 전기차는 세포 간 통신의 중요한 생리 학적 시스템을 구성하고있다. 함께 간 통신, 즉 세포 - 세포 접촉 상호 작용과 발표 수용성 분자의 두 개의 다른 시스템과, 전기 자동차 정상적인 생리를 조정하고 다양한 병리 바이러스 감염 ^{6, 7을} 포함, ^{4, 5로} 변경된다.

발표 바이러스 입자와 세포 외 소포 모두가 매우 다양하지만, 그들은 그들의 각각의 특성이 손실되는 대량 분석에 의해 주로 특징이다. 서로 다른 표면 항원에 기초하여 세포 표현형을 유세포 유사한 방법이, 각각의 바이러스 및 바이러스 - 유사 입자를 특성화하는데 필요하다. 불행히도, 전기 자동차 또는 작은 비리 표준 플로우 사이토을 사용하여 분석 할 수없는metry 방법은 대부분의 세포 계측기가 트리거 의존하는 광 산란 신호를 생성하기에는 너무 작기 때문이다. 이 한계를 회피하기 위해, 트리거 형광 적용 할 수있다. 전기 자동차 또는 비리가 형광 항체로 염색하는 경우 그러나, 그것은 때문에 비슷한 형광과 유사한 크기의 무료 항체 및 집계 구별하기가 어렵습니다.

최근에, 우리는 규칙적인 흐름 세포 계측기 ^{8, 9를} 사용하여 각각의 작은 입자에 항원의 특성을 가능하게하는 나노 기술 기반의 높은 처리량 방법을 개발했다. 다양한 어플리케이션 ^{10, 11, 12, 13} 다른 그룹에 의해 기술 된 바와 같이 우리가 관심 immunocapture 입자에 고용 MNPS; 그러나, 우리의 새로운 기술은 개별 정시의 캡처 할 수 있습니다FIC 대상 무료 부동 항체의 간섭없이, 빛의 산란이 아닌 트리거 형광을 사용하여 유동 세포 계측법에 의해이 캡처 된 입자의 표현형 하였다. 이 방법은 광범위한 응용을 가지며, 생체 내에서 세포에 의해 생성 된 viral- 비 바이러스 작은 입자의 항원 성 조성물을 특성화하는데 사용될 수 있고 체외 표면 항원에 대한 특이 항체를 형광의 가용성을 제공 하였다. 우리는 이미 여러 생물학적 문제를 연구하는이 기술을 적용했습니다.

특히, 우리는 각각의 HIV-1 입자 ⁹ 숙주 세포 마커의 분포를 평가, 우리는 그 표면 단백질 ^(14)의 분석에 기초하여 개개의 뎅기 바이러스 (DENV)의 성숙을 연구 건강한 지원자 및 환자의 혈류로 방출 전기차 조사 급성 관상 동맥 증후군 (ACS)와 함께. 유사한 원리에 기초하지만,새로운 기술의 적용은 아래에 설명되어 특정 프로토콜의 개발이 필요합니다.

프로토콜

자성 나노 입자의 1. 커플 링 (MNPS)

1. 상업 커플 링 절차 및 항체 (ABS)과 커플 MNPS에 시약 (일반적으로 1 mg)을 사용합니다. 카복실산 반응성기를 갖는 산화철 나노 입자가 사용된다.
   1. 항체는 부피 이상 0.5 ㎖의 경우, 100,000의 농축기를 이용하여 농축시킨다. 3 ~ 5 분 동안 2,000 XG에 스핀.
2. 프로 시저의 끝에서, 급냉 완충액 10 μl를 첨가 한 후, 12mm X 75mm 튜브 MNPS 전송 및 3 mL의 세척 / 저장 버퍼를 추가한다. 자기 분리기의 중심 구멍에 튜브를 넣고 4 ℃에서 하룻밤 둡니다.
3. MNPS 모두 튜브의 측면에 수집 한 후 신중하게 모든 액체를 피펫 있는지 확인합니다. 신선한 세척 / 저장 버퍼 3 ML을 추가, 다시 자석에 배치합니다.
4. 몇 시간 후, MNPS는 상기 튜브 측으로 수집되었는지 확인하고 액체를 피펫. 에 세척 / 저장 버퍼 2 ㎖를 사용하여MNPS을 재현 탁하고 4 ℃에서 저장한다.
5. (2 절에 설명 된대로 캡처를위한 마우스 단일 클론 순이를 사용하는 경우 예를 들어, 염소 항 - 마우스) 애비는 관련 형광 팹 항체 단편을 라벨에 의해 MNPS에 연결되어 있는지 확인하고 흐름 cytometer에서 실행됩니다.

MNPS에 결합 2. 라벨 항체

1. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 캡처 순이의 이소 특정 MNPS의 (조건에 따라) 60 μL (3.9 × 10 ⁽¹²⁾ 입자) 및 (200 μg의 / ㎖ 상용 솔루션의) 5 ㎕를 표시 Fab 단편을 결합합니다.
2. 계속 혼합하면서 30 분 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션.
3. 5 분 동안 1,500 XG에서의 microcentrifuge에 인산염 완충 식염수 (PBS)와 스핀의 300 μL와 10 만 집중을 사전 젖은.
4. 10 만 열 레이블이 단지를 정화. 200 ㎕의 PBS로 세척, 5 분 동안 1,500 XG에서의 microcentrifuge 단계 2.2에서 혼합물을 스핀, 그리고 회복초기 볼륨.

레이블이 AB-MNP 단지의 3.는 관심의 입자 (바이러스 또는 전기 자동차)를 캡처하기

1. HIV (60 μL) 또는 EV 준비 (100 μL)을 미리 표시 MNPS 60 μL (3.9 × 10 ⁽¹²⁾ 입자)를 품어.
   1. 다양한 방법을 사용하여 EV 준비를 준비합니다. 여기에, 자당 그라디언트에 전기 자동차를 정화 엑소 좀 침전 시약을 사용하여 혈소판 가난한 플라즈마에서 그들을 수집 또는 플라즈마에서 직접 분리 ^8.
      주 : 최적 비율은 각 실험에 대해 결정해야하고 준비 바이러스 / EV의 농도에 의존한다. MNP-Ab의 분율은 ~를 초과 10 ^{6 바이러스} / EV 분획의 농도와 비교해야한다.
2. 바이러스 부드러운 혼합 37 ° C에서 40 분, 또는 전기 자동차 4 ° C에서 1 시간을 품어.
3. , 된 Fc 부드럽게, 소용돌이 결합 차단 실온에서 3 ~ 5 분 부화 2.5 % 마우스 IgG의 / 인간 IgG를 추가합니다.
4. 각 검출 애비의 제조업체 권장 또는 역가 농도를 추가하고, 실온에서 추가로 20 분을 품어.

언 바운드 항체의 MNP-캡처 비리 (또는 전기 자동차가) 자기 열을 사용하여 4. 분리

1. 분리 자석에 배치하여 사용하기위한 자기 분리 컬럼을 준비합니다.
2. 세척 완충액 (2 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA), 0.5 % 소 혈청 알부민에 PBS (BSA)) 500 μL와 열을 사전 습윤. 세척 버퍼가 컬럼을 통해 흐르도록 허용한다.
3. 컬럼에 MNP 바이러스 / MNP-EV 단지를 추가하고 모든 액체가 흐를 수 있습니다. 전체 볼륨이 통과 할 수 있도록 컬럼에 세척 버퍼 500 μl를 추가합니다.
4. 세척 버퍼 2 회 이상으로 반복 세척.
5. 유지 된 MNP 바이러스 / MNP-EV 단지의 수집을위한 X 75mm 튜브 12mm 자석과 장소에서 열을 제거합니다. 열이 3 분의 자석 오프 튜브에 서 보자. PBS의 200 μl를 추가하자구슬은 PBS의 또 다른 200 μl를 추가, 중력에 의해 아래로 흘러 용출 후 200 ㎕를 4 % 파라 포름 알데히드로 고정한다.
   참고 : 파라 포름 알데히드는 발암 물질로 의심하고 통풍이 잘되는 후드에서 처리되어야하며, 장갑을 착용한다.
6. 하나의 비리를 정량화하기 / 전기 자동차는 높은 처리량 샘플러 (HTS) 또는 직전 취득 카운트 구슬 세포 계측법 잘 혼합 된 흐름을 추가에 체적 설정을 사용합니다.

MNPS-캡처 바이러스의 5 분석 / 플로우 사이토와 전기 자동차

1. 30 분 동안 유동 세포 계수기를 따뜻하게.
2. 실행 품질 관리 구슬.
3. MNPS 또는 라벨이 바이러스 / 전기 자동차 중 하나의 형광에 설정 임계 값. 배경 "노이즈"를 감소 임계 값에 대해 PBS 필터 0.22 μm의를 사용합니다. 이벤트를 필터링 PBS가 더 제공 여기서 레벨의 PMT 전압을 조정하여 임계 값을 설정하지 않거나 거의.
4. 낮에 실행 샘플. 합니다 (뒤에 직렬로 배치 칼집 유체에 대한 추가 0.04 μm의 인라인 필터를 사용하여표준 0.2 μm의 외장 필터 추가) 거짓 이벤트를 제거합니다.

캡처 효율 6. 평가

1. 3.1, 3.2에 기술 된 바와 같이 형광 표지 된 전기 자동차 또는 MNP-애비와 HIV를 캡처합니다. (전기 자동차는 막 염료 또는화물을 통해 중 하나를 표시 할 수 ^(15); HIV 유전자 부호화 염료 ^(16)를 통해 어느 표지 또는 막 염색 ^{12, 17)으로} 할 수있다.
2. (4.1-4.2)에 설명 된대로 자기 분리 컬럼을 준비합니다.
3. 컬럼에 MNP 바이러스 / MNP-EV 단지를 추가하고 모든 액체 (분수를 통해 흐름)를 통과 할 수 있습니다. 튜브 부분을 통해 흐름을 수집합니다.
4. (4.4-4.5)에 설명 된대로 열을 유지 비율을 진행합니다.
5. 이후 분리 (4.1-4.5)와 6.3에서 분수를 통해 흐름에 반복 캡처 절차.
6. 첫 번째 캘리포니아에서 유지 분수를 분석그 사이토을에 실행하여 pture와 두 번째 촬영은 전기 자동차 또는 HIV의 형광 라벨에 트리거에 설정되어 있습니다. 효율을 평가하기 위해, 두 분획의 이벤트의 수를 비교한다.

특정 작업에 대한 의정서 7. 적응

주의 : 전술 한 바와 같이, 프로토콜 DENV의 분석, HIV 및 전기차의 분석에 적용 할 수 있지만, 다음과 같은 변형이 도입되어야한다 :

1. RT에서 30 분 동안 어두운 데에서 1 μM DII와 비리 부화. 부화 후없이 브레이크와 4 ° C에서 1.5 시간 동안 240,000 XG에 밀도 구배 매체에서 원심 분리 (10 %, 20 %, 25 % 및 35 %)에 의해 스테인드 바이러스를 정화. 20 % 및 25 %의 밀도 구배 매질 층 ⁽¹⁴⁾ 사이에서 분획을 수집한다.
2. DII는 실온에서 20 분 동안 2.5 % 마우스의 IgG의 존재 검출 순이의 제조업체 권장 또는 역가 농도 DENV 1 × 10 ⁷ (60 μl를) 표시 품어.
3. Incub부드러운 혼합 37 ° C에서 40 분 동안 미리 라벨링 60 μL (3.9 × 10 ⁽¹²⁾ 입자) MNP 캡처 Ab의 복합체와의 혼합물을 먹었다.
4. 상기 한 바와 사이토 흐름 분석으로 자기 열에 언 바운드 애비에서 분리 된 결과 단지.

결과

HIV-1 비리에 의한 세포 항원의 선택적 캡처

"흐름 virometry"으로 개별 바이러스 입자에 휴대 항원을 시각화 할 수있게되었습니다. 예를 들어, 우리는 HIV-1, LFA-1 및 HLA-DR에 의해지지 개의 세포 항원에 초점을 맞추었다. 이전 두 항원 벌크 ⁽¹⁾ 분석 HIV-1 제제에 확인되었다. 우리는 MNPS가 봉투 HIV 단백질 VRC01에 대한 항체 중 하나와 결합하고, (말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 생성 된 HIV-1 _LAI.04 또는 HIV-1 _SF162)이 MNPS HIV-1 비리로 촬영 준비했다. 또한, 우리는 2G12, 다른 항 봉투 항체 이러한 비리 스테인드. 흐름 virometry은 LFA-1 및 HLA-DR의 존재에 대한 HIV-1 비리 높은 얼룩이 보였다. 평균 16.7 ± 2.0 %에서 (N = 6) 및 8.6 ± 0.3 % (N = 3) LFA-1과 HLA-DR 실시 HIV-1 _LAI.04 비리의,각기. 만 4.8 ± 0.6 % (N = 3) 모든 비리의 두 항원에 양성이었다. 다른 HIV-1 균주에서 HIV-1 _SF162,이 항원은 20.0 ± 4.4 %에 존재했다 (N = 6) 및 10.8 ± 1.3 % (N = 6) 각각 비리의 두 항원은 6.5 ±에 의해 수행되었다 반면, 0.4 % (그림 1).

세포 단백질의 분포는 바이러스 복제 세포에 의존적이었다. PBMC를 감염에 의해 생성 된 것과 상이한 항원 비리 생성 된 Jurkat 세포를 HIV가 감염. 된 Jurkat 세포에 의해 생성 된 HIV-1 비리 _{LAI 0.4} 1.6 ± 1.4 %를 수행 (N = 3) 1.6 ± 0.7 % (N = 4) LFA-1 및 HLA-DR 각각. 된 Jurkat 세포에서 생성 된 HIV-1 비리 _SF162, 이들 파라미터 (N = 4) 7.2 ± 2.5 % (N = 3) 5.6 ± 2.7 %였다. 따라서, (적어도 HLA-DR 및 LFA-1) 항원 메이크업은 HIV-1 _LAI.04 개의 상이한 세포에 의해 생성 달랐다유형 (P <0.02).

뎅기 바이러스 평가에 적용 virometry 흐름

DENV 성숙은 비리에 PRM 단백질의 발현과 관련된다. 우리는 성숙한 바이러스를 구성 BHK-1에서 제조 DENV의 어떤 부분과 LoVo 세포에서 평가하는 흐름 virometry을 적용했다. 비리는 지질 염료 DII으로 염색 하였다. 개별 캡처 비리의 분석은 48.2 ± 5.3 %에 PRM을 밝혀 (N = 8) DENVs의. 대조적으로, 84.5 ± 3.4 % (N = 4) DENV PRM의 실시 LoVo 세포에서 생성. 비리의 나머지 각각 51.8 ± 5.3 % (N = 8) 및 15.5 ± 3.4 % (N = 4)이었다 PRM 마이너스 (그림 2). 따라서, 유동 virometry 미숙 (또는 부분적으로 성숙) DENV 비리에서 완전히 성숙한 DENV 개인을 구별 할 수있다.

세포 외 소포 건강의 혈류로 방출급성 관상 동맥 증후군을 가진 자원 봉사자들과 환자 (ACS)

ACS와 건강한 환자에서 다른 EV의 하위 집합을 조사하기 위해, 우리는 형광 CD31, CD41a, 또는 CD63에 대한 항체와 MNPS 결합하여 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP)에서 전기 자동차를 붙 잡았다. CD31-MNPS에 의하여 촬영 된 전기 자동차는 CD41a-MNPS에 의하여 촬영 된 전기 자동차는 CD31과 CD63에 대한 염색, CD41a 및 CD63에 대한 염색 및 CD63-MNPS에 의하여 촬영 된 전기 자동차는 CD31 및 CD41a (그림 3)에 대한 염색 하였다.

ACS 환자에서 검출 항체의 하나 또는 두 개의 양성 CD31-MNPS 의해 캡처 전기차의 양은 3359 [2328이었다; 5472] 전기 자동차는 / 1272 [(714)에 비해 μL; 2157] 전기 자동차 / 건강한 지원자 (P = 0.001) μL. 건강한 지원자와 비교 ACS 환자에서 CD63에 의해 캡쳐 전기차의 총량은 3541 [1318이었다; 5173] 전기 자동차 / ㎕의 대 (806) [488] 2112] 전기 자동차 / μL (P = 0.007). 4752 [3238 있었다; 건강한 지원자의 플라즈마에이 숫자가 유의하게 낮았다 반면 7173] 전기 자동차는 /, CD41a-MNPS에 의해 캡처 ACS 환자의 혈장에서 2623 [1927을 μL; 4188] 전기 자동차 / μL (P = 0.015). 일반적으로, 우리의 결과는 EV 금액은 대부분 ACS 환자에서 증가하는 동안, 증가의 크기가 전기 자동차의 서로 다른 하위 집단에서 달랐다을 나타냅니다.

그림 1 : 서로 다른 세포 유형에 복제 HIV-1 비리의 세포 항원의 선택적 결합. PBMC를 나 된 Jurkat 세포에 의해 발표 HIV (HIV-1 _LAI.04 또는 HIV-1 _SF162) 비리는 VRC01-MNPS 캡처 및 제 항 gp120의 항체 2G12와 HLA-DR과 LFA-1에 대한 특이 항체로 염색 하였다. 염색 제제가 HLA-DR (흰색 막대)과 LFA-1 (검은 BA 대한 분석을 흐르게 하였다RS). 3 ~ 6 실험 ^(9)의 ± SEM을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : DENV의 비리의 성숙 상태입니다. 제조 DENV BHK-21 세포 (A, B) 또는 LoVo 세포 (C, D)에서 2H2 항체 (A, C) 나와 PRM 단백질에 대해 염색 밀도 구배 배지에서 초 원심 분리 한 후, 지질 염료 DII 표지되었고 이소 제어의 IgG2a (B, D)과. 표지 된 비리 온은 3H5-1-MNPS로 촬영 분석 ^(14)가 흐르도록 하였다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.

그림 3 : ACS 환자와 건강한 대조군에서 전기 자동차의 분석. 플라즈마 전기 자동차는 CD31-MNPS, CD63-MNPS 또는 CD41a-MNPS 캡처 및 CD31 및 CD41a에 대한 CD41a 및 CD63,에 대하여 각각 CD31 및 CD63, 대한 항체로 염색 하였다. 검출 복근 적어도 하나 물들 캡처 전기차는 시각과 유동 해석에 열거 하였다. 데이터는 중앙값과 사 분위 범위 (IQR)와 도트 플롯으로 제시했다. 녹색 기호 : 건강한 지원자 (컨트롤), 갈색 심볼 : ACS 환자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : Evaluati개별 비리를 나타내는 플로우 이벤트의 분획에. (A) HIV-1. 비리의 서스펜션은 두 부분으로 나누어 하나 DID (왼쪽 패널) 또는 DIO (중간 패널)로 염색 하였다. 혼합 한 후, 두 개의 차동 스테인드 비리 함유 현탁액, VRC01-MNPS로 캡처 virometry (오른쪽 패널)을 흐르게 하였다. 집계 (이중 색 이벤트) 전체 사건의 10 % 미만을 구성. (B - D) DENV. 1 : 2 : DII 묻은 비리의 서스펜션은 직렬 1에서 두 배 희석 한 256 및 유동 세포 계수기 (B)에 HTS에 인수했다. DII-DENVs가 2H2 항체 (C) 또는 DII-DENVs으로 표시 하였다는 3H5-1-MNPS (D)로 촬영했다. 1 : 2 : 준비 C와 D는 직렬 1에서 두 배 희석 한 256 및 HTS ^(14)에 인수했다. 비리가 모든 경우에 이후 집계하지 않는 것희석 인자 및 이벤트의 수 사이의 선형 관계이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 : 사이토의 흐름에 의한 단일 입자의 검출. 1 : 2 : DII 묻은 DENV 서스펜션 직렬 1에서 두 배 희석 2048 및 사이토 흐름 상에 HTS를 사용하여 인수했다. 희석 인자의 함수로서 검출 된 바이러스의 (A) 수. (B) 중간 형광 강도 (MFI) DII의는 DENV ^(14)을 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6 : 비리와 특이 항체에 결합 MNPS로 촬영 한 세포 외 소포의 비율의 평가. 레이블이 HIV-1 비리 또는 전기 자동차는 MNPS 특이 항체에 결합 virometry 흐름을 실시로 촬영되었다. 자기 열에 분리 한 후, 흐름을 통해은 (유지되지 않음) 분수 첫 번째 실행에서 누락 된 비리 또는 관심의 전기 자동차의 존재에 대해 분석 하였다. (A) 레이블이 HIV-1 _BAL의 비리는 2G12-MNPS (왼쪽 패널)로 촬영했다. 플로우 스루 분획을 수복하고 virometry (오른쪽 패널)을 흐르게 하였다. 첫 번째 사이클에 대한 관심의 비리의 약 95 %가 포착되었다. (B) 레이블이 전기 자동차는 항 CD81 MNPS로 촬영 및 자기 열 (왼쪽 패널)에 격리되었다. 플로우 스루 분획 다시 캡처 (우측 패널)을 분석 하였다. 처음에는관심있는 소포의주기 약 99 %가 ⁸ 붙 잡았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

종래의 유동 세포 계측기 개별 레벨 ^(18)에 물리적, 화학적 특성에 기초하여 세포를 분석하기위한 중요한 도구가 남아있다. 흐름의 기본 원리는 계측법 개발 이후 변경되지 않았 : 레이저 빔을 통과하여 빛을 산란 세포는 세포 - 결합 형광성 항체에 의해 방출 된 형광 스펙트럼의 기록을 트리거하는 이벤트를 구성한다. 그들은 대부분 ¹⁸ 광 수집하지 않습니다 사이토 흐름하는 더 큰 각도에 따라 더 많은 빛을 산란으로 300 나노 미터 아래 작은 입자는 사이토의 측면 산란에 의해 감지 할 수 없습니다. 여기에 설명 된 기술은 식별 및 형광 트리거링과 기존의 유동 세포 계측기에 의한 다수의 개별 바이러스 나 전기 자동차에 여러 항원의 분석을 할 수 있습니다.

프로토콜 내의 중요한 단계는 MNPS에 대한 항체의 결합이다. 우리의 실험은 perfor했다메드 반응성기를 카르 복실 산으로 15 nm의 산화철 나노 입자를 사용하는 것은 전술 한 바와 같이 ^9. 제조사에 따라, 각 15 nm의 MNP 20 항체에의 최대 결합 수있다; 우리는 약 15 nm의 MNP 당 10 항체를 결합한다. 이 추정은 이전 및 이후에 결합 된 항체의 양 및 나노 입자 특성 및 크기 조정 수단에 의해 측정 된 비드 / ㎖의 수에 기초한다. 원칙적으로, 커플 링은 입자의 응집을 일으켜 바람직하지 못하다있다. 그 집계가 우리의 프로토콜 발생하지 않습니다 확인하기 위해, 우리는 나노 입자의 특성 및 크기 조정 계기로이 문제를 확인했습니다. 이 악기는 코팅 및 항체 층이 아닌 만 15 나노 코어를 포함하는 입자의 유체 역학적 직경을 측정한다. 우리는 결합 구슬의 대부분이 단일 피크에있는 것을 (73 ± 7.3 nm의 아래에있는 모든 이벤트의 90 %와 64.7 ± 4.2 nm에서 피크를 의미) 발견했다. AB-MNP 공동의 혼합오른쪽 비례 비리 또는 전기 자동차와 mplexes는 MNPS가 전기 자동차 / 비리보다 몇 배의 농도에 매우 중요하다. 이것은 하나의 전기 자동차가 / 비리 분석되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 저 유량에서 사이토 실행하여 이벤트의 우연을 피하십시오. 형광의 포착을 트리거하고 캡처 엔티티의 농도를 측정 체적 컨트롤을 사용하여 확인.

그러나 MNPS는 가교하거나 같은 나노 입자에 두 개 이상의 비리의 결합에 의해 전기 자동차 나 비리를 집계 할 수 있습니다. 이를 확인하기 위해,도 4에 기재된 바와 같이 응집에 대한 테스트가 수행되어야한다. 비록 개별적으로 포착 비리 나 전기차 동시에 흐름 cytometer의 레이저 광을 입력 할 수있다. 이 두 개의 서로 다른 항원에 대한 거짓 양성을 만들 것입니다. 이를 방지하기 한 바와 같이 플로우 사이토 설정되어야하며, 제제는 희석한다. 하나는이를 사용하여 일치 일어나고 있는지 확인할 수이전 지점에 설명 된대로 전략. 또한, 일치의 부족 제제의 희석액을 분석 및 형광 염색 항원의 평균 형광 강도 모든 희석액 (도 5)에서 일정하게 유지하면서 이벤트 수가 희석 선형 적으로 감소하는 것이 증명에 의해 확인 될 수있다. 또 다른 문제는 너무 적은 바이러스 / 전기차가 포착 될 수 있다는 것이다. 이는 바이러스 /가 특정 MNPS에 의해 포착되는 항원을 수행하는 전기 자동차의 진정한 부족을 할 수 있습니다. 대안 적으로, 포획 효율은 다양한 원인 낮다 (예를 들어, MNPS,이 프로토콜을 위해 개발 된 비리 온 / 전기차에 MNPS의 비율로부터의 편차 등의 비효율적 항체 결합). 후자의 가능성을 방지하기 위해 캡처의 효율이 구체적으로 평가되어야한다. 전형적으로, 효율은도 6에서와 같이 약 90 %이어야한다.

다른 항체에 의한 방해 할 수 있습니다서로 또는 MNPS에 결합 된 항체와 입체 장해. 이 무료 부동 애비에서 이후의 분리와 AB-MNP 복합체에 의해 최초의 형광 검출 복근으로 염색해야 제 7 간단히, 비리 또는 전기 자동차에 설명하고 포착 역 캡처 프로토콜 (테스트해야합니다 발생하지 않았 음을 확인하려면 자기 열입니다.

흐름 virometry는 비리 또는 전기 자동차의 항원 성분의 분석 기존의 방법에 대하여 상당한 이점이있다. 일상적인 생화학 적 방법은 준비에서 특정 단백질의 일반적인 존재에 대해보고 있지만, 비리 또는 전기 자동차의 이질성에 관한 정보를 제공합니다. 이 대형 시중에서 판매하는 입자에 비리 또는 전기 자동차의 immunocapture을 포함한다. 이러한 입자는 직경이 수 미크론의 통상적으로 그들 각각은 비리 나 전기차의 수백 또는 수천을 포착 할 수있다. 따라서, 이후 분석 평균화 비리 / 전기 자동차의 특성하나의 입자에 의해 캡처. 대조적으로, 플로우 virometry 이벤트 중 적어도 90 %가 단일 비리 또는 단일 EV를 나타내는 직경과 설명 프로토콜 10-15 nm 인 MNPS를 사용한다.

주요 제한은 준비 비리 또는 전기 자동차의 전체 인구가 분석되지 않을 수 있다는 것입니다,하지만 그 포착되는. 따라서, 비리 나 전기차가 캡처되는 항원의 선택이 중요해진다. 또한, 다른 항원의 개수 (상이한 항원에 대한 형광 항체 수) 계측법 달리 흐름 비리 나 전기차의 작은면에 의해 제한된다. 마지막으로, 다른 항체를 입체적으로 인해 작은 (세포에 비하여) 표면에 다시 서로 간섭 할 수있다.

현재의 프로토콜들이 포착 될 수있는 특정 항체를 사용할 수 있는지, 어떠한 바이러스 나 원산지 EV 분석하도록 구성 될 수있다. 개인 비리 허가에 항원 분석의 연구자들은 바이러스 집단의 다른 분수의 발병을 해결합니다. 또한, 플라즈마에서 개별 전기 자동차의 식별이 가능한 특정 세포에 전기 자동차의 출처를 추적하고 정상 또는 병적이 세포의 조건들이 상주하는 기관에 대해보고 할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits	Ocean Nanotech	ICK-15-005
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane	Millipore	UFC810024
5 ml Round Bottom PP Test Tube, without Cap	Falcon	352002
DEPC treated water	Quality Biological	351-068-131
SuperMAG-01 magnetic separator	Ocean Nanotech	SuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	Z25055
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k	Pall Corp	OD100C34
EDTA 0.5 M	Corning Cellgro	46-034-CI
Bovine Serum Albumin solution	Sigma-Aldrich	A9576-50ML
PBS	Gibco	10010-23
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified	EMS	15710
123 count eBeads	eBioscience	01-1234-42
CytoCount beads	Dako	S2366
AccuCheck count beads	Invitrogen	PCB100
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST)	BD Bioscience	642412
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution	Thermo Fisher Scientific	V22885
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
µMACS column	Miltenyi Biotec	130-042-701
OctoMACS Separator magnet	Miltenyi Biotec	130-042-108
Nanodrop	ThermoFisher	none
NanoSight NS300	Malvern	none
BD LSRII flow cytometer	BD Bioscience	none
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Flowjo software	Flowjo
BD FACSDiva software	BD