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요약

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

초록

작은 엔도 좀 유래 엑소 좀 (EXOS, 직경 <100 ㎚) 및 대형 플라즈마 막 유래 마이크로 소포 (MV를, 직경> 100 ㎚)를 포함하는 세포 외 소포 (전기 자동차)의 방출은 모든 살아있는 세포에서 발생하는 근본적인 세포 과정이다. 원산지 자신의 휴대 및 시험 관내 연구에서 특정이 소포 수송 단백질, 지질 및 핵산은 세포 간 의사 소통의 매개체로 자신의 중요성을 강조했다. 전기차 성공적 다양한 체액으로부터 분리 된 혈액에서 특히 전기차 암 또는 감염성 질병에 대한 생체 유망한 것으로 확인되었다. 혈액 MV의 개체군 연구를 허용하기 위해, 우리는 말초 혈액에서 조작량의 표준 단리 및 특성화를위한 프로토콜을 제시한다. MV를 차동 원심 분리하여 EDTA-항 응고 혈장 샘플에서 펠렛 일반적으로 (100)의 직경을 가지고있다 - 600 nm의. 그들의 더 큰 크기로, 그들은 수쉽게 유동 세포 계측법, 정기적으로 임상 진단에 사용되는 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 기술에 의해 연구 될 수있다. 격리 된 MV의 품질 관리 분석을위한 여러 실시 예를 설명한다 혈액 다른 MV 개체군의 판정에 사용할 수있는 마커를 제공한다.

서문

지난 몇 년 동안 시험 관내 연구에 많은 세포 소낭은 EVS (는) 간 통신에있어서 중요한 역할을한다는 것을 보여 주었다. 살아있는 세포는 지속적으로 크기, 콘텐츠 및 생합성에 차이가 소포를 흘렸다. 가장 좋은 공부 전기 자동차는이 multivesicular 몸에서 관내 소포로 저장되는 위치 엔도 좀의 시스템에서 발생하는 엑소 좀 있습니다. 세포막과 후자 퓨즈되면 함유 소포는 엑소 좀으로 방출된다 (EXOS 직경이 30-100 nm 인 1). 세포막이 직접 오프 꽃 봉오리 - 지난 몇 년 동안 증가 관심을 얻고있다 EV의 두 번째 인구는 큰 마이크로 소포 (1,000 nm의 MV를, 직경 100)이다.

5, 이들이 인접하는 C로 전송할 수있는 단백질의 과다 - 소포 두 유형, 예를 들어, DNA, mRNA의 또는 miRNA의 3 지질 이중층에 의해 둘러싸인 핵산이 포함되어있다ELL 학생. 일반적으로 소포의 단백질 조성물은 원래 셀의 상태를 반영하면서, 일부 단백질은 선택적 타겟팅 및 전기 자동차 (1)에 농축 된 것으로 보인다. 주요 연구 관심은 신규 한 바이오 마커로서 전기차의 사용을 허용 할 수 특정 EV 서명을 정의하기 위해 이상 및 질병 세포로부터 전기차의 특성이다. 특히 종종 종양 자체가 쉽게 액세스하지 않는 암에서 혈액 종양 특이 전기차 타겟팅 액체 생검 치료 반응의 모니터링을 허용하거나 침습적 6 없이도 일차 종양 특성화 도울 것이다.

실제로, 전기 자동차는 이미 성공적으로 소변 7, CSF 8, 모유 (9) 또는 혈액 (10) 등 다양한 체액에서 분리되었다. 몇몇 연구는 다른 인간의 질병에 EV 계수의 변화와 구성을 확인했다. 예를 들어, 패혈증 환자 프로 응집제 조작량의 수이다상당히 건강한 사람 (11)에 비해 증가했다. 또한 심각한 뇌 말라리아 환자에서 혈중 총 조작량의 증가가 관찰 될 수 있고, 혈소판 유래 된 MV의 수는 코마 깊이 감소증 (12)과 상관 관계. 다른 연구는이 심혈 13,14 높은 확률과 상관, 전신성 홍 반성 루푸스 또는 심부전 환자에서, 후자의 경우는 내피 - 유래 소체의 상승 된 수치를보고한다.

특히 암, 혈액의 전기 자동차는 현재 진단 및 예후 가치와 새로운 바이오 마커로 설명합니다. 이러한 MUC1, EGFR 또는 FAK 같은 종양 관련 단백질을 발현하는 MV를의 수준은 유방암 환자 (15, 16)의 혈액에서 증가 할 것으로 보인다. 또한 EXOS를 들어, 최근의 연구는 Glypican-1 초기 질병 드를 허용 유방암 췌장암 또는 델-1과 같은 종양 특이 항원을 운반하는 혈액 유래 EXOS을 보여 주었다높은 특이성과 감도 (17, 18)와 tection. 게다가, 혈청 - 유래 종양 EXOS는 KRAS 및 치료 예측 19의 사용을 제안 p53과 같은 돌연변이의 검출에 사용할 수있는 DNA를 포함 할 수있다. 최근 진보는 특정 마이크로 유체 칩을 사용하여 아교 모세포종 환자의 혈액에서 EXOS의 분석 요법 (20)의 감시를 허용 보여 주었다. 함께 찍은, 이러한 결과는 소포의 질병 별 소집단의 분석은 진단, 예후뿐만 아니라 치료 옵션과 성공에 대한 유용한 정보를 제공하는 것을 의미한다.

그러나, 혈액 EXOS의 분리 및 분석은 시간 소모적이다 특별한 실험 장비를 필요로하기 때문에 아직 일상적인 임상 진단에 적합하지 않다. 대조적으로, 조작량은 EXOS (18)에 필요로 계측법 라텍스 비드에 결합을 할 필요없이 쉽게 흐르지 의해 분석 될 수 있고, 그들의 큰 크기에 훨씬 빨리 격리 될 수21. 따라서, 우리가 혈액 샘플의 조작량의 표준 단리 및 유동 세포 계측법에 의해 MV의 개체군의 후속 특성화에 사용될 수있는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 추가 연구와 일상적인 임상 진단을위한 MVS를 사용하기 위해 필요합니다 큰 환자 그룹의 MV 프로파일의 깊이 특성에 허용됩니다.

프로토콜

인간의 과목을 포함하여 모든 실험은 지역 윤리위원회 (승인없이. 3/2/14)에 의해 승인되었습니다. 환자의 선택을위한 그러한 성별, 나이, 현재 치료 요법 때문에 혈액 MV 조성물 영향과 수 많은 여러 요인 컬렉션 22,23 샘플링하기 전에 고려되어야한다는 것을 주목해야한다.

플라즈마 샘플 1. 준비

  1. EDTA (1.6 ㎎ / ㎖의 혈액을)를 포함하는 vacutainer 혈액 수집 튜브에 21 게이지 나비 바늘을 통해 기증자 당 혈액이 튜브 - 1을 그립니다. 효율적인 혈액 응고를 보장하기 위해 관 (들)을 여러 번 반전해야합니다.
    참고 : - 15 mL의 후속 유동 세포 계측법과 서양 얼룩 분석을위한 혈액의 권장 용량은 5입니다. MV 열화 및 손실을 방지하기 위하여 혈액 샘플을 30 분 혈액 회수 후에 <취급되어야한다.
  2. 1,200 XG에에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리하여 혈장 샘플을 준비실온 (RT).
  3. 혈액 세포 (= 하층) 잔류 플라즈마 (= 상층)의 분리를 돕기 위해 밸브 필터를 적용한다.
  4. 15 ㎖의 튜브에 플라즈마를 전송합니다.
  5. 1,500 XG에 15 분 동안 원심 분리, RT는 큰 세포 파편 펠렛 및 남은 혈소판을 제거합니다.
  6. 15 ㎖의 튜브에 뜨는을 전송하고 직접 -20 ° C에서 최대 6 개월 MV 격리 또는 저장 샘플을 진행합니다.
    주 : 제시된 프로토콜은 세포 배양 상청액에서 MV를 (그리고 EXOS)을 분리하는데 사용될 수있다. (24) 80 % 컨 플루 - -이를 위해, 60 ℃에서 세포를 배양 소포 고갈 FCS로 보충 된 배지에서 48 시간 후 상층 액을 수집한다. 750 XG에 5 분, 4 ° C를위한 원심 분리기, 잔류 떠있는 세포를 고갈 큰 세포 파편을 펠렛 1,500 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 다시 새로운 15 mL의 튜브와 원심 분리기에 뜨는을 채우기 위해. 이 상등액을 다음 조작량의 분리를 위해 사용될 수있다2.16 - 2.1 단계에 설명 된대로.

MV를 2. 분리

  1. 적절한 원심 관에 혈장 샘플을 옮긴다. 필요한 경우, 원심 분리 과정에서 박벽 관 붕괴 샘플을 희석 방지하기 위해 PBS로 관을 채운다.
  2. 14,000 XG, 4 ° C에서 35 분 동안 원심 분리기.
  3. 가만히 따르다 뜨는, 튜브가 거꾸로 서서 종이 타월에 넣어 보관하십시오. 나머지 상층 액은 수건에 적셔하여 샘플에서 제거 될 때까지 5 분 - 3를 기다립니다.
  4. 1000 μL PBS의 MV 펠렛을 재현 탁, 탁상 원심 분리기에서 14,000 XG, 4 ° C에서 35 분 동안 1.5 mL의 튜브와 원심 분리기에 전송합니다.
  5. 기음 뜨는.
  6. 펠렛의 크기에 따라, 500 μL PBS - 50에서 MV 펠렛을 재현 탁. 대안 적으로, RIPA 완충액 예를 Lyse 직접 MV를, (150 mM의 염화나트륨 / 0.1 % SDS / 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 - / 1 % 트리톤 X-100 / 50mM 트리스, pH를 7.2)이후 웨스턴 블롯 분석. -20 ° C에서 보관 MV를. 그들은 몇 달 동안 안정적으로 유지하지만, 반복 동결 - 해동 사이클을 방지 할 수 있습니다.
  7. 선택적 : MV 수율을 평가 또는 후속 실험 MVS를 투약하기 위해 단백질 분석과 MV 단백질 농도 (예를 들어, 브래드 포드 또는 로우리 법) 결정한다.
  8. 추가 EXOS 플라즈마 샘플에서 분리 될 경우, 110,000 XG, 4 ° C에서 2 시간에 대한 초 원심 분리 튜브와 원심 분리기로 단계 2.3에서 뜨는을 가만히 따르다. 단계 2.3에 설명 된대로 뜨는을 가만히 따르다, 1,000 μL PBS에 출 펠렛을 재현 탁하고 작은 (1.5 mL)을 초 원심 튜브에 전송합니다.
    1. 75 μL PBS 또는 RIPA 버퍼 - 50 110,000 XG, 4 ° C, 기음 뜨는 및 재현 탁 출 펠릿에서 2 시간 동안 초 원심 분리기.

유동 세포 계측법에 의해 MV를 3. 특성

  1. 이전 15 μL PBS + 1 % 소포 고갈 소 태아 혈청 (F유동 세포 계측법 튜브 CS).
    주 : 소포 고갈 된 FCS (24)는 이전에 설명 된 바와 같이 0.2 ㎛의 필터로 상청액을 110,000 XG에서 18 시간 동안 FCS (56 ° C에서 30 분) 열 - 불 활성화를 원심 분리 및 여과에 의해 제조된다.
  2. PBS에서 MV를 (3 μg의도 적용 할 수있는 낮은 수율의 경우) 5 μg의 추가.
  3. 조작량 표면에서 비특이적 결합 부위를 차단함으로써, 배경 얼룩을 감소시키기 위해 실온에서 30 분 동안 샘플을 인큐베이션.
  4. 단백질의 관심에 대해 형광 표지 된 항체를 추가합니다. 낮은 신호 - 대 - 잡음비를 최적 농도를 결정하고 보장하기 위하여 사용하기 전에 염색에 사용 된 항체의 양을 적정한다. 또한 음성 대조군으로 염색 MV를 하나의 튜브 (항체의 1 μg의 사용하는 경우 예를 들어, 또한 이소 제어 1 μg의를 사용하는 것과 동일한 농도로 일치하는 이소 타입 대조군 항체로 염색 MV를 하나 튜브를 포함해야합니다tibody) 배경 염색을 정량화한다.
    주 : 다른 형광 색소에 결합 된 다수의 항체를 첨가하여 세포 계측법 다색 플로우를 실행하는 것도 가능하다.
  5. 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 품어.
  6. 250 μL PBS를 추가하고 사이토 흐름을 사용하여 샘플의 측정을 진행합니다.
    1. 경우에 시료를 즉시 측정 할 수없는, 4 ° C에서 샘플 및 저장소를 해결하기 위해 150 μL PBS 50 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다. 주의 : PFA는 독성이다. 장갑과 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다.
  7. 가능한 최저 값으로 흐름 cytometer의 임계 값을 줄이고 로그 스케일의 측면 산란 (SSC) 플롯 대 앞으로 분산 형 (FSC)를 사용하여 MV 인구를 검색합니다. 뮤직 비디오 인구에 게이트 및 해당 히스토그램에서 형광 신호를 평가합니다.

웨스턴 블로 팅에 의해 MV를 4. 특성

  1. 에서 직접 MV 펠렛을 재현 탁적합한 용해 완충액 (예, RIPA 완충액).
    1. 적합한 용해 완충액 (예, RIPA 완충액)에서 1 : MV 펠릿 이미 PBS에 재현 탁 된 경우에, 그것을 적어도 1 희석.
  2. 로우리 분석법에 의해 MV 샘플의 단백질 농도는, 예를 결정.
  3. 22.5 μL RIPA 버퍼에 MV를 20 μg의 - (10)를 준비합니다. 그런 다음 95 ℃에서 5 분 동안 7.5 μL 배 램 믈리 로딩 버퍼와 열을 추가 할 수 있습니다.
  4. 폴리 아크릴 아미드 겔에로드 샘플 및 표준 프로토콜에 따라 전기 영동 및 면역를 수행합니다.
  5. 막에 단백질을 전송 한 후, 표준 프로토콜에 따라 부하 제어 등의 개양귀비 빛 염색을 수행합니다.
  6. 실온에서 5 분간 TBST에 Destain 막.
  7. TBST에서 5 % BSA에서 실온에서 최대 1 시간 30 분 동안 차단 막.
  8. 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 39 ° C에서 차 항체와 함께 막을 인큐베이션.
  9. TBST 3 × 5 분으로 막을 씻으십시오.
  10. 1의 희석에 HRP 결합 된 이차 항체와 멤브레인을 품어 : 10,000 5 %의 BSA를. 주 : 높은 배경 신호의 경우, 대신 BSA의 분유를 사용한다.
  11. TBST 3 배 5 분에 막 씻으십시오.
  12. ECL 검출 시약 막을 개발하고 화학 발광 필름 또는 화학 발광 이미징 시스템에서 신호를 검출한다.
    참고 EXOS에서 MVS를 구별하기 위해, 튜 불린 등의 단백질이 사용될 수있다 4 티닌 또는 mitofilin 주로 16,25 조작량에 존재해야한다. EXOS 마커로서 사용되는 대부분의 tetraspanin 항체 (예, CD9, CD81)은, 환원 조건에서 작동하지 않으며, 따라서, 70 ° C에서 10 분 동안 가열 하였다 비 환원성 로딩 완충액을 제조한다주의.

결과

전술 한 프로토콜에 따라 단리 될 수 조작량의 수율을 정량화하기 위해, 우리는 열 도너의 혈액으로부터 분리 된 MV의 양을 계산 하였다. 라 단백질 분석에서 평가 된 MV 수율은 mL의 혈액 당 19.2 μg의 MV를 (표 1)의 평균과 μg의 30까지 10에서였다. 나노 추적 분석 (NTA)에 의해 결정되는 입자의 농도가 1.66 × 109 mL의 플라즈마에서 샘플 당 5.9 × 109 입자 (표 2)의 평균이 2.36 × 106 (10)이었다. 투과 전자 현미경에 의한 MV를의 추가 특성은 지질 이중층에 의해 포위하고있는 세포 소기관 (그림 1A)를 포함하지 않은 직경> 100 nm의와 소포의 인구를 한 것으로 밝혀졌습니다. NTA는 절연 조작량의 크기가 600 나노 미터 (도 1b) 및 MV 평균 크기 100 원거리에서 확인되었다 201나노 미터 (도 1C). 웨스턴 블로 팅에 의한 전형적인 MV 및 출 마커 염색하면 격리 MVS가 tubulin에 양성이었고, EXOS는 튜 불린에 대한 부정적이었고, CD9 및 CD81 (그림 2) 풍부한 동안 만, CD9 및 CD81의 약간의 표현을 보여 주었다 보여 주었다.

유동 세포 계측법 (도 3a)에 의해 격리 된 MV의 분석은 일반적으로 세포 배양 상청액에서 분리 된 MV들에 사용 된 것과 동일한 파라미터를 이용하여 게이팅 될 수있는 정의 소낭 집단을 계시하고는 PBS의 측정에 의해 얻어진 배경 신호로부터 명확히 달랐다 + 1 %의 조작량 (도 3b)을 첨가하지 않은 FCS를 소포 고갈. 혈액 중에 존재하는 다른 MV 개체군을 분석하기 위해, MV들은 예 CD62P 혈소판 유래 MV를 들어, CD45, 백혈구 유래 MV를 들면, CD235a 들어, 다른 혈액 세포 집단 확립 마커 염색적혈구 내피 세포 유래 MV를 (그림 4)에 대한 MV를하고 CD62E을 세포 유래. 이 특성은 MV를 대부분의 모든 샘플에서 혈소판에 의해 흘릴 듯하면서 MV의 개체군의 비율은 조사 기증자의 혈액 샘플 사이에 차이가 있음을 보여 주었다.

figure-results-1382
그림 1 : 말초 혈액에서 분리 된 MV의 크기 분포. A, 격리 된 MV는 투과 전자 현미경에 의해 가시화 하였다. B, 소포의 크기 분포를 나타낸 조작량의 대표적인 나노 추적 분석 (NTA). C (10)로부터 독립적으로 제제의 평균 MV 크기 NTA (평균)을 측정 하였다. 알을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 arger 버전입니다.

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그림 2 : 웨스턴 블로 팅에 의해 고립 된 MV의 특성. 두 기증자로부터 격리 된 MV들과 EXOS에 차등 단백질 발현은 웨스턴 블로 팅에 의해 가시화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2336
그림 3 : 유동 세포 계측법에 의해 MV를 분석. A, MV를 먼저 각각의 MV 인구에 게이트에 sidescatter (SSC) 플롯 대 앞으로 (FSC)에 시각화된다. 그 후,이 MV를가 관심의 항원에 의한에 대한 특징 항원에 대해 지시 형광 표지 된 항체를 사용. B, 두 기증자의 혈장에서 분리 MV를위한 SSC 플롯 대 일반적인 FSC. 비교 만 PBS + 1 % 소포 고갈 조작량없이 FCS를 사용하여 세포 배양액뿐 아니라 음성 대조군으로부터 격리 A549 폐암 세포의 종양 세포 유래 MV를위한 전형적인 플롯은 오른쪽에 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3018
그림 4 : 유동 세포 계측법에 의해 고립 된 MV의 특성. 세 기증자 MV를 유동 세포 계측법에 의해 설립 된 혈액 세포 마커 (적색)의 발현을 특징으로 하였다. 각각의 아이소 타입 컨트롤은 회색으로 표시됩니다.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

견본 MVS / mL의 혈액 [μg의]
#1 29.4
# 2 10.3
#삼 15.2
# 4 31.1
# 5 18.8
# 6 22.7
# 7 19.1
# 8 18.7
# 9 15.0
# 10 11.9

표 1 : 말초 혈액 샘플에서 MV 단백질 수율. 표시됨 10 기증자에서 도출 된 mL의 말초 혈액 당 MV를의 양입니다. MV 수익률은 로리의 분석에 의해 정량화 하였다.

견본 MVS / ㎖의 혈장 [입자 수]
#1 6.42E + 09
# 2 2.36E + 10
#삼 1.88E + 09
# 4 6.51E + 09
# 5 3.48E + 09
# 6 4.57E + 09
# 7 2.09E + 09
# 8 1.66E + 09
# 9 2.54E + 09
# 10 6.20E + 09

표 2 : 말초 혈액 샘플에서 MV 입자 항복. MV 10 공여자 입자 계수는 나노 추적 분석에 의해 측정 하였다 혈장 샘플로부터 분리 하였다. 세 독립적 인 측정의 평균치가 도시.

토론

혈액에서 전기 자동차에 대한 최근의 연구는 EV 조성 및 계산은 여러 질병의 원인 중에 변경할 것을 증명하고있다. 따라서 이러한 전기 자동차의 분석 및 추가 특성 추가 진단 및 예후에 대한 질병 바이오 마커로서의 사용 가능성을 평가하거나 치료 반응을 평가하기 위해 높은 관심입니다. 우리가 여기에 제시 프로토콜은 모든 세포 소기관을 포함하지 않는 최대 600 nm의 직경 소포의 분리를 할 수 있습니다. 이러한 관측 된 MV의 현재의 정의에 부합하며, 세포 자멸 소체 (2)의 존재를 배제. 종종 엑소 마커로서 사용되는 tetraspanins CD9 및 CD81 발현 약간만 동안 웨스턴 블로 팅을 사용하여, 우리는 상기 격리 된 MV는 튜 불린의 높은 발현을 표시 함을 입증 할 수 있었다. 이 MVS가 EXOS 차이가 있음을 확인하고 프로테오믹스 (25)에 의해 최근 심도있는 특성 모두 EV 인구의 비교에 적합합니다.

혈액 샘플을 수집하는 동안 콘텐츠 ">는 MV 저하를 방지하기 위해 짧은 가능한 정맥 천자 혈장 제제 사이의 시간을 유지하기 위해 중요하다. 또한, 혈액 샘플의 장기간 보관이 향상 MV를 일으키는 혈액 세포의 활성화를 초래할 수도 궁극적으로 세포 사멸 기관의 발표 결과 세포 사멸을 발산합니다. MV 격리를위한 또 다른 중요한 고려 사항은 따라서, 아래로 회전 후 가능한 한 상층 액만큼을 제거하는 것이 중요하다. 혈장 단백질 이하 EXOS와 MV 준비의 오염을 방지하는 것입니다 펠렛 정상적으로 볼 단단히 튜브의 벽에 부착되어 있기 때문에 14,000 × g에서 조작량이. 상등액 용이 피펫 팁으로 제거 될 수있다. EXOS 달리 고속 초 원심 분리에 의해 제조시 응집체를 형성하는 경향이있는 자주 재현 탁하기 어려운이 문제가 MV를 발생하지 않습니다.

본 연구는 possi 것을 보여준다유동 세포 계측법에 의해 혈액에 존재하는 MV의 소집단의 특성에 상상력. 대부분의 유동 세포 계측기의 검출 한계는 200이지만 - 300 nm의 조작량이 재현 명확 배경 신호로부터 자신의 구별을 허용 동일한 분석 파라미터들 및 게이트들과 도너뿐만 아니라 세포 배양 샘플에서 측정 하였다. 이는 PBS가 유동 세포 계측법 (도 3) 중 높은 배경을 일으킬 수있는 오염 입자를 포함하지 않는 분석에 사용한 측정에 앞서 확인하는 것이 중요하다. 일부 작은 MV를가 유세포 방식에서 캡처되지 않을 수 있지만, 우리는 모든 주요 혈액 세포 집단 (예, 혈소판, 적혈구, 백혈구, 내피 세포)에서 MVS를 발견했습니다. 29 - 우리의 분석에서 우리는 이전에 MV를 26 일에 발견 된 다른 혈액 세포에 대한 표준 마커를 사용했다. 또한 주목해야한다, t 유동 세포 계측법에 의해 최적의 결과를 얻기 위해서는그 금액과 모든 항체의 농도는 관심의 항원을 발현하는 MV 샘플에 적정해야한다. 혈액에서 특정 MV의 소집단이 높은 특이성으로 식별되어야한다 경우, 각각의 MV를에 두 개의 서로 다른 항원 존재에 대해 이중 염색을 수행하고 이후 23 분석에만 모든 더블 긍정적 인 MVS를 고려하는 것이 가능하다. 현재 건강한 사람 23,30의 혈액에 MV의 개체군의 표준 범위를 정의하기위한 노력이있다. 이 연구는 이미 혈소판 유래 MVS가 우리의 관찰과 대응에 혈액의 MV를 가장 큰 인구를 구성하는 것으로 나타났습니다.

MV 샘플의 특성을 유동 세포 계측법의 하나의 장점은이 방법은 이미 잘 일상적인 임상 진단에서 바이오 마커 등의 MV를의 가능한 사용을 허용하는 대부분의 임상 센터에서 진단 목적으로 설립된다는 점이다. 주로 초점을 혈액에서 전기 자동차에 대한 이전의 연구작은 EXOS에 에드 선택적 원하는 엑소 목표 인구 (31, 32)를 분석하는 특정 분류 절차 중 하나에 의존하거나 분석 18 일 전에 비드 라텍스 EXOS의 커플 링 시간 소모적 (2 일) 분리 공정을 필요로한다. 우리의 관찰되지 않은 전혈 제제의 조작량의 유세포 분석은 심지어 그러한 선택 과정없이 종양 유래의 MV와 같은 조작량의 검출을 허용하는 것이 제안한다.

여기에 제시된 프로토콜은 표준 실험실 장비와 말초 혈액 샘플에서 MV를의 빠른 분리를 허용하고 그 이후의 특성은 유동 세포 계측법과 서양 블로 팅하여, 함께. 전체 프로세스는 질병 표지자로서 조작량의 전위를 평가하는 데 필요한 환자의 혈액 MV 프로파일에 미래 연구를 용이하게 약 2 시간 동안 수행 될 수있다.

공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.

The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
butterfly needle (21 gauge)Hospira Deutschland GmbH490P29201
Bovine serum albumin Fraction VRoth8076.3For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20
CD235a-PEBeckman CoulterA07792use 5 µl for staining
CD45-FITCBeckman Coulter7782use 5 µl for staining
CD62E-PEBiolegend336008use 0.8 µg for staining
CD62P-PEBiolegend304905use 0.1 µg for staining
CD81 antibodyBiolegend3495011:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
CD9 antibodyImmunotools212700911:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000Fujitsu Life Sciences
DC protein assay kit IIBio-Rad5000112
ECL detection reagentGE HealthcareRPN2232
EDTA vacutainers for blood collectionSarstedt01.1605.001
FACSCanto IIBD Biosciences
fetal calf serum (FCS)Invitrogen10091148heat-inactivated (30 min, 56 °C)
filter 0.22 µmSarstedt83.1826.001
HRP-coupled anti-mouse secondary antibodysanta cruzsc-2005use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibodysanta cruzsc-2004use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1RothK929.1
microfuge SIGMA 1-15KSigma Laborzentrifugen
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)BioRad170-6404
multifuge 3 L-RHeraeus
NanoSight LM10NanoSight Ltd.
PBS, w/o Ca and MgPan biotechP04-36500
perfusor syringe 50 mLBraun8728844F
Ponceau-S staining solutionPanReac AppliChemA2935,0500
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL)Beckman Coulter
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL)Beckman Coulter
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)BD Biosciences352054
tubes for ultracentrifugation (15 mL)Beckman Coulter344061
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)Beckman Coulter343778
Tubulin antibodyMillipore05-8291:5,000 in 5%BSA in TBST
ultracentrifuge Optima L-80 XPBeckman Coulter
ultracentrifuge TL-100Beckman Coulter
valve filter Seraplas V15Sarstedt53,428

참고문헌

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (0), (2015).
  3. Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
  4. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180(2011).
  5. Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
  6. Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
  7. Pisitkun, T., Shen, R. -F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  8. Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10(2009).
  9. Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
  10. Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  11. Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
  12. Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415(2010).
  13. Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
  14. Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
  15. Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
  16. Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
  17. Moon, P. -G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
  18. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
  19. Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
  20. Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
  21. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
  22. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2 (0), (2013).
  23. Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
  24. Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3 (0), (2014).
  25. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
  26. Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
  27. Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
  28. Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
  29. Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
  30. Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
  31. Rupp, A. -K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
  32. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).

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