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요약

이 연구는 제브라 피쉬에서 급성 및 만성 고혈당 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 목표는 구성 및 상해 유발 신경 발생과 같은 생리적 과정에 대한 고혈당의 영향을 조사하는 것입니다. 이 연구는 또한 PET / CT를 사용하여 방사성 동위 원소 표지 된 분자 (여기서는 [ 18 F] -FDG)를 따르는 제브라 피쉬의 사용을 강조합니다.

초록

고혈당은 심혈 관계 및 뇌 기능 장애로 이어지는 주요 건강 문제입니다. 예를 들어 뇌졸중 후 신경 학적 문제가 증가하고 신경 인성 과정을 손상시키는 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, 성인 제브라 피쉬는 고혈당 / 당뇨병을 모방하고 구성 적 및 재생성 신경 발생을 조사하기위한 관련적이고 유용한 모델로 최근 등장했습니다. 이 연구는 고혈당의 제브라 피쉬 (zebrafish) 모델을 개발하여 항상성 및 뇌 수복 조건 하에서 뇌 세포 증식에 ​​대한 고혈당의 영향을 탐구하는 방법을 제공합니다. 급성 고혈당증은 성인 제브라 피쉬에 D- ​​포도당 (2.5g / kg bodyweight)을 복강 내 주사하여 측정한다. 만성 고혈당증은 14 일 동안 물을 함유 한 D- 포도당 (111 mM)에 성인 제브라 피쉬를 담그면 유도됩니다. 혈당 수준 측정은 이러한 여러 접근법에 대해 설명됩니다. 구성 당뇨병에 대한 고혈당의 영향을 조사하는 방법뇌파의 기계적 손상을 기술하고, 뇌를 해부하고, 파라핀을 삽입하고, 마이크로톰으로 절편을 만들고, 면역 조직 화학 절차를 수행함으로써 재생 신경 발생을 입증합니다. 마지막으로, PET / CT를 사용하여 방사성 동위 원소 표지 된 분자 (여기서는 [ 18 F] -FDG)의 생체 분포를 연구하기위한 관련 모델로 제브라 피쉬를 사용하는 방법도 설명합니다.

서문

고혈당은 과도한 혈당 수준으로 정의됩니다. 급성 스트레스의 상황을 반영 할 수는 있지만, 고혈당은 또한 종종 인슐린 분비 및 / 또는 저항의 만성적 인 장애인 당뇨병의 진단으로 이어지는 상태입니다. 2016 년에 당뇨병으로 살고있는 성인의 수는 전 세계적으로 4 억 2200 만 명에 이르며 매년 150 만 명이이 질병으로 사망하여 심각한 건강 문제가됩니다 1 . 실제로 통제되지 않는 당뇨병은 심혈관 계, 신장 및 말초 및 중추 신경계에 영향을 미치는 몇 가지 생리 장애를 유발합니다.

흥미롭게도 급성 및 만성 고혈당증은 인지력을 변화시키고 치매와 우울증에 기여할 수 있습니다 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . 또한, 환자 w의 입학고혈당증은 허혈성 뇌졸중 7 , 8 , 9 , 10 , 11 후 기능적, 신경 학적 및 생존의 결과와 관련이있다. 또한 고혈당증 / 당뇨병은 신경 줄기 세포 활동과 신경 세포 분화, 이주 및 생존에 영향을줌으로써 성인 신경 발생, 새로운 신경 세포의 생성을 유도하는 과정에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다 2 , 12 .

포유류와 달리 zebrafish와 같은 원숭이 생선은 뇌 전체에 강력한 신경 인성 활동을 나타내며 성인 13 , 14 , 15 , 16 세 사이의 뇌 회복에 탁월한 능력을 나타냅니다. 주목할 만하게, 그런 수용량은 neu의 끈기 때문에 가능하다방사형 glia와 neuroblasts를 포함한 ral stem / progenitor 세포 17 , 18 , 19 . 또한, zebrafish는 최근 비만과 고혈당 / 당뇨병을 포함한 대사 장애를 연구하기위한 모델로 등장했습니다 20 , 21 , 22 .

제브라 피쉬가 고혈당증과 신경 발생의 잘 알려진 모델이지만, 고지혈증이 뇌의 항상성과인지 기능에 미치는 영향을 조사한 연구는 거의 없습니다 12 , 23 . 구성 및 상해 유도 된 뇌 세포 증식에 ​​대한 고혈당의 영향을 결정하기 위해 D- 포도당의 복강 내 주사를 통해 급성 고혈당 모델을 만들었다. 또한 만성 고혈당 모델은 생선을 물에 담그면 재현되었다.D- 포도당 12 . Zebrafish는 연구에서 많은 이점을 보입니다. 그들은 개발의 첫 번째 단계에서 싸고 쉽게 올릴 수 있으며 투명한 상태이며 게놈은 시퀀싱되어 있습니다. 이 연구의 맥락에서, 그들은 또한 다음과 같은 몇 가지 장점을 보여준다. (1) 인간과 비슷한 생리 학적 과정을 공유하여 생물 의학 연구에 중요한 도구가된다. (2) 뇌의 항상성과 신경 발생에 미치는 고혈당의 영향을 신속하게 조사 할 수있다. (3) 그들은 대안 모델이며, 연구에 사용 된 포유류의 수를 줄일 수있다. 마지막으로 zebrafish는 PET / CT를 사용하여 방사선 표지 된 분자 및 잠재적 치료제의 생체 분포를 테스트하기위한 모델로 사용할 수 있습니다.

다음 절차의 전반적인 목표는 zebrafish에서 급성 및 만성 고혈당 모델을 설정하는 방법을 시각적으로 문서화하고 zeb고지혈증 상태에서 뇌 리모델링을 평가하고 PET / CT를 사용하여 방사성 표지 분자 (여기서는 [ 18 F] -FDG)를 모니터링합니다.

프로토콜

성인 야생형 제브라 피쉬 ( Danio rerio )는 표준 광주 기 (14/10 시간 명 / 암흑) 및 온도 (28 ℃) 조건하에 유지되었다. 모든 실험은 프랑스 및 유럽 공동체 연구 동물 사용 가이드 라인 (86 / 609 / EEC 및 2010 / 63 / EU)에 따라 수행되었으며 동물 실험을 위해 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. Zebrafish에서 급성 고혈당의 모델 수립

  1. 트리 카인 400mg을 물 97.9mL와 1M Tris / HCl 완충액 (pH 9) 2.1mL에 녹여 트리 세인 (MS-222)의 원액을 조제한다. -20 ℃에서 보관을 위해 pH를 7로 조정하고 분액하십시오.
  2. 생식 수 (최종 트리 케인 농도 : 0.02 %) 100 mL에 트리 카인 (원액) 5 mL를 넣고 성인 제브라 피쉬의 마취제를 준비합니다.
  3. 그것이 움직일 때까지 하나의 제브라 피쉬 (3 개월에서 6 개월)를 탱크에서 마취제로 옮깁니다.
  4. 레절단 피펫을 사용하여 물고기를 이동하고 흡수성 티슈 페이퍼에서 신속하게 건조시킵니다.
  5. 물고기의 무게를 잰다.
  6. 1X PBS에 녹아있는 D- 글루코오스 주사기를 준비하고 D- 포도당 (2.5g / kg bodyweight) 50 μL를 주사하십시오.
    참고 : 예를 들어, 0.6g의 어류에는 50 %의 3 % D- 글루코스 / PBS 용액이 제공됩니다.
  7. 물고기를 등 뒤에 넣고 주사기의 바늘을 복강 내 구멍에 넣습니다.
  8. 천천히 D- 포도당 / PBS 용액을 주입 한 다음 물고기를 다시 물에 넣으십시오.
  9. 물고기가 완전히 회복 될 때까지 물고기를 확인하십시오. 혈당 측정을 수행하는 데 필요한 시간에 도달 할 때까지 탱크로 되돌립니다.
    참고 : 주사 후 1.5 시간에 혈당을 측정합니다.

2. Zebrafish에서 만성 고혈당 모델 구축

  1. 깨끗한 어류 용 물 2 L을 준비하십시오.
  2. D- 포도당 40g을 2L의 어류에 녹여 최종 D- 포도당 농도를111 mM.
  3. 5 ~ 7 마리의 성인 제브라 피쉬를 D- 글루코스 함유 물에 담근다.
  4. 박테리아 또는 다른 미생물의 번식을 피하기 위해 2 일마다 D- 포도당 어항을 교체하십시오.
  5. 14 일간의 치료 후 혈류량 측정 전에 D- 포도당을 몸 밖으로 제거하기 위해 담수에 잠깐 물고기를 놓으십시오.

3. Zebrafish의 혈당 수치 측정

  1. 빠른 안락사를 위해 얼음으로 물고기를가립니다.
    참고 : 과량의 트리 케어를 사용하지 마십시오. 혈당 수치의 변화가 심합니다. 물고기를 얼음에 너무 오랫동안 넣어 두지 마십시오. 혈액이 굳어지게됩니다.
  2. 흡수 티슈 페이퍼로 물고기를 닦아서 모든 물을 제거하고 혈당 측정 중에 혈액 희석을 피하십시오.
  3. 해부 포셉을 사용하여 눈을 제거하고 안구가 혈액으로 채워질 때까지 기다리십시오.
  4. glucometer에 테스트 스트립을 넣고 i스트립을 눈 구멍에 넣으십시오.
  5. 혈당치를 측정하십시오.

4. 고혈당 후 뇌 세포 증식 분석

  1. 솔루션 및 버퍼 : 요구 사항 및 준비
    1. 증류수 2 O (dH 2 O) 900 ML에 10X PBS 100 ML을 추가하여 1X PBS 1 L을 준비하고 섞는다.
    2. 0.2 % 세제 (PBS-T, 재료 표 참조)로 1x PBS를 준비합니다.
      참고 : 1L의 PBS-T를 준비하려면 1L의 PBS에 2mL의 세제 ( 재료 표 참조)를 넣으십시오.
    3. 에탄올 시리즈 (100 % x 2, 95 %, 85 %, 70 %, 50 %, 30 %)와 0.85 % NaCl을 준비하십시오.
    4. 차단 완충액을 준비하십시오 : 0.5 %에서 1 % 분유를 함유하는 PBS-T.
      참고 : 200 mL의 차단 완충제를 준비하려면 200 g의 PBST에 2 g의 분유를 넣으십시오.
    5. 항원 검색 버퍼, 시트르산 나트륨을 준비합니다.
      참고 : 1 L의 구연산 나트륨 완충액을 준비하려면 2.94 g의 구연산 나트륨 트리나트륨 염은 1 L의 dH 2 0으로 탈수한다. 1 L로 채우기 전에 pH를 6으로 조정한다.
    6. 1 % PBS 100 ML에 paraformaldehyde 4g을 추가하여 4 % paraformaldehyde - PBS 버퍼를 준비합니다. 완전히 녹일 때까지 58-60 ° C에서 교반하면서 따뜻하게합니다.
  2. 면역 조직 화학을위한 샘플 준비 : 고정 및 탈수
    1. 혈당치를 측정 한 후, 아가미 뒤의 머리 부분을 잘라서 머리를 몸에서 분리하십시오.
      참고 : 또는 뇌는 mRNA 추출과 같은 다른 실험을 위해 직접 추출 및 동결 될 수 있습니다.
    2. PBS (PFA - PBS)에 용해 4 % paraformaldehyde 4 ° C에서 밤새 머리를 수정.
    3. 다음날 PBS에서 머리를 간단히 씻어냅니다.
    4. 현미경을 사용하여 두뇌를 조심스럽게 해부하십시오. PBS로 고정 머리를 헹구고 해부 현미경으로 머리를 고정하는 바늘을 사용하십시오. 포셉으로 눈과 두개골의 꼭대기를 제거하십시오. Carefully 뇌를 추출하고 1x PBS에 넣으십시오.
    5. 1 분 PBS로 30 분 동안 0.85 % NaCl, 15 분 동안 70 % EtOH / 0.85 % NaCl (v / v), 15 분 동안 70 % EtOH (2 회), 20 분 동안 85 % EtOH 분, 95 % EtOH 20 분 및 100 % EtOH 20 분 (두 번). 최종 100 % EtOH 용액에서 밤새 품어 낸다.
      참고 : 탈수 된 뇌는 파라핀을 묻기 전에 4 ° C에서 100 % EtOH로 몇 개월 동안 머물 수 있습니다.
  3. 면역 조직 화학을위한 샘플 준비 : 파라핀 임베딩을위한 조직 준비
    1. 작은 유리 비이커에 두뇌를 놓습니다.
      참고 : 톨루엔이 일부 플라스틱을 손상시킬 수 있으므로 플라스틱 콘센트를 사용하지 마십시오.
    2. 뇌는 톨루엔으로 완전히 회수되어야하므로 에탄올을 제거하고 톨루엔으로 교체하십시오. 톨루엔으로 30 분간 2 번 목욕하십시오.
    3. 톨루엔을 제거하고 삽입 카세트에 두뇌를 놓습니다. 밀폐 된 카세트를 5 번에 녹은 파라핀 시리즈 비이커에 넣으십시오.8-60 ℃ (각 파라핀 비커에서 30 분). 예열 봉입 포셉을 켭니다. 파라핀 배스가 끝나면 카세트를 꺼내 일부 액체 파라핀을 주형에 부으십시오.
    4. 용융 된 파라핀을 곰팡이에 붓고 두뇌를 안으로 넣습니다. 두뇌의 전후 방향을 가이드로 사용하여 예열 봉입 포셉을 사용하여 두뇌를 동양화하십시오. 파라핀을 매설 기계의 냉각 부분에 경화시킵니다.
    5. 기술적 인 이유로 앞뒤 축을 따라 두뇌를 배치하십시오. 파라핀 블럭을 풀어 낸 후 카세트에 자르고 파라핀을 적당한 방향으로 넣고 횡단 절단을하도록합니다.
    6. 파라핀 블록을 마이크로톰의 팔에 삽입하십시오. 뇌 샘플 레벨에 도달 할 때까지 50 μm 두께의 섹션을 자릅니다. 공중 그네를 얻기 위해 파라핀 블록을 다듬고 절단 두께를 7 μm로 조정하십시오. 솔을 사용하여 파라핀 리본을 모아 검은 색 냅킨에 올려 놓습니다.어. 3 ~ 4 섹션마다 부드럽게 자르십시오.
    7. 온난화 판에 슬라이드를 올려 dH 2 O 물로 덮으십시오.
    8. 부드럽게 잘라 리본을 물 위에 놓습니다. 파라핀 리본이 충분히 펼쳐지거나 펼쳐지면 흡수 티슈 페이퍼로 물을 제거합니다. 마지막 방울을 기계적으로 제거하십시오. 슬라이드에서 물을 제거하고 약 30 ~ 40 ° C에서 가온 플레이트에서 3 시간 이상 건조시킵니다.
  4. 면역 조직 화학 요법
    1. 파라핀 왁스를 각각 7 분 동안 3 개의 크실렌 용기에 넣고 뽑아 낸다.
    2. 95 % EtOH, 85 % EtOH, 70 % EtOH 및 30 % EtOH를 각각 30 초 동안 욕조에 넣고 2 분 동안 100 % EtOH의 두 용기에 슬라이드를 넣고 절편을 보충하십시오. 마지막으로 간단히 슬라이드를 DH 2 O에 넣고 PBS로 두 번 5 분씩 두었다.
    3. 전자 레인지 (500 W에서 2 분)에서 구연산 완충액 중 섹션을 항온 처리하여 항원 검색을 수행하십시오.버퍼가 끓기 시작합니다. 슬라이드를 실온에서 15 분간 회복시킵니다.
    4. PBST에서 3 번씩 5 분씩 씻고 1 % 우유가 들어있는 PBST에서 45 분 동안 차단하십시오. 1 차 항체 (증식 성 세포 염색을 위해 증식하는 세포핵 항원 (PCNA); 1/100)을 완충액 ( 즉, PBST, 1 % 우유)으로 희석하여 밤새 배양하십시오.
    5. PBST에서 3 번씩 5 분씩 씻고, 블로킹 완충액과 DAPI (1/500)로 희석 한 적절한 2 차 항체 ( 예 : 염소 항 마우스 Alexa Fluor 488; 1/200)로 90 분 동안 절편을 배양하십시오.
    6. PBST로 5 분씩 3 번 씻고 슬라이드를 형광 장착 매질로 장착하십시오 (재료 표 참조).
    7. epifluorescence 및 / 또는 공 촛점 현미경을 사용하여 얼룩을 분석합니다.
    8. 적어도 세 가지 별개의 관심 영역의 적어도 세 연속 뇌 섹션에 뇌 세포의 확산을 계량imals.
      참고 : 또는, 뇌 embedding은 이전에 설명한대로 vibratome sectioning 및 자유 부동 immunohistochemistry로 진행하기 위해 아가로 오스에서 수행 할 수 있습니다.
  5. 고혈당이 뇌 회복 메커니즘에 미치는 영향 연구
    참고 : 이전에 설명한 24 , 25 , 26 번 과 같이 중뇌의 찔린 상처를 입은 후에 급성 및 만성 고혈당증에서 뇌의 수사를 수행 할 수 있습니다. 간단히:
    1. 성인 제브라 피쉬를 트리 세인으로 마취합니다.
    2. 빛과 해부 현미경에 물고기를 놓습니다.
    3. 한 손으로 물고기를 잡으십시오.
    4. 반면에, 30 G 주사기를 두개골을 통해 수직으로 오른쪽 뇌간 반구의 중간 영역에 삽입하십시오.
    5. 신선한 생선 수, D- 포도당 보충 수 (111mM), 어류를 조절할 수 있습니다. 물고기가 부상당한 후 7 일 동안 생존 할 수있게하십시오.
      참고 : 나머지 절차는 4 단계를 참조하십시오.

5. Zebrafish의 PET / CT에 의한 방사성 표지 분자의 생체 분포 관찰 : 포도당 대사를 분석하기위한 Fluorodeoxyglucose ([18F] -FDG)

  1. [18F] -FDG의 식염수 20 MBq을 함유 한 50 μL 주사기를 준비하십시오.
  2. 방사선 보호 스크린 뒤에 주사기를 놓습니다.
  3. 성인 제브라 피쉬를 트리 세인으로 마취합니다.
  4. 생선을 방사선 방호 스크린 뒤에 놓습니다.
  5. [18F] -FDG를 복막 내강에 주입하십시오. 생선 배 밖으로 누출 될 수있는 잔류 [18F] -FDG의 검출을 막기 위해 작은 티슈 페이퍼로 주사 부위를 닦으십시오.
  6. 방사성 동위 원소 보정기를 사용하여 주사기와 조직에 포함 된 남아있는 활동을 측정하여 정확한 주입 선량을 계산하십시오.
  7. 물고기를ew, tricaine에 적신 흡수성 조직의 작은 조각을 부드럽게 감싼다. 흡수 조직과 함께 물고기를 PET / CT 이미 저의 침대에 놓습니다.
  8. PET / CT 영상 시스템에 침대를 삽입하고 수집을 시작합니다.
  9. PET / CT 획득을 계속하십시오.
  10. 절차가 끝나면 물고기를 신선한 양의 물에 다시 넣으십시오.
    참고 : [18F] -FDG 주사 후 물고기를 PET에 다시 한번 마취시키기 전에 [18F] -FDG의 확산을 촉진하기 위해 10 분에서 1 시간 동안 소량의 담수에 넣을 수 있습니다. / CT 영상.

결과

이 기사에 설명 된 절차를 사용하여 성인 제브라 피쉬에서 D- 포도당 (2.5 g / kg bodyweight) 복강 내 주입을 실시하고 주입 1.5 시간 후 혈당 수치가 유의하게 증가했습니다 ( 그림 1A ). 주사 후 24 시간에 D- 글루코오스와 PBS를 주사 한 어류 간에는 혈당치가 비슷 하였다. 만성 치료를 위해, 제브라 피쉬는 D- 포도당 물 (111 mM)에 담갔다가 치료 14 일 (

토론

이 연구는 제브라 피쉬에서 고혈당의 급성 및 만성 모델을 수립하는 다양한 방법을 설명합니다. 이 절차의 주요 이점은 다음과 같다 : (1) 연구에 사용 된 포유류 수의 감소, (2) 설치가 쉽고 신속한 구현, (3) 경제적이다. 따라서 그러한 모델은 죽상 혈전증, 심혈 관계 기능 이상, 망막 병증, 혈액 뇌 장벽 누출, 구성 적 및 재생성 신경 발생을 비롯한 여러 생리 학적 과정에 미치는 영향을 연구하기 위...

공개

잠재적 이해 상충은 공개되지 않았다.

감사의 말

우리는 비디오 편집 (특히 Jean-François Février, Eric Esnault, Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan (보이스 오버), Mary Osborne-Pellegrin (교정)에 대한 La RUunion University의 Direction des Usages du Numérique (DUN) 음성 해설 및 사이로 (CYROI) 플랫폼. 이 작품은 La RUunion University (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), Conseil Régional de La Réunion, 유럽 연합 (CPER / FEDER) 및 Philancia 협회의 교부금으로 지원되었습니다. ACD는 La Réunion University (Contrat Doctoral)의 국장급 인 Supérieur et de la Recherche의 교육부 장관으로부터 교부금을 수여 받는다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1mL Luer-Lok SyringeBD, USA309628
4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-Aldrich, GermanyD8417
7 mL bijou container plain labDutscher, France080171
D-glucoseSigma-Aldrich, Germany67021
Digital cameraLife Sciences, JapanHamamatsu ORCA-ER
Disposable base molds Simport, CanadaM475-2
Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488Life Technologies, USAA21206
Embedding centerThermo Scientific, USAShandon Histocentre 3
Fluorescence microscopeNikon, JapanEclipse 80i
Fluorodeoxyglucose (18F-FDG)Cyclotron, France
Glucometer test stripLifeScan, FranceOne-Touch 143 Ultra
Goat anti-mouse Alexa fluor 594Life Technologies, USAA11005
In-Vivo Imaging SystemTriFoil Imaging, CanadaTriumph Trimodality 
MicrotomeThermo Scientific, USAMicrom HM 355 S
Monoclonal mouse anti-PCNADAKO, USAclone PC10
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich, GermanyP6148-500G
Polyclonal rabbit anti-GFAPDAKO, USAZ033429
Slide drying benchElectrothermal, USAMH6616
Sodium chlorideSigma-Aldrich, GermanyS9888
Sodium citrate trisodium salt dehydrate Prolabo, France27833.294
Sterile needleBD Microlance 330 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm
Student Dumont #5 ForcepsFine Science Tools91150-20
Student surgical scissorsFine Science Tools91400-14
Superfros Plus Gold SlidesThermo Scientific, USAFT4981GLPLUS
Surgical microscopeLeica, FranceM320-F12
Tissue embedding cassettesSimport, CanadaM490-10
Tissue embedding mediumLeicaBiosystems, USA39602004
TolueneSigma-Aldrich, Germany244511
Tricaine MS-222Sigma-Aldrich, GermanyA5040
Triton X100Sigma-Aldrich, GermanyX100-500 mL
Vectashield medium Vector Laboratories, USAH-1000
XyleneSigma-Aldrich, Germany534056
Fish StrainAB
Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter)For preparing 10X PBS, add the following  salts and complete to 1 liter with distilled water
Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 gSigma-Aldrich, Germany746436
Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40gSigma-Aldrich, Germany795488
Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g Sigma-Aldrich, GermanyS9888
Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 gSigma-Aldrich, Germany795410

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