정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

요약

여기 우리는 양적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 microRNA 표현의 탐지 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는데 적합합니다.

초록

MicroRNAs (miRNAs)는 전사 후 사슬 RNA 발현을 조절하는 작은 비 암호화 RNA입니다. miRNA 발현 프로파일은 쥐의 다양한 기관과 조직에서 조사되었습니다. 그러나, miRNA의 정제 및 쥐 복막에서의 발현 검출을위한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다. 우리는 랫트 복막에서 정량적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 이용하여 miRNA를 정제하고 정량화하는 효과적이고 신뢰성있는 방법을 개발했다. 이 프로토콜은 4 단계로 구성되어 있습니다 : 1) 복막 샘플의 정화; 2) 복막 막 시료로부터의 miRNA를 포함하는 전체 RNA의 정제; 3) cDNA를 생산하기위한 miRNA의 역전사; 및 4) miRNA 발현을 검출하기위한 qRT-PCR. 이 프로토콜을 사용하여 6 개의 miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p)의 발현이 증가한 것을 성공적으로 확인했습니다.쥐 복막 섬유증 모델의 복막이 대조군에 비해 유의하게 높았다. 이 프로토콜은 많은 병리학 조건에서 쥐의 복막에서 miRNA 표현의 프로필을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

MicroRNAs (miRNAs)는 전 사적으로 mRNA (messenger RNA) 발현을 조절하는 짧은 비 암호화 RNA입니다. miRNA의 발현 변화는 암, 염증, 대사 장애 및 섬유증 ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8을} 비롯한 다양한 병리학 적 조건에서 중추적 인 역할을하는 많은 mRNA의 발현을 조절합니다. 따라서 miRNA는 새로운 바이오 마커 및 치료 표적 ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} 로 잠재력이 있습니다. miRNA 발현 프로파일은 다양한 래트에서 결정되었다간, 심장, 폐 및 신장을 포함한 장기 및 조직 ⁹ . 그러나, 랫 복막에서 miRNA의 정제 및 검출에 대한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다.

이 프로토콜의 전체 목표는 성공적으로 쥐의 복막에 miRNAs을 정화하고 감지하는 것입니다. 먼저, 유리 호 모지 나이저를 사용하여 복막 막 샘플을 균질화시킨 다음, 미세 원심 분리기 스핀 컬럼 ¹⁰ 에서 생체 고분자 파쇄 시스템에 노출시켰다. 다음으로, 실리카 막 기반 스핀 컬럼 ^10을 이용하여 복막 샘플로부터 miRNA를 포함한 total RNA를 정제 하였다. 이어서 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머 ^11을 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. 마지막으로, 삽입 염료 ^11을 사용하여 qRT-PCR에 의해 miRNA의 발현을 측정 하였다. 이 프로토콜의 이론적 근거는 b이전 연구에서 단순한 과정으로 조직에서 miRNA의 유의 한 정화 및 검출을 보여주었습니다 ^{8 , 10 , 11} . 미세 원심 분리기 스핀 컬럼과 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에서 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하면 조직에서 고품질의 총 RNA를 정제 할 수 있다고보고되었습니다. 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머를 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하는 방법 및이 프로토콜에서 인터 칼 레이팅 염료를 사용하는 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현을 검출하는 방법이 높은 정확성을 보인 것으로보고되었다. 감도 ¹¹ . 또한이 작업은 시간을 절약하고 기술적 오류를 방지하는 간단한 프로세스입니다. 따라서이 프로토콜은 광범위한 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 miRNA의 매우 정확하고 민감한 검출을 필요로하는 연구에 유용합니다.

프로토콜

모든 동물 실험 프로토콜은 Jichi Medical University의 동물 윤리위원회의 승인을 얻었으며 Jichi Medical University Laboratory Animals 안내서의 Experimental Animals Use and Care of Animals 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 복막 샘플 수집

1. 다음 품목을 수집하십시오 : isoflurane, 코르크 시트, 인산염 완충 식염수 (PBS), 수술 가위 및 포 셉과 페트리 접시에 흠뻑 목화와 50 ML 원심 분리기 튜브.
2. Isofluorane의 과다 복용으로 쥐를 안락사시키고, 70 % 에탄올로 쥐의 복부 피부를 스프레이하고, 뒤에 코르크 시트에 쥐를 탑재.
3. 가위와 포셉을 사용하여 복부 피부, 근육 및 복막에 세로 절개를하십시오.
4. 포 셉를 사용하여 복막을 집어 들고, 다이어프램 아래의 가장 낮은 늑골을 따라 그 상단 부분에 수평 절개를하고,외과 용 가위를 사용하여 옆쪽 영역에있는 오우리어 쪽. 다음으로 외과 용 가위를 사용하여 몸에서 복막을 제거하기 위해 세로로 절개하십시오. 그런 다음 페트리 접시에 PBS로 씻으십시오.
5. 외과 용 가위 및 집게를 사용하여 다음 단계에 적합한 크기 인 복막 막 샘플 20mg (3 ~ 5mm ² )을 잘라내어 다듬습니다.

2. 복막 막 샘플로부터 전체 RNA 정제

참고 : 여기에 무게가 20mg 인 복막 샘플을 유리 호 모지 나이저 및 미세 원심 분리기 스핀 컬럼에서 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하여 균질화합니다. 그런 다음 복막 막 샘플의 총 RNA를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 사용하여 분리합니다.

1. 다음 항목을 수집하십시오 : 1.5 또는 2.0 ML microcentrifuge 튜브, 100 % 에탄올, 클로로포름, 유리 호 모지 나이저, 얼음, biopolymer - microcentrifuge 스핀 열 ¹⁰ 에서 시스템을 분쇄 10) , 페놀 / 구아니딘 계 용해제, 구아니딘과 에탄올을 포함한 세척 완충액 (세척 완충액 1), 에탄올을 포함한 세척 완충액 (세척 완충액 2)을 포함한다.
2. 유리 호 모지 나이저에 20 MG 복막 샘플을 넣고 페놀 / 구아니딘 기반 용해 시약 700 μL를 추가합니다.
3. 뒤틀린 상태에서 유봉을 천천히 눌러 시료를 균질화하십시오. 복막 막 샘플이 페놀 / 구아니딘 기반 용해 시약에 완전히 용해 될 때까지 얼음 위에서이 과정을 수십 번 반복합니다.
4. 추가 균질, 2.0 ML 수집 튜브에 microcentrifuge 스핀 칼럼에 biopolymer - 파쇄 시스템에 균질 lysate을 전송합니다. 그런 다음 14,000 xg에서 4 분간 3 분간 원심 분리하십시오.
5. Homogenized lysate를 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮긴다.
6. 균질화 lysate에 클로로포름 140 μL를 추가하고 욕조를 모자안전하게. 그런 다음 튜브를 15 초 동안 뒤집어서 혼합하십시오.
7. 실온에서 2-3 분 동안 샘플을 품어 낸다. 그런 다음 12,000 xg에서 15 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하십시오.
8. 침전물을 방해하지 않고 상등액 (일반적으로 300 μL)을 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮기고 100 배 에탄올의 1.5 배량 (일반적으로 450 μL)을 첨가하십시오. 그런 다음 5 초 동안 볼 텍싱하여 샘플을 섞으십시오.
9. 시료 700 μL를 2.0 mL 수집 튜브에 놓여있는 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣으십시오. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다.
10. 엄격하게 샘플을 씻어 실리카 막 기반 스핀 칼럼에 세척 버퍼 1 700 μL를 추가합니다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다.
11. 실리카 멤에 세척 버퍼 2 500 μL를 추가하십시오rane 기반의 스핀 컬럼으로 소금의 흔적을 제거합니다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다.
12. 2.11을 반복하십시오.
13. 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 15,000 xg에서 1 분간 다시 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다.
14. 새로운 1.5 ML 수집 튜브에 실리카 멤브레인 기반 스핀 칼럼을 놓습니다. 그런 다음 RNase가없는 물 25 μL를 컬럼으로 옮긴다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 샘플을 실온에서 5 분 동안 방치하십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 1 분간 원심 분리합니다.
15. 총 RNA가 포함 된 25 μL 용리액을 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮기십시오. 그런 다음 사용하기 전에 -80 ° C에서 보관하십시오.

3. 총 RNA의 역전사

참고 : 정량 실시간 PCR 실험의 출판을위한 최소 정보에 대한 참고 및 준수iments (MIQE) 지침은 더 나은 실습을 장려하고 신뢰성 있고 명확한 결과를 얻는 데 도움이됩니다.
참고 : 여기서 역전사 효소, poly (A) polymerase 및 oligo-dT primer를 사용하여 총 1.0 μg의 분리 된 RNA를 역전 사합니다.

1. 다음 품목을 수집하십시오 : 1.5 mL microcentrifuge tubes; 8- 웰 스트립 튜브; RNase없는 물; 얼음; 역전사 효소 키트 (물질 표 참조) ¹¹ .
2. 2.0 μL의 10x 핵산 믹스, 2.0 μL의 역전사 효소 믹스 (키트에서), 4.0 μL의 5x hi-spec 버퍼를 포함하는 마스터 믹스 용액을 튜브 당 총 8.0 μL로 준비하십시오.
3. 마스터 믹스 용액 (키트에서) 8.0 μL를 각 튜브에 분배합니다.
4. 분광 광도계를 사용하여 전체 RNA 양을 측정하십시오. 복막 막 샘플에서 정제 된 분리 된 총 RNA 1.0 μg을 각 튜브에 첨가합니다.
   참고 : qRT-PCR은 미국에서 수행 할 수 있습니다.정화 된 총 RNA의 품질 관리를 위해 역전사없이 전체 RNA를 주형으로 사용합니다. DNA가 오염되면 qRT-PCR에 의해 예상치 못한 증폭 산물이 관찰됩니다.
5. 총 20 μL까지 각 튜브에 RNase가없는 물을 첨가하십시오. 그런 다음 피펫 팅으로 철저히 혼합하고 15 초 동안 원심 분리하십시오.
6. 37 ° C에서 60 분 동안 견본을 품어 라. 95 ° C에서 5 분간 즉시 품어 라.
   참고 :이 단계는 열 순환 장치에서 수행 할 수 있습니다.
7. cDNA를 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮기고 RNase가없는 물로 10 배 희석하십시오 (1:10).
8. 희석 된 cDNA를 얼음에 일시적으로 보관하고 사용하기 전에 장기간 -80 ° C에서 보관하십시오.

4. miRNA의 qRT-PCR

참고 : miRNA의 qRT-PCR은 인터 칼 레이팅 염료를 사용하여 수행됩니다. 여기에는 RNA, U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p 프라이머 사용 된.

1. 다음 항목을 수집 : 1.5 ML microcentrifuge 튜브, qRT - PCR, 96 - 웰 반응 플레이트에 대한 접착 필름, miRNA 특정 primers, 녹색 염료 기반의 PCR 키트 (자료 테이블을 참조하십시오) ¹¹ 에 대한 96 잘 반응 플레이트, 그리고 실시간 PCR 기기.
2. 2x PCR 마스터 믹스 12.5 μL, nuclease-free 물에 용해 된 5 μM 각 miRNA 프라이머 2.5 μL 및 각 웰에 대한 10 배 범용 프라이머 1.25 μL가 들어있는 마스터 믹스를 준비하십시오.
3. 96- 웰 플레이트의 각 웰에 22.5 μL의 마스터 믹스를 분배합니다.
4. 각 우물에 2.5 μL의 template cDNA를 첨가한다.
5. 96- 웰 반응 플레이트 용 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 그런 다음 플레이트를 1,000 xg에서 30 초간 원심 분리하십시오.
6. 다음과 같이 실시간 PCR Instrument 및 소프트웨어로 PCR cycling 프로그램을 실행하십시오.
   1. 실시간 PCR 장비에 플레이트를 놓습니다. 실시간 PCR 소프트웨어에서 실험적 속성을 정의합니다 (실험적으로 입력이름, 악기의 실험 유형에 대한 "96 - 우물"을 선택, "SYBR 녹색 시약"대상 시퀀스를 감지하는 "SYBR 녹색 시약"을 선택 "2 ^{- ΔΔCT} 방법"을 선택하고, "표준 램프 속도"를 선택하십시오 악기 실행).
   2. 그런 다음 샘플에 이름을 지정하고 각 웰에서 miRNA를 표적으로 삼습니다. 샘플은 항상 결과 검증을위한 충분한 데이터를 얻기 위해 중복 또는 3 중으로 테스트됩니다. 표준 시료와 내인성 대조군을 선택하십시오. 염료가 수동 기준으로 사용하려면 "없음"을 선택하십시오.
   3. 지시에 따라 실시간 PCR 소프트웨어에 "20 μL"의 반응 부피와 다음의 PCR 사이클링 조건을 입력하십시오 : 95 ° C에서 15 분 동안 프리 인큐베이션 한 다음 94 ° C에서 15 초 동안 변성 55 ° C에서 30 초, 어닐링은 70 ° C에서 30 초 동안 수행 하였다.
7. qRT-PCR 데이터 분석 u실시간 PCR 장비의 소프트웨어를 부릅니다. 소프트웨어에 의해 자동으로 결정되는 임계 값과 기준선이 각 우물에서 적절한 지 확인하십시오.
8. 각 표본에서 표적 miRNA의 임계주기를 확인하십시오. 임계주기는 증폭 곡선과 임계 선 사이의 교차점입니다. 그런 다음, 내인성 대조군으로서 RNU6-2에 대한 표적 miRNA의 발현 수준을 표준화하고, 2 ^{- ΔΔCT} 방법 ^13을 사용하여 표적 miRNA의 상대 발현 수준을 계산한다.
   참고 : 내인성 대조 miRNA의 발현 수준의 안정성을 확인해야합니다. 이 실험에서, RNU6-2는 높은 수준에서 각 그룹에 걸쳐 상대적으로 변하지 않는 것으로 확인되었다.

결과

여기에 제시된 결과는 이전에보고 된 연구 ⁸ 에 근거합니다. 우리는 복막 섬유증에서 miRNA 발현 프로파일을 조사했다. 복막 섬유증은 복막 투석의 주요 합병증입니다. 그것은 mesothelial 세포 monolayer의 손실과 extracellular 매트릭스 구성 요소의 과도한 축적을 특징으로하고, 복막 막 실패 ^{14 , 15} 와 관련이 있습니다....

토론

이 원고에 제시된 프로토콜을 사용하여, qRT-PCR을 사용하여 쥐 복막의 miRNA를 성공적으로 정제하고 검출 하였다. qRT-PCR 데이터 분석의 신뢰성은 정제 된 miRNA의 품질에 달려 있습니다. 따라서 miRNA의 순도는 분광 광도계를 사용하여 측정 할 수있는 280 nm에서의 흡광도 대 260 nm에서의 흡광도의 비율로 qRT-PCR 전에 확인할 수 있습니다. qRT-PCR을 사용하여 miRNA가 현저히 증폭되지 않으면 주형 cDNA의 농도가...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
miScript II RT kit	Qiagen	218161	includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
miRNA-142-3p primer	Qiagen	MS00031451	5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3'
miRNA-21-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'
miRNA-221-3p primer	Qiagen	MS00003857	5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3'
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00033320	5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3'
miRNA-34a-5p primer	Qiagen	MS00003318	5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3'
miRNA-327 primer	Qiagen	MS00000805	5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3'
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
methylglyoxal	Sigma-Aldrich	M0252
Midperic	Terumo	not assign	peritoneal dialysis fluid
Sprague–Dawley rats	SLC	not assign