고해상도 초음파 모니터 종양 발병 및 성장 췌장암 유전자 조작된 모델에서을 활용 하 여

요약

이 문서에서는 유전자 조작된 췌장암 쥐에서 고해상도 초음파의 활용. 기본 목표 탐지 및 내 인 성 췌 장 종양의 평가 대 한 자세한 지침을 제공 하는.

초록

LSL-Kra^{G12D / +}; LSL-Trp53^{R172H / +}; Pdx-1-Cre (KPC) 마우스 모델 췌장암에서 소설 치료 평가를 설립 하 고 자주 사용 유전자 변형 모델을 나타냅니다. 종양 발병 8 주 몇 달 사이 섹 모델 변수입니다. 따라서, 비-침략 적 이미징 도구는 화면 종양 발병 및 치료에 대 한 모니터 해야 합니다. 이 문제를 해결 하려면 다른 접근은 지난 년 동안 등장 했습니다. 고해상도 초음파 비 침해, 빠른 세션 시간 및 방사선 노출 없이 높은 이미지 해상도 같은 주요 장점이 있습니다. 그러나, 쥐에서 초음파 사소한 하 고 충분 한 해부학 지식을 이며 실용적인 기술을 성공적으로 전 임상 췌장암 모델에서 고해상도 초음파를 수행 하는 데 필요한. 다음 문서와 함께 내 생 췌장암 모델에 특히 초점 murine 모델에서 복 부 초음파에 대 한 자세한 체험 가이드 제공 됩니다. 또한, 일반적인 실수 및 그들을 피하기 위해 방법의 요약을 제공 합니다.

서문

유전자 조작된 마우스 모델 연구 밀접 하 게 인간의 발암^1,2,3의 복잡 한 성격을 정리 하는 능력 때문에 증가 중요성을 얻고 있다. 하나는 가장 자주 췌장암 개발 연구 모델을 사용, 진행 및 치료 응답 종양 억제기 p53⁴의 비활성화와 결합 하는 Kra oncogene에서 활성화 돌연변이 의해 특징입니다. 이 LSL Kra^{G12D / +}; LSL-Trp53^{R172H / +}; Pdx-1-Cre (KPC) 마우스 모델 모방 침략 암 전 침략 적인 췌 장 intraepithelial neoplasia (PanIN) 병 변에서 단계별 진행. Phenotypically, 거의 모든 마우스는 출산 후 첫 6 개월 이내 PDAC를 개발. 그러나, 섹 모델 몇 개월⁴주 8에서 높은 변수 종양 발병을 밝혀 이식된 모델에 비해. 췌 장 종양에 도달 특정 크기 (지름 5-9 m m), 종양의 성장을 빠르게 가속 및 마우스⁵전 임상 시험 등록 해야 합니다. 따라서, 종양 발병 및 종양 크기의 정확한 탐지 물류 전 임상 연구 및 치료 모니터링에 대 한 필수적인 전제 조건입니다. 일반적으로, 몇 가지 방법을 같은 자기 공명 영상 (MRI)⁶,^7,,89 또는 고해상도 초음파 단층 종양 검사 실시를 채택 될 수 있다 고 치료¹⁰. 각 기술은 그것의 장점과 단점이 있다. 비록 MRI-컴퓨터 단층 촬영 (CT) 또는-이미징 고해상도 데이터 수집 뿐만 아니라 정확한 볼륨 계산, 일반 진정에서 장시간된 시험 시간을 허용 하 고 매우 비싼 장비 필요, 그리고 자주 허용 하지 않습니다 시간의 긴 기간 동안 스캔. 대조적으로, 작은 동물 초음파 쥐¹¹복 부 병 리에 대 한 화면을 사용할 수 있는 설정된 방법입니다. 이미징이 방법의 장점은 짧은 시간, 높은 해상도, 스캔 그리고 도플러 초음파 또는 대비 사용 가능성 향상 된 동시에 장기의 관류를 시각화 하기 위해 초음파 (CEUS). 그러나, 해 부 지식, 3D 상상력과 철저 한 실습은 올바른 이미지 해석 필요 합니다.

다음 문서에서 섹 모델에서 고해상도 초음파를 이용 하 여에 대 한 상세한 프로토콜 제공 됩니다. 또한, 표준 초음파 이미지 묘사 되며 조사에 대 한 오리엔테이션을 촉진 하기 위하여 기관 구조와 분류.

프로토콜

이 프로토콜은 대학 의료 센터 괴팅겐, 독일 (33.9-42502-04-15/2056)에서 동물 보호 지침. 개별 동물의 특정 요구 사항에 따라 검토 보드, 일부 프로토콜 단계에 따라 수정할 수 있습니다.

1. 복 부 촉진 KPC 마우스의

1. 피하기 위해 불필요 한 초음파 검사, 식별 수도 아마도 intraabdominal 병 변 고 이후에 복 부 초음파 검사를 받아야 한다 쥐 마우스 복 부를 만져.
   1. KPC 마우스 모델에서 나이의 8 주 이상 복 부 촉진 주간 시작을 수행 합니다. 고해상도 초음파 또한 이식된 종양 모델 (예를 들어, orthotopics) 또는 다른 유전자 조작된 마우스 모델에 적용할 수 있습니다.
      참고: 종양 활동 및 연구 목표 (예방 연구, 치료 개입 연구)에 따라 매우 작은 종양 (1-2 m m)의 탐지는 모니터 종양 발병 가능 종양 palpated 수 있습니다 전에.
2. 감 금 소에 마우스를 놓고 부드럽게 마우스 꼬리 리프트 하 고 부드럽게 인덱스와 비-고정 손 (그림 1)의 엄지를 위아래로 이동 하 여 복 부를 만져.
3. 마우스는 부드러운 촉진 허용, 천천히 압력을 증가 하 여 진행 합니다. 더 큰 저항 위와 더 낮은 복 부에 쉽게 검색할 수 있습니다. 가끔, 하드 배설물 해석 될 수 있습니다 실수로 종양으로 질량.

2입니다. 준비 작업 공간

1. 적어도 3 명의 다른 작업 단위에 대 한 공간을 제공: 사전 검사 영역, 단계 및 복구 케이지를 스캔. 필요한 자료는 그림 2에 묘사 된다.
2. 주요 작업 플레이트 청소 (예를 들어 70%와 에탄올) 난방 플랫폼 (그림 3) 스캔 이전에 전환. 38-40 ° C의 목표 온도 도달 하면 첫 번째 마우스 전송 하기 전에 다는 것을 확인 하십시오.
3. 초음파 기계에 스위치와 인수 데이터 (그림 4)에 대 한 새 폴더를 만듭니다. 복 부 영상 B 모드 설정이 적용 됩니다. 또한, 복 부 변환기 컴퓨터의 활성 포트에 연결 되어 확인 하십시오. 시스템을 장착 하는 변환기를 사용 하 여 작업 단계의 상단에 변형기 머리를 수정.
4. 난방 격판덮개 또는 열 매트 (또는 사용 난방 램프) 포스트 절차 체온 조절 및 스캔된 마우스의 신속한 복구를 보장 하기 위해 복구 케이지를 준비. (그림 5)는 질 식의 위험으로 침구의 열망을 피하기 위해이 장의 하단에 쿠션으로 직물의 얇은 레이어를 넣어.

3. 흡입 마 취

1. 유도 챔버로 마우스를 넣어 진행 합니다. 가스 캐리어 흐름 (1 L/min 산소 또는 공기) 밸브 열고 isoflurane 농도 4% 유도 챔버의 천천히 증가 채도 수 있도록 설정 합니다. 그 자리에는 적절 한 isoflurane 청소 (수동 또는 능동 필터링) 다는 것을 확인 하십시오. 약 2-4 분 후 마우스는 깊은 진정의 밑에 일반적으로 있을 것입니다.
   1. 원뿔을 통해 2 %isoflurane 작업 단계에 투여 하 여 진정 작용을 유지 합니다.
2. 조심 스럽게 작업 단계로 유도 챔버에서 동물 전송. 코 콘 일정 가스 흐름에 대 한 확인 하십시오. 마 취 선 콘센트의 원뿔에 마우스 주 둥이 넣어. 초기 검색에 대 한 일반적인 위치는 부정사 위치가입니다. 마우스 췌 장 머리 또는 꼬리 종양 (그림 6)의 가시성을 개선 하기 위해 오른쪽 또는 왼쪽에 배치할 수 있습니다.
3. 복 부 초음파 고통 스러운 라기보다는, 고통 무료 조건 및 깊은 마 취 상태에 대 한 지표로 서 발 꼬 집 음 시험을 수행 합니다. 마우스는 여전히 활성 또는 적극적으로 주위를 움직이고, 다시 옮긴 다 동물 반복 및 장기간 유도 위한 유도 실에서 다시.
4. 눈 보호 연 고를 사용 하 여 액체 손실로 인해 각 막 부상을 방지 하기 위해.
5. 마 취 동안 모니터링 시스템을 사용 합니다. 그러나, ECG 및 직장 온도 사용 되지 않습니다 정기적으로 복 부 초음파 검사. 중요 한 것은, 쥐 취 thermoregulate 수가 잃게됩니다. 따라서, 저체온증 이나 호흡 곤란 허 걱 등 가사에 대 한 임상 증상 관찰 밀접 하 게. 경우 어떤 증상 즉시 명백한 중지 isoflurane 장소와 복구 장에 마우스입니다.

4. 초음파 설정

1. 제조업체의 지침에 설명 된 대로 초음파 시스템에 전환 합니다. 기본 설정은 활성화 복 패키지와 함께 일반 영상에 넣어 다는 것을 확인 하십시오. 일반적으로 B-모드-영상 표준으로 서 데이터 수집에 사용 됩니다.
2. 다음 매개 변수 최적화 된 이미지 품질을 달성: 주파수 40 MHz, 2D 이득 25-30 dB, 이미지 깊이 10 m m, 이미지 폭 10 m m, 3-6 m m 사이 센터 3 초점 영역.

5. 마우스 준비

1. 위와 더 낮은 말단 접착 테이프를 사용 하 여 수정 합니다. 때문에 고정 (그림 7) 동물에 어떤 부상을 피하기 위해 최대한 주의 해야 합니다.
2. 전자 애완 동물 클리퍼 스를 사용 하 여 모든 복 부 털을 제거 합니다. 모피 텍스처 때문에 흉 곽까지 더 낮은 복 부에서 시작 합니다. 이 지역에 있는 피부 상해를 피하기 위해 프로세스 xiphoideus 에 주의.
   참고: 마우스 모피 초음파 파도 반영 하 고 가시성을 감소 시킵니다.
3. Depilatory 크림을 사용 하 여 수행 하는 최적화 된 피부 준비 및 모피의 완전 한 제거. 코 튼 팁 (그림 8)를 사용 하 여 면도 복 부에 크림의 얇은 레이어를 관리 합니다. 뒤에 모든 잔재 (그림 9, 그림 10, 그림 11)를 완전히 제거 하는 물을 충분히 건조 조직 (후 30 s 나중에 따라 또는 사용 하는 크림) 크림을 제거 합니다. 크림 나머지 초음파 후 피부와 점 막 자극을 일으킬 수 있는 고 따라서 건강에 영향을 미칠 수 있습니다.
4. 적절 한 검색 되도록 조건 (그림 12) 복 부에 초음파 젤 많이 적용 됩니다. 일반적으로, 따뜻한 초음파 젤 마우스에 대 한 저체온증을 최소화 하기 위해 사용 됩니다.
5. 직접 변환기 머리에 초음파 젤의 얇은 층을 적용. 노치 변환기 끝에 감동 하 여 테스트를 수행 합니다. 화면에서 상단 왼쪽에 신호 변환기가 올바르게 배치 하는 경우를 볼 수 있습니다.

6. 복 부 초음파

1. 확고 한 압력을 사용 하 여 복 부에 변환기를 조정 합니다. 무거운 압축 마우스 복 부의 호흡 또는 혈액 순환 장애를 발생할 수 있습니다 하 고 피해 야 한다.
2. 아래로 검색 합니다. 작업 플랫폼 및 x 축과 y 축에 대 한 바퀴의 프레임을 조정 합니다.
3. 첫 번째 단계로 두 신장 식별 합니다. 일반적으로 그들은 낮은 복 부에 균질 성 구조를 hyperechogenic로 나타납니다. 연결 된 베 나 renalis 찾을 수 있습니다 쉽게 더 베 나 정 맥 열 등 (그림 13)에 이르게.
4. 획기적인 혈관 베 나 lienalis 역할을 사용 하 여 췌 장에 대 한. 베 나 renalis 와 베 나 lienalis를 구별 하려고 합니다. 베 나 lienalis 의 검출 시 췌 정확 하 게 지역화할 수 있습니다. 정상 췌 오히려 멤브레인 (그림 14 와 그림 15) 고체 구조 보다 복 부 구멍을 통해 확산입니다.

7. 췌 장 종양 탐지 및 볼륨 평가

1. 모든 주변 구조에서 췌 장 병 변 식별 합니다. 그들은 일반적으로 hypoechoic 휘도가 원형 또는 길쭉한 조직 질량 (그림 16)으로 표시 됩니다. 종양 보통 회사 이며 거의 스캔 헤드에 의해 압축 될 수 있습니다. 참고, 때때로 종양 및 작은 창 자 루프 사이 명확 하 게 구별 하기 힘들 수도. 췌 장 종양에서 관찰 하지 한다 창 자 연동에 주의.
2. 에 종양 감지 화면 위쪽 및 아래쪽을 전체 크기의 인상을 가져오고 초음파 캘리퍼스를 사용 하 여 큰 직경을 측정. 적당 한 이미지를 발견 되 면 화면을 고정 하 고 측정 도구를 사용 하 여 종양 크기를 정확 하 게 결정. 참고, 나중을 위해 꼬리, 몸 또는 췌 장의 머리에 종양 지역화 여부를 차별화 하는 것이 중요할 것 이다.
3. 라이브 모드를 다시 변경 하기 전에 작업을 기록 하는 사진을 저장 해야 합니다. Note, 조정 바퀴를 출시 하 고 초음파 프로브 마우스 복 부를 누르면 더욱 그럴 수 있습니다 이미지를 고정 하는 동안 따라서, 동결 모드를 변경 하기 전에 압축 조정 수정.
4. 첫 비행기의 측정을 완료 한 후 경도 위치 (그림 17)에서 90 °에 의해 스캔 헤드를 회전 하거나 종양의 경도 확장을 검색 하는 쪽으로 마우스를 설정 합니다. 일부 종양 적절 한 가시성에 대 한 마우스의 위치를 변경 해야 합니다. 췌 장 꼬리 종양에 대 한 마우스 췌 장 머리 종양의 왼쪽 (그림 11 및 그림 20)에 대 한 (그림 10 과 그림 19), 그것의 오른쪽에 배치 수 있습니다.

8입니다. 종양 볼륨의 정량화

참고: 모든 노력을 하나의 주요 목표는 종양 볼륨의 정확한 결심 이다. 사용할 수 있는 몇 가지 기술이 있다는 타원 면의 수식을 포함 하는 계산 방법 이지만 대학 의료 센터 괴팅겐에서 선호 합니다.

1. 모든 3 개의 이전 취득 직경 있습니다 해당 종양 (그림 21)의 대략적인 양을 계산 합니다.
2. 또는, 스캔 머리의 모터 시스템을 사용 하 여 후속 볼륨 계산 및 3 차원 재구성 종양의 자동된 검색을 수행 하.

9입니다. 복구

1. 스캔, 후 신중 하 게 모든 접착 테이프를 제거 하 고 신중 하 게 모든 초음파 젤을 제거 건조 조직으로.
2. 조심 스럽게 복구 ( 그림 21)으로 마우스를 전송 합니다. 호흡기 장애를 발생할 수 있습니다 mouse´s 얼굴에 어떤 덮 음 조직을 하지 마십시오. 복구에 대 한 측면 위치 기본 설정 해야 합니다.

결과

초음파 이미징 인간의 질병의 murine 모델에 몇 가지 문제를 해결 하는 데 사용 되는 다양 하 고 비-침략 적 기술입니다. 모든 다른 이미징 접근 주요 장점에 비해 높은 처리량, 비용 효율, 짧은 획득 시간과 실시간 이미징 있습니다. 그러나,이 도구는 정확 하 고 높은 품질의 이미지를 생성 하는 전문 지식이 필요 합니다. 원치 않는 유물 경우 특히 적어도 일부 경험 초음파 이...

토론

이 프로토콜, 췌 장 종양 유전자 조작된 마우스 모델에서 고해상도 복 부 초음파 이미징 사용 하 여 측정에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 최근, Sastra 외. 췌 장 종양 마우스 모델, 하지만 준비 및 모든 추가 단계에 대 한 전제 조건¹¹를 표시 했다 처리에 대 한 아무 시각된 지침을 계량 하는 방법 자세한 설명 출판. 이 원고의 전반적인 목표는 고해상도 초음파 쥐에 대 한 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Visual Sonics Vevo2100 High Resolution Ultrasound System, including imaging stage and anesthesia line	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11945
Vevo 2100 MicroScan Transducer MS-550-D (22-55MHz)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11874
Vevo Anesthesia System (anesthesia induction chamber with fresh and waste gas inlet)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-12055
Vevo Imaging Station (working stage with nose cone for anesthesia supply)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-11982
electronic pet clippers	Panasonic Marketing Europe, Germany	5025232484324	Panasonic ER-PA10-s
Labotect Hot plate	Labor tech Göttingen, Germany	13854
eye cream (ophthalmic ointment)	Schülke&Mayr, Germany	9080249
veterinary isoflurane	Abbvie, Germany	4831867
depilatory cream	RB healthcare UK, United Kingdom	8218535
70% ethanol (v/v) in distilled water	TH. Geyer, Germany	22941000
ultrasound gel	Asmuth, Germany	13477
tissue wipes	Kimberly-Clark Germany, Germany	7558
cotton tips	Meditrade, Germany	75481116
glass bowl for ultrasound gel	ARC France, France	H1149
water bowl	W & P Trading Co., USA	B00K2P6PLQ
gauze sponges	Fuhrmann, Germany	960504