Utilizando o ultra-som de alta resolução para o aparecimento de Tumor de Monitor e crescimento em modelos de câncer pancreático geneticamente modificados

Resumo

Este artigo descreve a utilização de ultra-som de alta resolução em camundongos geneticamente modificados câncer pancreático. O objetivo principal é fornecer uma instrução detalhada para detecção e avaliação de tumores pancreáticos endógenas.

Resumo

O LSL-Kras ^{G12D / +}; LSL-Trp53^{R172H / +}; PDX-1-Cre modelo de mouse (KPC) representa um modelo transgênico estabelecido e usado com frequência para avaliar novas terapias em câncer pancreático. Aparecimento de tumor é variável no modelo KPC entre 8 semanas e vários meses. Portanto, ferramentas de imagem não-invasivos são obrigadas a tela para o aparecimento de tumor e monitor para resposta ao tratamento. Para resolver esse problema, diferentes abordagens têm surgido nos últimos anos. Ultra-som de alta resolução tem grandes vantagens como não-invasividade, tempos de sessão rápida e uma alta resolução de imagem sem exposição à radiação. No entanto, ultra-som em ratos não é trivial e suficiente conhecimento anatômico e habilidades práticas são necessárias para executar com êxito o ultra-som de alta resolução em modelos pré-clínicos de câncer pancreático. Com o artigo a seguir, é apresentado um guia detalhado de hands-on para ecografia abdominal em murino modelos com um foco particular em modelos de câncer no pâncreas endógeno. Além disso, é fornecido um resumo dos erros comuns e como evitá-los.

Introdução

Modelos de rato geneticamente ganharam uma importância crescente em pesquisa de câncer, devido à sua capacidade intimamente recapitular a natureza complexa de carcinogênese humana^1,2,3. Um dos mais frequentemente usados modelos para estudar o desenvolvimento de câncer no pâncreas, progressão e resposta terapêutica é caracterizada por uma mutação ativando o oncogene Kras combinado com uma inativação do tumor supressor p53⁴. Este LSL-Kras ^{G12D / +}; LSL-Trp53^{R172H / +}; PDX-1-Cre modelo de mouse (KPC) imita a progressão por etapas de lesões pre-invasoras de neoplasia intra-epitelial pancreática (PanIN) para carcinoma invasivo. Fenotipicamente, quase todos os ratos desenvolvem PDAC dentro os primeiros seis meses após o nascimento. No entanto, em comparação com modelos transplantados, o modelo KPC revela um início de tumor altamente variável de 8 semanas a vários meses⁴. Uma vez que tumores pancreáticos alcança um certo tamanho (5-9 mm de diâmetro), rapidamente acelera o crescimento do tumor e ratos terá que estar matriculado em ensaios pré-clínicos⁵. Portanto, a detecção exata do aparecimento do tumor e o tamanho do tumor é um pré-requisito essencial para estudos pré-clínicos logística e monitoramento de terapia. Em geral, várias abordagens como ressonância magnética (MRI)⁶, computadorizada, digitalização^7,8,9 ou ultra-som de alta resolução pode ser empregada para realizar triagem de tumor e terapia de¹⁰. Cada técnica tem suas vantagens e desvantagens. Apesar de MRI- ou tomografia computadorizada (CT)-imagem permite a aquisição de dados de alta resolução, assim como o cálculo de volumes precisos, tempo prolongado exame sob sedação geral, e um equipamento muito caro é necessário e não permite frequente digitalização por um longo período de tempo. Em contraste, o pequena animal ultra-sonografia é um método estabelecido que pode ser empregado para a tela para patologias abdominais em ratos¹¹. Vantagens deste método de imagem são curtas de digitalização vezes, alta resolução, e a possibilidade de utilizar ultra-som doppler ou contraste aprimorado ultra-som (CEUS) para visualizar a perfusão dos órgãos em paralelo. No entanto, conhecimento anatômico, imaginação 3D e exaustivo treinamento prático são necessários para a interpretação correta da imagem.

No artigo a seguir, é fornecido um protocolo detalhado para a utilização de ultra-som de alta resolução no modelo KPC. Além disso, imagens de ultra-som padrão são retratadas e rotuladas com estruturas do órgão para facilitar a orientação para o investigador.

Protocolo

Este protocolo está em conformidade com as orientações de cuidados com animais na universidade médica centro de Goettingen, Alemanha (33,9-42502-04-15/2056). Dependendo dos requisitos específicos de cada animal comissões de inquérito, algumas das etapas do protocolo podem ser modificadas em conformidade.

1. abdominal palpação dos ratos KPC

1. Para evitar exames desnecessários ultra-som, palpe o abdome do mouse para identificar os ratos que possivelmente podem suportar uma lesão intraabdominal e posteriormente devem ser submetidos a ecografia abdominal.
   1. Realize a palpação abdominal semanais a partir de 8 semanas de idade, no modelo do mouse KPC. Ultra-som de alta resolução também pode ser aplicada em modelos de tumor transplantado (por exemplo, orthotopics) ou outros modelos de rato geneticamente modificados.
      Nota: Dependendo do tumor cinética e estudo objetivo (estudo de prevenção, estudo de intervenção terapêutica), detecção de tumores muito pequenos (1-2 mm) é viável para o aparecimento de tumor do monitor antes de tumores podem ser palpados.
2. Coloque o mouse sobre a grade da gaiola e delicadamente Levante o mouse pela cauda e palpar o abdome suavemente indo para cima e para baixo com índice e o polegar da mão não-fixação (Figura 1).
3. Se o mouse tolera palpação suave, vá aumentando lentamente a pressão. Uma maior resistência pode ser facilmente detectada no abdômen superior e inferior. Às vezes, difícil fezes podem ser erroneamente interpretadas como um tumor em massa.

2. preparação do espaço de trabalho

1. Proporcionar espaço pelo menos três unidades de trabalho diferentes: área de pré-digitalização, digitalização gaiola de palco e recuperação. Material necessário são representados na Figura 2.
2. Limpe a placa principal de trabalho (por exemplo, com 70% etanol) e ligue a plataforma de aquecimento antes da digitalização (Figura 3). Certifique-se que é atingida a temperatura de alvo de 38-40 ° C, antes do primeiro mouse é transferido.
3. Ligue a máquina de ultra-som e criar uma nova pasta para os dados adquiridos (Figura 4). A configuração de modo-B é aplicada para a imagem latente abdominal. Além disso, certifique-se que o transdutor abdominal está conectado a porta ativa da máquina. Fixe a cabeça do transdutor na parte superior da fase de trabalho usando o transdutor de sistema de montagem.
4. Preparar uma gaiola de recuperação em uma placa de aquecimento ou esteira térmica (ou lâmpada de aquecimento de uso) para garantir a termorregulação pós-processual e a rápida recuperação dos ratos digitalizados. Coloque uma camada fina de tecido como almofada no fundo da jaula para evitar a aspiração do fundamento com o risco de asfixia (Figura 5).

3. anestesia por inalação

1. Proceda ao colocar um rato na câmara de indução. Abra a válvula de fluxo do gás portador (1 L/min de oxigênio ou ar) e definir a concentração de isoflurano para 4%, permitindo uma lentamente crescente saturação da câmara de indução. Certifique-se que isoflurano adequado eliminação (filtragem de passivo ou ativo) está no lugar. Após cerca de 2-4 min o mouse será geralmente sob sedação profunda.
   1. Manter a sedação através da administração de 2% de isoflurano através do cone de nariz na fase de trabalho.
2. Transferi com cuidado o animal da câmara de indução para a fase de trabalho. Verifique se o cone de nariz para um fluxo constante de gás. Colocar o focinho de rato no nariz cone de saída de linha de anestesia. A posição normal para a digitalização inicial é a posição supina. O mouse também pode ser colocado de lado esquerdo ou direito para aumentar a visibilidade da cabeça do pâncreas ou tumores da cauda (Figura 6).
3. Embora ecografia abdominal não é doloroso por si, realize o teste do beliscão de pé como um indicador para uma condição livre de dor e estado profundamente anestésico. Se o mouse é ainda ativo ou movimentando-se ativamente, retransferência o animal de volta na câmara de indução para indução repetida e prolongada.
4. Use pomada de proteção para evitar lesões da córnea devido a perda de líquidos.
5. Durante a anestesia, use um sistema de monitoramento. No entanto, as ECG e temperatura retal não é regularmente usado para digitalização de ecografia abdominal. Importante, ratos perdem a capacidade de termorregulação sob anestesia. Portanto, observe de perto os sinais clínicos para hipotermia ou respiratória como ofegante ou apneia do sono. Se qualquer sintoma é óbvio paragem isoflurano e lugar o rato na gaiola recuperação imediatamente.

4. o ultra-som configurações

1. Ligue o sistema de ultra-som, como descrito por instruções do fabricante. Verifique se que a configuração principal é colocada na imagem geral com o pacote abdominal ativado. Normalmente B-modo-imagem é usado para aquisição de dados como um padrão.
2. Obter uma qualidade de imagem otimizada com os seguintes parâmetros: frequência de 40 MHz, 2D-ganho 25-30 dB, profundidade de 10 mm, 10 mm, largura da imagem da imagem 3 zonas focais com centro entre 3 a 6 mm.

5. Mouse preparação

1. Fixe a extremidade superior e inferior, usando fita adesiva. Ser tão cuidadoso quanto possível para evitar qualquer prejuízo ao animal devido a fixação (Figura 7).
2. Remova todas as peles abdominal usando eletrônicas tosquiadeiras do animal de estimação. Devido a textura da pele, comece da parte inferior do abdome até a caixa torácica. Cuide ao processus xiphoideus para evitar lesões de pele nesta área.
   Nota: Pelo de rato reflete ondas de ultra-som e diminui a visibilidade.
3. Use creme depilatório para realizar uma preparação de pele otimizada e completa remoção de pelo. Administre uma fina camada de creme sobre o abdômen depilado usando pontas de algodão (Figura 8). Retire o creme de leite (após 30 s ou mais tarde, dependendo do creme usado) com tecidos secos, seguidos de muita água para remover completamente todos os remanescentes (Figura 9, Figura 10, Figura 11). Restos de creme podem causar irritações de pele e mucosa após o ultra-som e, portanto, podem afetar a saúde.
4. Para garantir a adequada verificação condições aplicam-se abundância de gel de ultra-som para o abdômen (Figura 12). Geralmente, gel de ultra-som quente é usado para minimizar a hipotermia para o mouse.
5. Manualmente, aplique uma camada fina de gel de ultra-som na cabeça do transdutor. Execute um teste tocando na ponta do transdutor com o entalhe. Na tela de um sinal no lado superior esquerdo pode ser visto se o transdutor é posicionado corretamente.

6. abdominal ultra-som

1. Ajuste o transdutor sobre o abdômen, usando a pressão firme. Compactação pesada do abdômen do mouse pode levar a comprometimento respiratório ou circulatório e deve ser evitada.
2. Varredura para cima e para baixo. Ajuste o quadro de plataforma de trabalho e as rodas para os eixos x e y.
3. Como o primeiro passo identifica ambos os rins. Geralmente aparecem como estruturas homogêneas de hyperechogenic na parte inferior do abdome. O conectado renalis veia pode ser facilmente encontrado que leva ainda mais para a veia cava inferior (Figura 13).
4. Use o lienalis veia serve como embarcação de Marco para o pâncreas. Tentativa de distinguir entre renalis veia e veia lienalis. A detecção da veia lienalis o pâncreas pode ser localizado exatamente. O pâncreas normal é bastante uma membrana que se propagam através da cavidade abdominal do que uma estrutura sólida (Figura 14 e Figura 15).

7. no pâncreas Tumor deteção e avaliação de Volume

1. Identifica lesões no pâncreas de todas as estruturas circundantes. Eles geralmente aparecem como massas de tecido não-homogênea de redondas ou alongadas Hipoecoica (Figura 16). O tumor é geralmente firme e dificilmente pode ser comprimido pela cabeça de varredura. Nota, de vez em quando pode ser difícil de distinguir claramente entre um tumor e um loop de intestino. Preste atenção para o peristaltismo intestinal que não deve ser observada em tumores pancreáticos.
2. Tela de deteção de tumor acima e para baixo para obter uma impressão do tamanho total e medir o diâmetro maior usando o compasso de calibre de ultra-som. Uma vez que encontra-se uma imagem adequada, congelar a tela e use a ferramenta ' medida ' para determinar com precisão o tamanho do tumor. Nota, para uso posterior, será importante diferenciar se um tumor é localizado na cabeça do pâncreas, corpo ou cauda.
3. Antes de mudar de volta para o modo de viver, certifique-se de salvar fotos para registrar o trabalho. Observe, enquanto a congelar a imagem, que é possível que a roda de ajuste é liberada, e a sonda de ultra-som é ainda mais pressionada no abdômen de rato. Portanto, corrigi o ajuste da compressão antes de alterar o modo para congelar.
4. Depois de terminar a medição do primeiro avião gire a cabeça de varredura de 90º em posição longitudinal (Figura 17), ou vire o mouse para o lado, para detectar a expansão longitudinal dos tumores. Alguns tumores podem exigir mudando a posição do mouse para visibilidade adequada. Para tumores da cauda do pâncreas, o mouse pode ser colocado de lado direito (Figura 10 e Figura 19), de tumores pancreáticos de cabeça no seu lado esquerdo (Figura 11 e Figura 20).

8. quantificação do Volume do Tumor

Nota: Um dos objectivos principal de todos os esforços é a correta determinação do volume do tumor. Embora existam várias técnicas disponíveis um método de cálculo, incluindo a fórmula de um elipsoide é preferencial para a Universidade Medical Center Goettingen.

1. Equipado com todos os três diâmetros anteriormente obtidos, calcule o volume aproximado do tumor correspondente (Figura 21).
2. Alternativamente, use um sistema de motor da cabeça de varredura para realizar uma verificação automatizada da região com o cálculo dos volumes subsequentes e 3-D-reconstrução de tumor.

9. recuperação

1. Após a digitalização, remova com cuidado a fita adesiva de todos e cuidadosamente remover todo o gel ultrasom com pano seco.
2. Transferi com cuidado o mouse para a gaiola de recuperação ( Figura 21). Evite qualquer tecido cobrindo o rosto de mouse´s que pode causar deficiência respiratória. Uma posição de lado para recuperação deve ser preferida.

Resultados

Ecografia é uma técnica não-invasiva e versátil que é usada para resolver vários problemas em murino modelos de doenças humanas. Em comparação com todos os outras de imagem abordagens principais vantagens são eficiência alta produtividade, custo, tempo curto de aquisição e geração de imagens em tempo real. No entanto, esta ferramenta precisa de expertise para gerar imagens precisas e de alta qualidade. Particularmente no caso de artefatos indesejados pelo menos alguma exper...

Discussão

Com este protocolo, é fornecida uma descrição detalhada para quantificação dos tumores pancreáticos, utilizando imagens de ultra-som abdominal de alta resolução em modelos do rato geneticamente modificados. Recentemente, Sastra et al . publicaram uma descrição detalhada como quantificar tumores pancreáticos em modelos do rato, mas não visualizadas instruções sobre a preparação e manipulação como pré-requisito para todos os novos passos foram mostrados¹¹. O objetivo gera...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Visual Sonics Vevo2100 High Resolution Ultrasound System, including imaging stage and anesthesia line	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11945
Vevo 2100 MicroScan Transducer MS-550-D (22-55MHz)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11874
Vevo Anesthesia System (anesthesia induction chamber with fresh and waste gas inlet)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-12055
Vevo Imaging Station (working stage with nose cone for anesthesia supply)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-11982
electronic pet clippers	Panasonic Marketing Europe, Germany	5025232484324	Panasonic ER-PA10-s
Labotect Hot plate	Labor tech Göttingen, Germany	13854
eye cream (ophthalmic ointment)	Schülke&Mayr, Germany	9080249
veterinary isoflurane	Abbvie, Germany	4831867
depilatory cream	RB healthcare UK, United Kingdom	8218535
70% ethanol (v/v) in distilled water	TH. Geyer, Germany	22941000
ultrasound gel	Asmuth, Germany	13477
tissue wipes	Kimberly-Clark Germany, Germany	7558
cotton tips	Meditrade, Germany	75481116
glass bowl for ultrasound gel	ARC France, France	H1149
water bowl	W & P Trading Co., USA	B00K2P6PLQ
gauze sponges	Fuhrmann, Germany	960504