제 2 철 염화 유도 개 경 동맥 혈전 증: 혈관 손상의 큰 동물 모델

요약

여기, 우리는 큰 동물 혈관 손상 모델에서 잘 특징이 고 일반적으로 사용 되 작은 동물 제 2 철 염화 유도 (FeCl₃) 경 동맥 상해 모델에 사용 하기 위해 필요한 수정 제시. 결과 모델은 예방 및 thrombolytic 약리 및 기계적 개입의 전 임상 시험 평가 위해 활용할 수 있습니다.

초록

대뇌 허 혈 성 뇌졸중 및 심근 경색 폐색 동맥 혈전 증 기여 ~ 13 백만 죽음에 매년 전세계적으로. 여기, 우리는 번역 작은 동물에서 혈관 상해 모델 큰 동물 (개), 예방 및 thrombolytic 요원의 사전 임상 심사에 사용할 수 있는 약간의 수정. 수정된 프로토콜 수술 방법 이외에 두뇌와 조직학 분석 경 동맥을 확인을 위해 경 동맥을 처리 하는 데 자세한 내용은 제품은에 의해 경 동맥 수로 화를 평가 하기 위해 단계별 메서드에 대해 설명 합니다. 수로 화와 대뇌 출혈, 자기 공명 영상 (MRI)을 이용 하 여 다운스트림 thromboembolic 사건의 평가 완료 하는 특정 매개 변수. 또한, 큰 동물 (개) 혈관 상해로 번역 하는 데 필요한 이전 확고 작은 동물 모델에서 특정 절차 변경 내용은 설명 합니다.

서문

뇌졸중 치료는 크게 개입 심혈 관 질환에 약물 치료와 혈관 내 수술 개입¹에 잘 반응 하기 때문에 주로 관상 동맥 질병 치료를 모방한. 그러나 이러한 치료,, 번역 되지 않았습니다 성공적으로 뇌를. 현재 뇌졸중 치료와 함께 어려움 그는 재조합 조직 플라스 미노 겐 활성 제 (rTPA) 되돌릴 수 없습니다, 있으며 관리 출혈 성 변환^2,3, 의 중요 한 6.4% 위험을 운반 ⁴. 작은, 종종 어려운 창⁵그것의 사용을 제한 하는 결과 병 적 상태와 사망률. 또한, restenosis 및 폐색 초기 thrombolysis, 초기 신경 개선 반전 후 종종 발생 합니다. 요약, 환자의 고통을 허 혈 성 뇌혈관 모욕의 rTPA 대다수 (~ 90%)를 제외 하는 관리할 좁은 시간 창이 있다.

정 맥 antiplatelet 치료의 역할은 향상 된 선박 recanalization, 생존 및 결과²허 혈 성 뇌졸중 치료에 약속을 보이고 있다. 불행히도, 이러한 약물 내 두개골 및 두개골 외 출혈의 예측 가능한 부작용, 주로 있기 때문에 방법에 적절 하 게 반전 또는 그들의 활동²를 제어. 혈소판을 방지에 효과적인, 반면 출혈과 그들의 활동을 반대 하는 무 능력의 위험 뇌졸중 환자 처리 루틴에서 사용을 배제 했습니다. 따라서, 필요, 혼자 또는 조합 방지 하 고 혈전을 lyse 아직 안전 프로필이 출혈 용납 제대로 뇌 같은 폐쇄, 낮은 볼륨 공간에서 사용 하면 강력한 지원을 약물에 대 한 존재 합니다.

동맥 혈전 증 및 재 협 착 증의 메커니즘을 이해 하 고 평가 thrombolytics 및 재 협 착을 방지 하는 약물 전 임상 약물 개발의 일환으로 소형 및 대형 동물 모델을 요구 한다. 제 2 철 염화 유도 혈관 상해 신속 하 고 정확 하 게 쥐, 쥐, 기니 피그의 노출된 혈관에 혈전의 형성을 유발 하는 널리 사용된 기법 이며 토끼^{6,,78, 9 , 10 , 11 , 12}. 유전자 조작 편의성, 저렴 한 동물 구입, 낮은 일당 주택 비용을 포함 한 여러 가지 이점을 제공 하는 이러한 작은 종. 불행히도, 작은 동물 실험 액세스 혈소판 반응성, 혈액 가스 분석 및 염증 반응에 수술 하는 동안 여러 피 무를 부정할. 더 중요 한 것은, 큰 동물을 훨씬 더 밀접 하 게 인간 혈소판 생리학^6,13모방. 혈전 증의 병 태 생리학의 연구, 새로운 항 혈소판 및 항 응고 약물의 유효성 검사 및 잠재적인 thrombolytics⁶ 의 발견 FeCl₃ 경 동맥 상해 모델 주된 역할을 담당해 왔습니다. ^{, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12}. 이전 모델 생쥐, 쥐, 기니 피그, 토끼 용이성 및 유전자 조작에 대 한 유연성 제공 하지만 번역 전 임상 모델은 잠재적 치료제^{6의 환자 투약 및 독성 연구에 중요 한 ,13}. 비록 thrombotic 장애의 몇 가지 모델 생쥐, 말 초 혈관 질환에 적용 되는 혈전의 대형 동물 모델에서에서 개발 된 뇌졸중과 심근 경색 몇과 있습니다. 원숭이, 개, 돼지에 첫 번째 혈전 증 모델 협 착 증, 혈관, 순환 흐름 감소^14,,1516에 일반적으로 결과에 hemostats 및 나중 실린더 적용에 집중 했다. 제 2 철 염화 모델에서 내 피 손상의 사이트에서 폐색 혈전, 대신 이러한 모델에 혈전 주기적 혈전 증, 말 초 색전술 귀착되 고 정상 혈액 흐름을 반환 합니다. 비교에서는, 제 2 철 염화 모델 여기 큰 동물, 부상 사이트에서 폐색 혈전에 결과에서 수정 및 안정 이며 thrombolytic 치료 전에 혈관에 의해 확인. Diem와 개 그리고 적절 한 외과 전문의 구입, 우리가 세부 혈전 증 활용 수술, 이미징 및 조직학 연구 실험실 수 있도록 혈관 상해의 큰 개 모델 여기에 대 한 조사는 충분 한 자금을 제공 기술입니다.

프로토콜

설명 된 조사 관리 및 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 사용에 대 한 지침을 준수 하 고는 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (#2015A00000029)에 의해 승인 했다. 모든 수술 조작 했다 깊은 마 취하에 수행 하 고 동물 절차 동안 고통을 모든 단계에서 발생 하지 않았다. 설명 하는 모든 실험 비 복구 했다입니다.

1입니다. 준비

1. 갓 제 2 철 염화 물 (FeCl₃) 50% (w/v) 이온된 수에 희석 50 mL를 준비 합니다.
2. 5.5 cm 조각으로 탯 줄 테이프를 잘라내어 수술 전에 1 주 갓된 50% FeCl₃ 솔루션에 담근 다.
   참고: 사용 하는 탯 줄 테이프 두께 이며 50% FeCl₃ 솔루션을 흡수 하는 시간이 좀 걸립니다.
3. 빠른 수술 전에 각 개 하룻밤입니다.
4. 플라스마와 소변 컬렉션에 대 한 cryovials, 모든 장기 저장용 50 mL 메 마른 분리기 관 및 H & E 염색 동물 식별, 생년월일, 수술 및 치료에 대 한 두뇌와 경 고정을 위한 10% 포 르 말린 컨테이너에 레이블을 지정 합니다.
5. 각 솔루션의 100 mL 각 개 절차에 대 한 준비: 버퍼링 버퍼링 하는 인산 염 (pH 7.4), 10% 중립에서 4 %paraformaldehyde 포 르 말린, 및 2 %2,3,5 triphenyltetrazolium 염화 물 [TTC PBS (pH 7.4)에 어둠에 저장].
6. 모든 cryovials에 대 한 충분 한 액체 질소 및 50 mL 조직 튜브 플래시 절차의 하루에 대 한 동결에 대 한 습득.
7. 관심의 각 시간 지점에 대 한 각 개에 대 한 PFA-100 (혈소판 기능 분석기) 혈소판 반응성에 대 한 두 개의 ADP/콜라겐 카트리지를 취득 합니다.
8. 취득 한 4.5 mL 나트륨 시트르산 혈액 컬렉션 튜브, 희생, 플라즈마 분리 및 저장 하기 전에 각 혈액 무승부. 희생에 플라즈마 저장용 16 혈액 컬렉션 튜브를 그립니다. 각 혈액 컬렉션 튜브, 후 4000 x g 30에서 스핀 혈소판 부유한 플라스마 및 전송 분리 s cryovials에 레이어를 취소. 플래시-80 ° c.에 저장 하기 전에 액체 질소 고정
9. 한 4.5 mL 리튬 헤 파 린 혈액 컬렉션 튜브, 기록 혈소판 반응성에 대 한 관심의 각 PFA-100 시간 포인트를 획득. 각 혈액 무승부에서 혈소판 반응성에 따라 기포 없이 각 ADP/콜라겐 카트리지로 사용 리튬 헤 파 린 혈액 컬렉션 튜브에서 전체 혈액의 800 µ L을 소개 합니다.
10. 기준선과 희생의 시간이 두 K3 EDTA 혈액 컬렉션 튜브 (혈액의 1 mL 당 무수 EDTA의 1.8 mg), 완전 한 혈액 검사 (CBC)에 대 한 취득.
    참고:이 볼륨 기계적 오류 두 번의 경우 각 실행 대부분 핵심 시설에 대 한 적절 한입니다. 비록 한 CBC 실행 부상 하기 전에 모두 기준선에 희생의 때에, 조사자 추가 분석에 대 한 그들의 동물 프로토콜 승인으로 더 많은 혈액을 그립니다 추가할 수 있습니다. 볼륨 및 그들의 장비에 대 한 배달 요구 시설 확인 하십시오.
11. 작성 하 고 희생 시 혈액 가스 분석을 위한 절차의 하루는 주사기를 코팅 하 여 2 mL heparinized 주사기를 준비 합니다.
    참고: 볼륨 및 그들의 장비에 대 한 배달 요구 시설 확인.

2. 개 경 동맥 폐색

1. 무게는 성인 (> 18 개월) 비글 개 고 미리 근육 acepromazine와 함께 의료를 베 풀 (0.025-.2 mg/kg) 뒤에 케 타 민 (5-20 mg/kg)와 midazolam의 초기 복 주사 (0.01-.25 mg/kg). 심장 박동, 호흡, 그리고 턱 톤에 따라 1 ~ 5 %isoflurane 깊은 마 취를 유도.
   참고: 정확한 마 취는 무게와 승인 된 동물 프로토콜에 의해 결정 됩니다. 주사는 동물에 대 한 고통에 발생할 수 있습니다, 있지만이 불편의 기간 최소화 될 것입니다 (이 하 3 s).
2. 수술 테이블에 동물을 복용 하기 전에 클리핑에 의해 머리를 제거 합니다. 건조를 방지 하기 위해 마 취 동물의 눈에 안과 연 고 윤 활 적용 됩니다.
3. 동물 위치 시스템을 사용 하 여 부정사 위치에 놓고 발을 심전도 (ECG) 리드를 연결 패드. 6.5 m m 수 갑을 차고 endotracheal 튜브와 기도 통해 intubate, 기계적으로 14 호흡/분, 환기 하 고 1-5 %isoflurane (승인 된 동물 프로토콜에 따라 다름)의 지속적인 흡입으로 각 개를 유지 한다.
4. 수로 화는 경 동맥의 폐색 혈전의 길이의 범위를 확인 하려면 혈관 상해, MRI, 전과 희생 (대 한 추가 지침은 아래 참조)의 시간에 전에 수행 합니다.
5. 대 퇴 동맥 칼 집 및 플라스틱 카 테 터를 삽입 하 고 느슨한 0-실크 봉합 사로 고정. 일시적으로 전송 및 이미징 연구 동안 칼 및 카 테 터를 닫습니다. 추가 지침에 대 한 개 제품은 아래 참조).
6. 피 무에 대 한 사이트를 줄이려고 대 퇴 동맥 칼 집에 원심 그대로 피부를 통해 16G x 45 m m 정 맥 카 테 터를 삽입 합니다. 수술 노출으로 테를 사전 및 노출된 대 퇴 정 맥 동맥 칼 집에 인접 한에 입력으로 그것을 시각화. 일단 완전히 정 맥에 삽입, 바늘을 철회 하 고 3 방향 자 지와 테 모자 0.9% 멸 균 식 염 수의 2 mL와 함께 그것을 플러시. 0-실크 봉합 사를 피부에 카 테 터를 보호 합니다.
7. 바로 일반적인 경 동맥 영역 위에 직접 8-10 cm의 피부 절 개를 만들고 주변 조직에서 선박을 근 막 해 부.
8. 신중 하 게 경 동맥과 별도로 미주 신경 사이 겸을 소개 합니다. 경 동맥 혈관의 수축이 발생할 수 있습니다 이상 필요한 만지지 마십시오.
9. FeCl₃ 솔루션 희석을 피하기 위해 멸 균 거 즈와 동맥의 노출된 영역을 건조.
10. 장소는 도플러 흐름 조사를 건드리지 않고는 경 동맥 주위 탯 줄 테이프를 감아 혈액 속도 기록을 시작을 산보 공간이 경 주변 조사 흐름 및 절차 ( 상단그림 1 )를 통해 계속. 기록에 대 한 기준선 흐름 ~ 탯 줄 테이프를 적용 하기 전에 5 분.
    참고: 기준선 흐름 FeCl₃ 탯 줄 테이프 배치 하기 전에 일반적으로 평균 약 250 mL/min.
11. 준비 FeCl₃ 탯 줄 테이프 경 hemostat 흐름 조사 바로 아래를 사용 하 여 15 분, 제거, 및 삭제에 대 한 그것을 건드리지 않고 주위를 바꿈.
    참고: 폐색 제로 흐름 mL/min으로 지정 됩니다.
12. 신호를 유지 하는 데 필요한 조사를 45 분 추가 추가 염 분에 대 한 폐색 혈전을 안정화 합니다.
    참고: 연령에 따라 성별 및 준비 FeCl₃ 탯 줄 테이프의 개, 추가 게재 위치 유형에 필요할 수 있습니다 다시 신청 전에 발생 하는 폐색에 대 일 분을 허용. 차이가 성별 beagles에 제 2 철 염화 응용 프로그램에 의해 혈전 증에서 관찰 되었다. 그것은 필요한이 모델 신선한 FeCl₃ 탯 줄 테이프를 여러 번 다시 적용 하 고 있다 결코 FeCl₃ 탯 줄 테이프 준비 프로토콜에서 이탈을 찾지 못했습니다. 실험실에는 다른 품종 또는 개과,₃ 탯 줄 테이프 혈전 증 프로토콜 이탈 하지 않는, 또는 개 그룹 FeCl₃ 을 설정 해야 할 수 있습니다 다는 것을 확인 하는 초기 과목에 적용할 FeCl의 나이 사용 하는 경우 해당 품종 또는 특정 연구 그들의 나이 대 한 응용 프로그램 시간입니다. 오 번이이 실험, FeCl₃ 탯 줄 테이프 신청 후 8-30 분에 이르기까지.
13. 확인 하려면 획 또는 출혈 볼륨 약리학 내정간섭에서 발생할 수 있습니다 다운스트림 thromboembolic 이벤트 뿐만 아니라, 자기 공명 영상 기 (아래 참조에 추가 케 타 민 주입으로 개 전송 추가 처리).
14. 최종 혈관 촬영/MRI (이미징 프로토콜에 대 한 아래 참조), 유해 자극에 응답의 부족에 의해 표시에서 마 취의 깊은 수술 평면에서 나중에 분석을 위해 전체 혈액 수집 다음 갈비뼈를 통해 절단 하 여 가슴을 열고 흉 골, 그리고 소비는 심장 혈관 (exsanguination)를 절단 하 여 시작 합니다.
    참고:이 실험에서 전체 혈액 (< 10 mL) 넓 적 다리 칼 집에서 초기 계획, 에이전트 관리, 후 5 분 및 60 분 주입 후에 당겨 지 고 보았다 thrombolysis의 과정에 영향을 주지 않습니다. 희생에는 무제한 볼륨 그릴 수 있습니다 추가 플라즈마 저장용 동물 프로토콜에서 승인 하는 경우. 분석, 처리 하 고 희생의 30 분 이내 모든 전체 혈액을 저장 합니다. 승인 된 동물 프로토콜에 혈액으로 동물의 몸 무게의 승인된 비율 초과 그려 하지는 확인 하십시오. 설명 하는 모든 실험 비 복구 했다입니다.
15. 0.9% 식 염 수와 함께 마음을 헹 구 고 플래시 동결 액체 질소에 샘플 원하는 경우.
16. 고 년을 제거 하기 전에 그것과 기록 옆에 눈금자를 배치 하 여 응고 길이 측정 합니다. 조직학 트리밍에 쉽게 contralateral 경에 같은 장소에는 응고의 한가운데에 조직 마커를 놓습니다. 동일한 길이에서 contralateral 경을 표시 합니다.
    참고:이 모델 평균 응고 길이 1.75 cm입니다.
17. 두 혈관에 응고의 전체 길이 제거 하 고 10% 포 르 말린에 고정. 조직 감 적에 의해 표시 된 길이 내 contralateral 경 동맥을 제거 합니다. Contralateral 경 동맥 혈전의 중간에 반으로 잘라. 플래시는 향후 분석을 위해 액체 질소에 절반 contralateral 경 동맥을 동결 하 고 조직학 분석 아래 부상된 경 옆에 포함 10% 포 르 말린에 나머지 절반을 해결.
18. 어떤 원하는 분석에 대 한 장기를 제거, 플래시 동결 액체 질소에 0.9% 식 염 수와 린스.
19. 원형 뼈 톱으로 두개골을 제거 합니다. 천천히 아래 뇌 손상 없이 두개골을 제거 합니다.
20. 두뇌는 두개골에서 제거 되, 감기 0.9% 염 분에서 그것을 씻어 하 고 날카로운 메스와 옆으로 절단 하는 두뇌의 중간에서 4mm 섹션과 잘라. 2%로 4 m m 섹션 중 하나를 장소 TTC 허 혈 성 경계 (두뇌 TTC에 대 한 처리 추가 참조)에 대 한 다른 슬라이스 7 일 H & E 염색 (H & E 뇌에 대 한 추가 처리 참조)에 대 한 10% 포 르 말린에 배치 하는 동안.

3. 개 혈관

참고:이 그림 2 에 표시 되 고 관심의 시간 지점에서 수술 동안 이루어집니다.

1. 오른쪽 사 타 구니 지역에서 펄스에 대 한 느낌과 3-5 cm 복 부 화살 절 개를 하 게.
2. 대 퇴 동맥을 노출 하 고 무딘 해 부를 사용 하 여 주변 조직에서 분리.
3. 직각 hemostat 노출된 동맥의 말 초 끝 주위 0-실크 봉합 사를 사용 합니다.
4. 원심 0-실크 봉합 사 고 hemostats와 피부에 느슨한 0 비단 봉합 끝 클램핑 함으로써 동맥에 약간의 긴장을 적용.
5. 두 번째 0-실크 봉합 사 노출된 세그먼트의 인접 끝 주위를 놓습니다.
6. 동맥에 가이드 와이어를 통과 하는 18 G 중개자 바늘을 사용 하 여 인접 및 원심 0 비단 봉합 관계 사이 동맥 미드웨이 찔린 합니다.
7. 로드는 조립된 6Fr 칼 가이드 와이어, 와이어 어셈블리에서 종료로 파악에 팽창 합니다.
8. 가이드를 통해 팽창과 칼 집 사전. 그것은 팽창 칼 집 어셈블리 발전 하면서는 팽창에서 돌출 철사의 확고 한 이해를 유지할 수 있는지 확인 합니다.
9. 완전 삽입 후 동맥 펑크 사이트에 hemostasis 유지 하기 위해 칼 집 주위 근 0-실크 봉합 넥타이.
10. 동시에 팽창 및 가이드 와이어를 제거 합니다.
11. 단방향 밸브 타악기 혈액 흐름의 존재를 확인 하 고 정상적인 염 분의 3-5 mL으로 플러시를 엽니다.
12. 채워진된 확장 라인 모니터 및 기록 서 혈압 측정 압력 변환기에 연결 된 액체에 액세스 덮개 단방향 밸브를 연결 합니다.
13. 4Fr. angiographic 카 테 터에 0.35"가이드 와이어를 미리 로드 하 고 대비 주입 매니폴드 Tuohy y-어댑터 설정에 연결 합니다.
14. 카 테 터의 원심 끝 내 가이드 와이어의 끝을 당겨 하 고 염 분으로 전체 어셈블리를 플러시.
15. 칼 집의 hemostatic 밸브에 angiographic 카 테 터를 삽입 하 고 사전 가이드 와이어 원심 카 테 터 팁 넘어 약 5 cm.
16. Fluoroscopic 지도 및 역행 트랜스 대동맥 방식을 사용 하 여, 천천히 대동맥 아치에 테 사전.
17. Brachiocephalic 트렁크의 이륙 식별 하는 일반적인 염 분으로 대비 희석 에이전트 1: 1의 2-3 mL를 주사.
18. 가이드 와이어를 사용 하 여 brachiocephalic 트렁크에는 카 테 터를 직접 그리고 바로 일반적인 경 동맥에 선택적으로.
19. 가이드 와이어를 제거 하 고 카 테 터는 경 동맥에 배치 됩니다 확인 하려면 희석된 대조의 2-3 mL를 주입.
20. Angiographic 실행 디지털 빼기 및 표준 angiographic 기술을 사용 하 여 기록 하는 동안 undiluted 대비의 3-4 mL를 주사.
21. 추가 시간 지점에서 반복된 혈관에 대 한 3.18-3.21 단계를 반복 합니다.

4. 자기 공명-확산 가중치 이미징 (뒤)과 t 2가 개 뇌의 (T2WI) 이미징

참고:이 그림 3A에서 표시 됩니다-3B.

1. 개가 깊은 마 취 인지 확인 합니다.
2. 강아지의 생리 적 매개 변수는 심전도 심장 박동을 포함 하 여 영상에 걸쳐 모니터링 있는지 확인 합니다.
3. 개는 뇌 코일의 양자 구멍에서 머리와 부정사 위치에 거짓말을 확인 합니다.
4. 3 테슬라 (3T) 자석 사용.
5. T 2가 중 영상 (T2WI), MRI에서 기본 펄스 시퀀스를 수행 합니다.
   참고: 시퀀스 다른 병 적인 조건에서 조직의 T2 이완 시간에 차이 사용 하 여.
6. T 2가 중 기온 변화도 에코 순서를 이미지를 사용 하 여 해 부 영상 전에 개 뇌의 파일럿 이미지 이미징 지역화를 수행 하 고 시야 (FOV), 분할 영역 및 슬라이스 두께 두뇌를 완전히 커버 하는 수를 결정 합니다.
7. 다음 T2-매개 변수를 사용 하 여: 슬라이스 두께 3 m m, TR = = 4000 석사, 테 75 ms, ETL = = 7, 인수 매트릭스 320 x 256, FA = = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 픽셀, 이미지 해상도 mm 당 2.4615 픽셀 =.
8. 보급이 중 영상 (뒤) 후 MCA 폐색 및 희생 직전 에코 평면 DTI 시퀀스 4 h를 사용 하 여 수행 합니다.
9. 다음 뒤 매개 변수를 사용 하 여: b = 1500 s/m m², 슬라이스 두께 3 m m, TR = = 4600 석사, 외 = 86 석사, ETL 55, 인수 매트릭스 = 140 x 140, FA = = 90ᵒ, FOV 231 x 257, 이미지 해상도 = = 0.9333 픽셀/m m (표 1).

5. hematoxylin 및 오신 (H & E) 개 뇌의 얼룩

참고:이 그림 3D에 표시 됩니다.

1. 7 일 후에 10% 포 르 말린, 파라핀에 4mm 뇌 섹션을 포함 합니다.
2. 때까지 그들은 뇌 조직 위에서 어떤 추가적인 파라핀을 제거 하는 톰으로 수준 다음 뇌 조직을 4 µ m에서 잘라내어 한 뇌 섹션 각 2 "x 3" 인치 슬라이드에 파라핀 블록을 잘라.
   주: 얼룩, 전에 두고 모든 솔루션 별도 용기에 슬라이드 밖으로 건조 하지 않고 다른 하나의 솔루션에서 이동할 수 있도록.
3. 드 paraffinize 각 뇌 슬라이드 및 수돗물 수 화.
4. 8 분 되며 560에 각 두뇌 슬라이드를 배치 합니다.
5. 린스 수돗물에 각 두뇌 슬라이드.
6. 각 뇌 슬라이드 1% 차별화 산 알코올 1 s 세 번.
7. 린스 수돗물에 각 두뇌 슬라이드.
8. 1 %1에 대 한 수산화 암모늄과 각 뇌 슬라이드 블루 s.
9. 각 뇌 슬라이드 실행 2 분 동안 수돗물에 씻어.
10. 70%에 각 두뇌 슬라이드를 탈수 에탄올 (EtOH) 1 s 12 번.
11. 1 분 동안 오신 각 뇌 슬라이드 counterstain
12. 95%에서 각 뇌 슬라이드를 탈수 1 EtOH s 12 번.
13. 100%에 각 두뇌 슬라이드를 탈수 EtOH.
14. 크 실 렌에 각 두뇌 슬라이드를 취소 하 고 그것이 수 설치 미디어와 공기 방울을 제거 뇌 슬라이드 위에 2 "x 3" 인치 coverslip 적용 합니다.
    참고: 모든 솔루션은 얼룩의 여러 날, 여러 슬라이드에 대 한 물과 에탄올을 제외 하 고 다시. 유리 항아리, 얼룩에 행해진다 뇌 섹션 슬라이드에 배치 됩니다 후에 모든 처리 하지만 플라스틱 착 색 용기 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 변색 되는 경우 어떤 솔루션을 장착 하 고 엄격 하 게 적용.

6. hematoxylin 및 오신 (H & E) 개 년의 얼룩

참고:이 그림 1 (왼쪽)에 표시 됩니다.

1. 10% 포 르 말린에 24-72 h, 후 부상된 경 동맥 혈전의 중간에 반으로 자르고 포함 ~ 1cm 부상된 경와 ~ 같은 파라핀 카세트에 contralateral 컨트롤의 1 cm.
   참고:은 경 동맥 내 혈액 응고는 깨지기 쉬운. 배는 응고 방해 하지를 절단 하기 전에 10% 포 르 말린에 수정 되었습니다 때까지 기다립니다. 모두 부상 포함 하 고 경 동맥을 제어 같은 파라핀 블록 있게 됩니다 절단 동시에 혈관에 같은 장소에서.
2. 톰, 어떤 추가적인 파라핀 제거와 파라핀 블록 수준까지 트림. 그럼 contralateral 경 섹션에서 슬라이드의 위쪽에 배치 됩니다 있도록 파라핀 블록을 회전 하지 않고 25 x 75 mm x 1 mm 슬라이드에 4 µ m에서 섹션을 잘라.
   참고: 각 슬라이드에 3 경 섹션 배치 하지만 하나 얼룩의 관심에 따라 추가할 수 있습니다.
3. -각 경 슬라이드 paraffinize 하 고 수돗물에 수 화.
   참고: 개별적으로 처리 해야 하는 뇌 슬라이드와 달리 경 슬라이드 처리할 수 있습니다 대량에 서로 건드리지 않고 한 번에 여러 슬라이드를 맞는 항아리에 배치 하 여.
4. 각 경 슬라이드 8 분 hematoxylin에 얼룩.
5. 린스 수돗물에 각 경 슬라이드.
6. 각 경 슬라이드 1% 차별화 산 알코올 1 s 세 번.
7. 린스 수돗물에 각 경 슬라이드.
8. 1 %1에 대 한 수산화 암모늄과 각 경 슬라이드 블루 s.
9. 각 경 슬라이드 실행 2 분 동안 수돗물에 씻어.
10. 70%에 각 경 슬라이드를 탈수 1 EtOH s 12 번.
11. 오신 또는 1 분 각 경 슬라이드 counterstain
12. 95%에서 경 각 슬라이드를 탈수 EtOH 1 s x 12.
13. 100%에 각 경 슬라이드를 탈수 EtOH.
14. 크 실 렌에 경 각 슬라이드를 취소 하 고 기포를 제거 하 수 설치 미디어와 함께 24 m m x 50 m m coverslip 추가.

7. 2,3,5-triphenyl-2 H-tetrazolium 염화 (TTC) 개 뇌의 얼룩

참고:이 그림 3C에 표시 됩니다.

1. 장소 이전에 H & E 섹션에 즉시 인접 두뇌의 중간에서 4mm 섹션 제거 준비 2 %TTC (경 동맥 폐색). 선회도 마다 5 분을 얼룩이 지기 위한 뇌 섹션 적어도 20 분 동안 37 ° C에서 어둠 속에서 품 어.
   참고: 20 분 후 섹션 양쪽 모두 빨간 체리를 이어야 한다. 추가 시간 TTC 신선도 및 조직 단면도의 두께에 따라 필요할 수 있습니다.
2. TTC 솔루션을 제거 하 고 4% paraformaldehyde PBS, pH 7.4 색상 대비를 최적화 하기에 바꿉니다.
3. 백색과 빨강 얼룩이 사이의 대비 최적의 때 허 혈 성 지역의 추적에 대 한 높은 해상도에서 투명 한 플라스틱 시트, 초과 하는 액체의 건조 및 스캔 사이 TTC 뇌 조각 장소.
   참고: 섹션에에서 저장할 수 있습니다 무기한 paraformaldehyde 솔루션, 하지만 얼룩이 사라질 것 이다.

결과

여기 자세한 절차를 수행 하는 것은 폐색 동맥 내정간섭의 예방 또는 thrombolytic 평가에 사용할 수 있는 모델 개발 귀 착될 것 이다. 전에, 하는 동안, 그리고 상용 소프트웨어에 의해 기록 된 치료 후 그림 1A 기준선 흐름 속도 결과 혈액 흐름 속도 보여줍니다. 이 녹음에서 데이터는 경 동맥 상해와이 개 모델에서 치료 재 관류의 비율을 결정 하기 위해 ...

토론

FeCl₃ 유도 혈관 상해 모델 작은 동물에서 혈전 증 연구에 널리 이용 되 고 다양 한 장점 가진 큰 동물, 전 임상 모델을 변환 하기 쉽습니다. 한 개에는 프로토콜에 맞게 약간의 수정을 허용 약리학 내정간섭 및 선박 수로 화 하기 전에, 평가 제품은 후 뇌졸중과 출혈 볼륨을 평가 하 두 자기 공명 영상 활용 중, 고 후 치료. 다른 thrombotic 큰 동물 모델 부상의 사이트에서 안정화 폐색 혈전을 공?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/8” umbilical tape	Jorgensen Laboratories Inc.,	#J0025UA	for ferric chloride application
4% paraformaldehyde in PBS	Alfa Aesar	AAJ61899AP
10% neutral buffered formalin	Richard-Allan Scientific	5701
2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4)	Sigma Aldrich	T8877
ADP/Collagen cartridges	Siemens Diagnostics	B417021A
4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer	Becton Dickinson	BD 369714
4.5 ml lithium heparin vacutainer	Becton Dickinson	BD 368056
EDTA K3 vacutainers	Becton Dickinson	BD455036
Doppler flow probe	Transonic Systems Inc	MA2.5PSL
Hematoxylin 560	Surgipath	3801570
Eosin	Surgipath	3801602
LabChart Software	ADInstruments Inc.
Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet	Siemen's Diagnostics
Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe)	NovaPlus	402525D
HUG-U-VAC positioning system	DRE Veterinary	1320