에탄올을 이용한 자 궁 경부 교감 신경 절 블록 응용 프로그램 사용 하 여 인공 신경 개 열 등 한 치조 신경 재생 촉진을 위한

요약

우리는 신경 수리 인공적인 신경 도관을 사용 하 여 자 궁 경부 교감 신경 절 차단의 효과 평가 합니다. 남성 비글 개 했다 각 이식 한 인공 신경 왼쪽 열 등 한 치조 신경; 10 m m 간격에 걸쳐 왼쪽된 자 궁 경부 교감 신경 절의 주입에 의해 차단 되었다 측면 thoracotomy 통해 99.5% 에탄올.

초록

Polyglycolic 산 콜라겐 (PGA-C) 튜브는 얇은 콜라겐 필름으로 구성 된 바이오 흡수 신경 튜브 멀티 챔버 구조의 콜라겐 가득 있습니다. 유리한 임상 결과 손상 된 열 등 한 치조 신경 (이 안)의 치료에 대 한 이러한 튜브를 사용 하 여 달성 되었습니다. PGA-C 튜브를 사용 하 여 성공적인 신경 재생에 대 한 중요 한 요인은 주변 조직에 혈액 공급 이다. 자 궁 경부 교감 신경 절 블록 (CSGB) 따라서 영역에 혈액 흐름을 증가 하는 머리와 목 지역에 동 정적인 봉쇄를 만듭니다. 적절 한 효과 보장 하기 위해 봉쇄 관리 되어야 합니다 현지 마 취약으로 여러 연속 주; 하루에 1 ~ 2 배 이것은이 기술 조사에 대 한 동물 모델을 만들 때 도전 포즈. 이 한계를 해결 하기 위해 우리는 장기 증가 orofacial 영역에 혈액 흐름에서의 개 모델에서 에탄올 유발 CSGB 개발. 우리 검사 여부 PGA C 튜브 주입을 통해이 안 중생이이 모델에 의해 강화 될 수 있다. 14 Beagles 했다 각 이식 PGA C 튜브 왼쪽된이 안에 10 m m 차이 걸쳐. 이 안은 뼈로 둘러싸인 악의 운하, 따라서 우리가 선택 압 전 수술, 초음파 뼈 처리, 신경 및 혈관 손상의 위험을 최소화 하기 위해 구성 된. 좋은 수술 결과이 방식으로 얻은 것입니다. 수술 후 1 주일이 개 7 에탄올의 주입에 의해 왼쪽된 CSGB를 받게 했다. 에탄올 유발 CSGB 결과 향상 된 신경 재생, 증가 혈액의 흐름 효과적으로 안 결함에 신경 재생을 촉진 하는 것을 건의. 이 개 모델 CSGB의 장기 효과 대 한 더 연구에 기여할 수 있다.

서문

많은 경우에, 열 등 한 치조 신경 (이 안)의 외상 성 상해가 이다 의원 성, 세 번째 어 금 니의 추출 또는 치과 임 플 란 트^1,2,3의 배치에 의해 자주 발생 되 고. 이의 부상 열에 적자 이어질 하 고 감각으로 감각 이상, dysesthesia, hypoesthesia, 및 용어인 터치 수 있습니다. 신경 손상 뿐만 아니라 보수적인 치료로 뿐만 아니라 다른 방법, 봉합 등 autograft 배치에 의해 처리 됩니다. 그러나, 이러한 방법은 종종 증상 개선 및 기증자 사이트^4,,56신경 결함의 부족을 포함 하는 단점이 있다.

인공 신경-polyglycolic 산-콜라겐 (PGA-C) 튜브 원래 일본에서 개발 되었다. 그것은 그것의 내부 루멘 가득 해 콜라겐⁷과 바이오 흡수 관입니다. 동물 실험에서이 관 그리고 비 골 신경 결함, 비글 개에 있는 신경 재생을 향상 시키기 위해 사용 홍보 헌 신경 이식⁸보다 복구의 높은 수준을 표시 했다. PGA-C 튜브의 임상 응용 주변 신경 상해 환자에서 2002 년에 시작 했다. 또한, 유리한 임상 결과 trigeminal 신경 장 해 (이 안 및 언어 신경)^9,,1011의 치료에 달성 되었습니다. PGA-C 튜브를 사용 하 여 성공적인 신경 재생에 대 한 중요 한 요인은⁸주변 조직 혈액 공급 이다. 자 궁 경부 교감 신경 절 블록 (CSGB) 머리와 목 지역에 공감 봉쇄를 생성 하 고 각각 innervated 지역¹²; 혈액 흐름을 증가 따라서, 그것은 복잡 한 지역 통증 증후군 및 순환 불충분^13,,1415의 치료에 사용 되었습니다. 그러나, 증가 혈액 흐름^16,17에 몇 가지 실험에 대 한 조사 효능 CSGB의 되었습니다. 적절 한 CSGB 효율성을 보장 하기 위해 봉쇄 적용 되어야 한다 현지 마 취약 한 두 번 함께 매일 몇 주 동안이 기술을 조사 하기 위해 동물 모델을 생성할 때 따라서 도전 포즈. 이전 연구에서이 한계를 해결 하기 위해 우리는 장기 증가 혈액의 흐름이 orofacial 지역¹⁸개 모델을 개발 했다. 모델 한 CSGB 주입 하 여 수행 하 여 생성 된 에탄올 99.5%. 우리는 구강 점 막 혈 류 및 레이저 도플러 flowmetry 및 12 주 동안 일주일에 한 번씩 적외선 온도 기록에 의해 비 강 피부 온도 평가합니다. 우리는이 모델에서 7-10 주 동안 orofacial 영역의 혈액 흐름 증가 했다 발견.

현재 연구에서 우리는 신경 재생에 에탄올 유발 CSGB의 효과 평가.
PGA-C 튜브 왼쪽된이 안에 10 m m 간격에 걸쳐 비글 개에 이식 했다. 1 주일 후, CSGB 에탄올을 주입 하 여 수행 되었다. 수술 후 3 개월 우리 신경 재생에 CSGB의 효과 평가 하기 위해, 조직학, electrophysiological 및 형태학 연구의 다양 한을 수행 합니다. 우리는 PGA C 튜브 및 에탄올 유발 CSGB 사용 하 여이 재건에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

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프로토콜

이 연구는 관심과 동물의 사용에 대 한 원칙에 따라 실시 되었고 교토 대학교의 동물 연구를 위한 위원회에 의해 승인 (교토, 일본; 승인 번호: R-16-16). 동물의 고통을 최소화 하기 위해 모든 노력 했다 그리고이 보고서의 모든 섹션에 도착을 준수 (동물 연구: Vivo에서 실험의 보고) 지침.

1. PGA C 튜브의 제조

1. 48 스핀 들 및 26 필 라 멘 트 (그림 1)¹⁸의 번들으로 구성 된 5 개의 PGA 섬유 관 끈 기계를 사용 하 여 흡수 polyglycolic 산 (PGA) 튜브에 의하여 인공적인 신경 도관을 조작.
2. PGA 튜브 표면 친수성 렌더링, 플라즈마 방전에 노출.
3. 1 %v / w atelocollagen를 사용 하 여 염 산 염 솔루션⁷.
   참고: Atelocollagen 효소 처리를 통해 돼지 피부에서 추출 하 고 바이러스 검사를 받게 됩니다. 그것은 주로 이루어져 있다 유형 I (70-80%) 하 고 유형 III 교원 질,이 비율은 다른 곳에서 자세히 설명 되어⁷. 1 g 콜라겐 100 mL 염 산 용액에 용 해 하 여 콜라겐 솔루션 준비 (pH = 3.0). 염 산 해결책의 밀도 약 1.0 이므로, w/w 콜라겐 농도 거의 1%.
4. 반복 5 위한 1% 콜라겐 염 솔루션으로 그것을 찍기 하 여 콜라겐 레이어와 튜브 코트 s 각 시간.
   1. 찍기, 후 실 온에서 깨끗 한 벤치에 튜브를 건조. 튜브가 완전히 건조 (약 6 공기에 대 한 h)를 확인 한 후 다음 찍기 수행 합니다.
   2. 코팅 과정 10 회 반복 한다.
5. 바이오-흡수와 콜라겐 분자의 가교를 제어 하기 위해 진공 (dehydrothermal 치료)에서 24 시간 동안 140 ° C에 PGA C 튜브를 주제. 무 균 조건 하에서 전체 프로세스를 수행 합니다.
   참고:이 절차는 마지막 길이 14 m m, 내경 3 m m, 및 50 μ m 벽 두께의 튜브를 생성합니다.

2. 수술 절차 설정

1. 성인 남성 beagles 9.0 13.0 k g를 사용 합니다.
   1. 제어 개 집 조건 (12-h 빛과 어둠의 사이클)에서 별도 장에서 집 동물.
   2. 단단한 음식을 제공 하 고 광고 libitum물.
2. Beagles 무게.
3. 오토 클레이 브 모든 수술 기구.
4. 멸 균된 장갑 하 고 80% 에탄올 솔루션 운영의 모든 표면 소독. 삭제 사용된 장갑.
5. 외과 손 씻기를 수행 합니다.
6. 신선한 마스크, 가운, 멸 균 장갑에 넣어.

3. 마 취와 피부 준비

1. 근육 주사 하 여 5 mg/kg 케 타 민 염 산 염과 1 mg/kg xylazine의 혼합물으로 개를 anesthetize.
2. 7.5 m m 직경 및 25 cm 길이의 tracheal 튜브로 넣어야.
3. 오른쪽 측면 위치에 개를 놓습니다. 3.2 %sevoflurane 산소 (1.0 L/min)와 전신 마 취를 유지 합니다.
4. 37 ° c.에 온도 유지 하기 위해가 열 패드를 사용 하 여
5. 각 막 찰과상을 피하기 위해 눈의 앞쪽 표면에 안과 젤을 적용 합니다.
6. 조심 스럽게 면도 수술가 위를 사용 하 여 수술 필드 (왼쪽 가슴 영역). 요원 사이트를 통해 상당한 양의 알코올 솔루션 스프레이. 3 번 반복 응용 프로그램이 최소 15 초를 기다립니다.
7. 심장 박동 및 수술 중 산소 포화를 기록 합니다.

4. 열 등 한 치조 신경 재건을 사용 하 여 PGA-C 튜브: 재건 전용 모델의 개발

1. 1 %lidocaine 왼쪽된 악의 gingiva에 27g 바늘을 사용 하 여 로컬 마 취 및 진통제로 서의 3 mL를 주사.
2. 동물의 mandibles 노출 왼쪽된 악의 gingiva에 번호 15 메스 블레이드 5 cm 가로 절 개를 수행 합니다.
3. 압 전 초음파 진동 후부 정신 구멍을 통해 3 c m × 8 m m 사각형으로는 mandible의 근 위 부분을 사용 합니다.
   참고: 진동 주파수는 28 \u2012 32 kHz.
4. (치수, 3 cm × 8 m m) 왼쪽된이 안 (그림 2A)¹⁸노출 하 악의 뼈 격판덮개의 정면 부분을 제거 합니다.
   참고: 첫 번째 어 금 니의 뿌리 정점에 해당 하는 개조 사이트
5. 10 m m 세그먼트를 제거 하는 메스와 IAN transect
6. 2 m m의 깊이에 신경 관에 절단된 신경의 근 위 및 원심 젊고 아름 다운 여자를 삽입 합니다.
7. 8-0 나일론 봉합 하 고 수술 현미경 8 배 확대에 인접 하 고 말 초 신경 끝 (그림 2B)¹⁸에 튜브를 봉합을 사용 합니다.
8. 뼈 격판덮개는 mandible에서 원래 사이트에 반환 합니다.
9. 4-0 나일론 봉합 상처를 닫습니다.
10. 수술 후 어느 날 악의 뼈 격판덮개의 적절 한 위치에 제공 하는지 확인 합니다.
    1. 4.10.1 마 취 얼굴 뼈의 단층 촬영 (CT) 영상을 수행 합니다. CT 매개 변수를 다음과 같이 설정: 120 kVp, mAs 200, 0.5 m m/s, 0.5 m m 슬라이스 두께.
       1. 5 mg/kg 케 타 민 염 산 염과 1 mg/kg xylazine (그림 3)의 혼합물을 사용 하 여 마 취를 관리 합니다.
11. 수술 후 일주일 동안 진통제로 항생제 및 아 세트 아미노 펜 (100 mg/day)로 서 암 피 실린 (100 밀리 그램/일)를 관리 합니다.

5. 에탄올 유발 CSGB: 개조 + CSGB 모델의 개발

1. 섹션 4에서에서 설명한 대로 안 재구성을 수행 하 고 복구에 대 한 주를 허용 합니다.
2. 산소 (4 L/min)과 공기 (6 L/min)에서 1.5 %sevoflurane 동물 anesthetize 면도 하 고 섹션 3에에서 설명 된 대로 원하는 수술 필드를 청소.
3. 왼쪽 가슴 위치에 선을 그려 절 개 라인 피부 표시와 함께 표시 (그림 4, 절 개 라인은 길이 20 cm).
4. 1 %lidocaine 왼쪽 가슴 지역에 21 G 바늘을 사용 하 여 로컬 마 취 및 진통제로 서의 5 mL를 주사.
5. 번호 10 메스 블레이드와 왼쪽 가슴 피부를 incise.
6. 근육 근 막 폭로 하는 전기 메스로 지방 레이어 incise
7. Serratus ventralis 근육 및 scalenus 근육을 노출 합니다.
8. Serratus ventralis 근육 및 scalenus 근육: 복 부를 두 번째 및 세 번째 갈비뼈 (그림 5) 노출 등을 올립니다.
9. 두 번째 및 세 번째 있는 공간 왼쪽된 자 궁 경부 교감 신경 절 (그림 6) 노출에 왼쪽된 측면 thoracotomy를 수행 합니다.
10. 직접 시각화 (그림 7)에서 30 G 바늘을 사용 하 여 자 궁 경부 교감 신경 절에 99.5% 에탄올의 0.2 mL를 주사.
11. 중단 된 1-0 흡수 바늘 있는 공간을 닫습니다.
12. 중단 된 3-0 나일론 바늘으로 피부를 닫습니다.
13. 수술 후 일주일 동안 진통제로 항생제 및 아 세트 아미노 펜 (100 mg/day)로 서 암 피 실린 (100 밀리 그램/일)를 관리 합니다.
14. CSGB 후 1 주에는 CSGB 것인지 적외선 thermography로 얼굴 피부 온도 측정 합니다.

6. electrophysiological 녹음

1. 감각 신경 활동 전위 (SNAP) 및 감각 신경 전도 속도 (SCV)은 IAN의 재건 후 3 개월 측정, 섹션 3에에서 설명 된 대로 동물을 anesthetize.
   참고: 스냅 및 SCV는 실험 하 고 일반 컨트롤 양쪽에 두 처리 그룹에 있는 각 개에 대 한 측정 되어야 한다.
2. 번호 10 메스 칼 날 왼쪽된 악의 gingiva에 절 개를 확인 합니다.
3. 신중 하 게 물리적으로 재생성 된 신경의 손상을 방지 하려면 악의 뼈 플레이트를 제거 합니다.
4. 스냅 및 SCV 기록 바늘 전극의 쌍을 사용 하 여이 자극.
   1. 신경 도관에 proximally 전극 삽입 합니다.
   2. 20 번 10 kHz 전기 자극을 적용 합니다.
5. 결과 분석 합니다.
   1. 전기 자극에 평균 응답 진폭을 계산 하 여 스냅인을 결정 합니다.
   2. 최대 대기 시간 및 차트 녹음에서 피크 진폭을 측정 합니다.
   3. 다음 방정식으로 복구 인덱스 계산: 재건 전용의 왼쪽된이 안의 피크 진폭 또는 개조 + CSGB 정상적인 제어 (재건 전용 그룹에 오른쪽이의 중앙 세그먼트)의 그룹 / 피크 진폭^{19 ,20}.

7. 조직학 분석

1. 섹션 준비
   1. 3 개월 후에 재건, 왼쪽된이 안, 재건축된 사이트의 어느 한쪽에 신경의 1 cm를 포함 하 여 수확.
   2. 수확 수확 사이트 왼쪽에 해당 하는 수준에서 오른쪽이 안.
   3. 2.5%도 0.1 m M cacodylate 버퍼 솔루션 (pH 7.4, 48 ° C, 24 h)에 있는 침수에 의해 수확된 신경의 접두사.
   4. 2% 오스뮴 tetroxide 솔루션 (48 ° C, 4 h)와 칼륨 ferrocyanide 0.1 M 인산 염 버퍼 솔루션 (pH 7.4, 2 시간) 후 위.
   5. 탈수의 등급된 에탄올 솔루션 시리즈와 함께 신경.
   6. 에폭시 수 지 (파라핀)에 포함 합니다.
   7. 섹션 두께 0.5 \u2012 1.0 μ m의 표본.
2. 톨루이 블루 얼룩 및 형태소 분석
   1. 톨루이 블루 솔루션 섹션을 얼룩.
   2. 현미경 이미지는 샘플에 따라 다음 지역에 400 배 확대에 광학 현미경을 사용 하 여 얻을: 왼쪽이 안, 재생성된 세그먼트와 distally를 뽑았; 2 mm의 센터 오른쪽이 안, 수확 사이트 왼쪽에 해당이 안 세그먼트의 중심
   3. 재생성 된 신경 섬유와 모든 영역의 이미지를 선택 합니다.
      1. 임의로 선택 8 \u2012 10 영역 100 μ m × 100 μ m를 포함 하는 신경 섬유를 생성.
      2. 다음 매개 변수를 측정 하는 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 형태소 분석을 수행: myelinated 신경 섬유 직경 (μ m) 및 밀도 (수/지역), 신경 조직, 비율과 G 비율 (myelinated 축 삭 직경/myelinated 신경 섬유 직경 ).
3. Immunostaining
   1. 파라핀 섹션 얼룩에 대 한 표준 프로토콜을 따릅니다.
   2. 25 ° c.에 30 분 동안 1 차 항 체로 품 어
   3. 25 ° c.에 3 회 인산 염 버퍼 식 염 수로 세척
   4. 25 ° c.에 30 분 동안 양 고추냉이 과산화 효소와 함께 표시 하는 2 차 항 체로 품 어
   5. 가벼운 현미경을 사용 하 여 이미지를 얻을.
4. 전송 전자 현미경 (TEM)
   1. 7.1 단계에서 설명한 대로 신경 준비.
   2. 70 \u2012 90 μ m는 ultramicrotome를 사용 하 여 두께 섹션 신경
   3. Reynold의 리드 시트르산과 uranyl 섹션을 얼룩.
   4. 검토 하 고 전송 전자 현미경 이미지.

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결과

우리는 왼쪽된 CSGB (그림 8) 후 1 주 차단된 측면의 얼굴 피부 온도 있는 증가 관찰 했다.

3 개월 후 재건에서 재건에 PGA C 튜브 흡수 되었다 하 고 열 등 한 치조 신경의 재생 재건 전용에서 관찰 되었다 개조 + CSGB 그룹 (그림 9A, B)¹⁸.

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토론

우리 함께 에탄올 유발 CSGB bioabsorbable 신경 튜브를 사용 하 여이 안 중생에 대 한 효율적인 방법 제시. 이 연구에 대 한 우리 개, 이후 사용 다른 동물 모델 같은 쥐, 쥐, 토끼, 짧은 수명과 작은 바디 크기, 있고 따라서 정확한 수술 절차를 수행 하는 데 사용할 수 없습니다. 로이 안은 뼈로 둘러싸인 악의 운하, 수술 기법 신경 재건을 수행할 때 신경 및 혈관의 손상을 방지 하는 데 필요한입니다. 절?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
NMP Collagen PS	Nippon Meatpackers	301-84621	Atelocollagen extracted from young porcine skin by enzyme treatment
Surgical clippers	Roboz Surgical Instrument Company	RC-5903
Disposable scalpel (No.15)	Kai medical	219ABBZX00073000
VarioSurg3	Nakanishi	VS3-LED-HPSC, E1133	Piezoelectric surgery for bone processing
4-0 nylon sutures	Ethicon	8881H
8-0 nylon sutures	Ethicon	2775G
Isepamicin sulfate	Nichi-Iko	620005641
Disposable scalpel (No.10)	Kai medical	219ABBZX00073000
30-gauge needle	Nipro	1134
1-0 absorbable stitches	Ethicon	J347H
3-0 Nylon stitches	Ethicon	8872H
Neo Thermo	NEC Avio	TVS-700	Infrared thermography
Neuropack Σ	NIHON KOHDEN	MEB-5504	Orthodromic recorder for electrophysiological recording
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Light microscope	Keyence	BZ-9000
Mouse anti-human neurofilament protein monoclonal antibody	DAKO	N1591
Polyclonal rabbit anti-S100 antibody	DAKO	Z0311
Transmission electron microscopy	Hitachi High Technologies	Hitachi H-7000
Dynamic cell count	Keyence	BZ-H1C	Software for morphological evaluation