살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

요약

살 모 넬 라 종 /Shigella 종 설사에 기인 하는 일반적인 병원 체. 여기, 우리는 살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼을설명/Shigella 종 실시간 PCR를 사용 하 여 결합 가이드 문화.

초록

급성 위장염의 지저분한 구두 전송 시간, 특히 때 감염 발생 합니다 음식과 물을 처리 하는 사람들은 살 모 넬 라 종/Shigella 종에 의해 살 모 넬 라 종/Shigella 종의 검출을 위한 표준 방법은 직접 문화 이지만 노동 집약 및 시간이 걸리는. 여기, 우리가 살 모 넬 라 종/Shigella 종 검사, 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 가이드 문화를 함께 사용 하 여에 대 한 높은 처리 플랫폼을 설명 합니다. 두 가지 주요 단계가 있습니다: 실시간 PCR와 인도 문화. 우리 방법의 각 단계를 설명 하는 첫 번째 단계 (실시간 PCR)에 대 한: 컬렉션, 사전 농축, DNA 추출 및 실시간 PCR. 실시간 PCR 결과 긍정적인 경우 (가이드 문화) 2 단계 수행 됩니다: 선택적 문화, 생 화 확 적인 식별 및 serological 특성화. 우리는 또한 그것에서 생성 하는 대표적인 결과를 보여 줍니다. 여기에 설명 된 프로토콜의 살 모 넬 라 종, 특정, 민감한 빠르고 높은 처리량 검열을 위한 가치 있는 플랫폼 될 것 이라고 /Shigella 종

서문

설사 아직도 높은 발생률과 일반적인 건강 문제는 세계적으로^1,2율입니다. 일부 환자 (예: 느슨한과 물 변, 화장실에가 서 긴급), 주에 대 한 다양 한 증상을 보여 사망률은 상대적으로 낮은 사회 경제적 영향 매우 높은^3,4하 게 하는. 더 심각 하 게, 일부 환자도 치료⁵경우 과민성 대 장 증후군을 개발할 수 있습니다. 박테리아, 바이러스 및 설사⁶을 일으킬 수 있는 기생충의 다양 한 종류가 있다입니다. 살 모 넬 라 종 /Shigella 종 급성 위장염^7,,89,,1011의 전송에 대 한 가장 흔한 박테리아 중입니다. 따라서, 많은 군 법률이 나 규정 일반 살 모 넬 라 종 발행Shigella 종 음식과 물을 처리 하는 사람들 중 심사 /. 예를 들어 중국 정부 의무 살 모 넬 라 종에 대 한 법률을 발행 했다 /Shigella 종 심사는 일년에 한 번.

살 모 넬 라 종에 대 한 표준 방법 /Shigella 종 탐지는 박테리아 문화. 박테리아 문화 및 연속 생화학 식별 및 혈 청 학적인 특성을 통해 질병 발발 관리 및 항균 프로 파일링 응급 환자 치료를 촉진 수 있는 박테리아의 종류를 확인할 수 있습니다. ¹². 그것은 또한 살 모 넬 라 종 중 감염의 소스를 추적 도움이 수 /Shigella 종 발발¹³. 그러나,이 방법은 노동 집약 (필요한 수동 작업) 고 시간이 (몇 일), 특히 많은 수의 샘플⁷의 테스트에 대 한입니다. 또한, 비-culturable (VBNC) 살 모 넬 라 종 하지만 가능한 /Shigella 종일부 대변 샘플에 있을 수 있습니다¹⁴. 이러한 단점에 비추어 많은 실험실 하려고 살 모 넬 라 종의 검출을 위한 새로운 기술을 개발 /Shigella 종^{15,16,,1718 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25}. 이러한 모든 방법을 사용 하는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 가장 일반적인 핵 산 증폭 검사 (NAAT). 이러한 NAAT 기반 방법의 한 가지 주요 한계는 죽은 박테리아, 심지어 세균 파편 포함 불완전 한 genomic DNA, 긍정적인 결과²⁶, 질병의 정확한 진단에 크게 영향을 미칠 수 있는 게재 될 수 있습니다. 블랑코 외. 그 분자 분석 결과 매우 중요 한, 뿐만 아니라 가능한 살 모 넬 라 부분 게놈 뿐만 아니라 문화, 과거 감염 또는 오염²⁶에서 죽거나 unviable 박테리아를 보여주었다. 따라서, 새로운 기술을 개발 한다.

여기, 우리는 결합 된 NAAT 메서드 및 경작을 기반으로 새로운 방법 설명. 그림 1에서 보듯이,이 새로운 방법 적용 실시간 PCR 처음 상영 하 고 긍정적인 샘플 박테리아 문화 및 식별에 대 한 전송 됩니다.

프로토콜

프로토콜은 주 국제 여행 의료 센터의 인간 연구 윤리 위원회에 의해 설정 하는 지침을 따릅니다. 실험 기간 동안 표준 살 균 작업을 사용 하십시오.

1. 문화 미디어 구성 및 준비

1. 영양 국물 준비: 분해 1% 펩, 0.3% 쇠고기 추출 물, 염화 나트륨 0.5%, H₂O 포도 당 0.1%, pH 7.5와 오토 클레이 브를 조정 15 분 동안 121 ° C에 그것.
2. Selenite Cystine 매체 준비: 분해 펩 0.5%, 0.4% 유 당, 1% 나₂HCO₃, 0.4% 나트륨 수소 selenite, 0.001% H₂O, L-시스 틴 7.0에 pH를 조정 하 고 5 분 동안 끓여.
3. 준비 된 Xylose Lysine, Deoxycholate 천 (XLD) 배지: 디졸브 0.3% 효 모 추출 물, 0.5 %L-리 신, 0.375 %xylose, 유 당 0.75%, 0.75% 자당, 염화 나트륨 0.5%, 0.008% 페 놀 레드, 0.68% 나트륨 thiosulfate, 0.08% 염화 제 2 철 구 연산 염, 0.25% 나트륨 deoxycholate, H₂O, 한 천 1.5% 고 pH 7.4에 조정. 그런 다음 5 분 동안 끓여 고 90 mm 접시에 부 어.
4. 살 모 넬 라 비 천 배지 준비: 분해 한 천 1.5%, 0.7% 펩과 효 모 추출 물, 선택 시의 약 1.29% H₂o. 그런 다음 5 분 동안 끓여 고 90 mm 접시에 부 어.
5. 영양 한 천 배지 준비: 1% 펩, 0.3% 쇠고기 추출 물, 염화 나트륨 0.5%, H₂O, 한 천 1.5%를 녹이 고 pH 7.3 조정. 그런 다음 압력솥 15 분 동안 121 ° C에서 90 mm 접시에 부 어.
6. MacConkey agar (MAC) 접시 준비: 분해 펩 2%, 유 당 1%, 0.5% 염화 나트륨, 0.5% 소 담 즙 소금, 0.0025% 중립 빨강, 한 천 1.5%, H₂O, 0.0001% 크리스탈 바이올렛 7.2에 pH를 조정 하 고. 그런 다음 압력솥 20 분 동안 115 ° C에서 90 mm 접시에 부 어.

2. 실시간 PCR

1. 샘플 컬렉션
   1. 환자의 항문에는 항문 면봉을 삽입 3-5 cm 깊이, 주위에 360 ° 회전 하는 고.
   2. 살 균 컬렉션 튜브로 항문 면봉을 넣어. 마크 샘플 id입니다.
   3. 보내기 샘플 실험실 최대한 빨리.
      참고: 샘플 24 h 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
2. 사전 농축
   1. 컬렉션 튜브에서 각 샘플에 영양소 국물의 3 mL를 추가 합니다.
   2. 인큐베이터에 6 h 36 ° C에서 품 어.
3. (선택 사항) 혼합 샘플
   1. 각 사전 농축 문화 100 µ L를 수집 하 고 10 개 이상의 샘플 있다면 1.5 mL 튜브에 1 견본의 8-10 샘플을 혼합.
   2. 제대로 표시 합니다.
4. DNA 추출
   1. 사전 농축 문화 정착, 큰 입자를 허용 하도록 2 분 동안 800 x g에서 원심 그리고 새로운 튜브를 5 분에 12000 x g에서 원심 분리기는 상쾌한 전송 삭제는 상쾌한 포부에 의해.
   2. DNA 추출 솔루션의 100 µ L를 추가 (0.01 M pH 8.0 트리 스-EDTA, 0.01% Nonidet P 40 (NP40)) 펠 릿을. 1 분 동안 적극적으로 소용돌이입니다.
   3. 건조 욕조에 5 분 동안 100 ° C에서 끓인 다.
   4. 5 분을 위한 12000 x g에서 원심 분리기 상쾌한 성공 실시간 PCR 분석에 대 한 서식 파일을 있을 것입니다 새로운 튜브를 사용 하 여 수집 합니다.
5. 실시간 PCR
   1. 반응 혼합물으로 설치 수행: 각 샘플에 대 한 반응 혼합물, 각 뇌관의 0.4 µ M, 각 프로브 ( 표 1에 시퀀스)²⁷의 0.2 µ M, 5 µ L 단계 2.4.4에서 준비 하는 대로 서식 파일의 x 2의 12.5 µ L을 추가 하 고 사용 ddH₂O 총 최대 25 µ L을 추가 하 볼륨입니다.
   2. 다음과 같이 순환 프로그램 설치: 3 분 동안 95 ° C 15 95 ° C의 40 주기 다음 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 6-카-fluorescein (FAM)와 신장 단계 (72 ° C)에서 Hexachlorofluorescein (16 진수) 채널에서 34 미 수집 형광 신호를 위한 72 ° C 자동으로 형광 실시간 PCR 기계.
   3. 악기의 지시에 따라 형광 실시간 PCR 기계에 실시간 PCR을 수행 합니다.
   4. 4 단계로 바로 이동 하 고 부정적인 결과 샘플은 살 모 넬 라 종에 대 한 부정적인 팸/HEX 채널에서 발생 하는 경우 부정적인 보고서를 발행 /Shigella 종
   5. 긍정적인 결과 발생 16 진수 및 팸 채널에는 샘플 수 있습니다 살 모 넬 라 종 또는 Shigella 종에 대 한 긍정적인 각각 의미 하는 경우 3.1 및 3.2 단계로 이동 합니다.
      참고: 샘플 혼합 수행 단계 2.3에서에서, 다음에 긍정적인 것을 만든 개별 샘플 실시간 PCR 수행 되어야 한다 진짜 긍정적인 샘플 화면을.

3. 인도 문화

1. 살 모 넬 라 종 PCR 긍정적인 샘플
   1. 매체에 선택적 문화
      1. 테스트 튜브에서 Selenite Cystine 매체의 5 mL에 사전 농축 문화 100 µ L를 추가 합니다. 인큐베이터에서 18-24 h 36 ° C에서 품 어.
   2. 접시에 문화를 분리
      1. 마이크로-루프와 문화의 한 루프를 수집 하 고 XLD 접시 또는 살 모 넬 라 비 천 배지 확산. 인큐베이터에서 18-24 h 36 ° C에서 품 어.
   3. 생 화 확 적인 식별
      1. XLD 접시 (핑크 식민지/어두운 마음 없이 어두운 식민지, 노란색 식민지/어두운 마음 없이) 또는 살 모 넬 라 비 천 배지 선택 의심 스러운 식민지 (자주색 또는 prunosus 식민지, 부드럽고 둥근) (그림 2).
      2. 악기의 지시에 따라 자동화 된 미생물 식별 시스템에 생화학 식별을 위한 주제 의심 스러운 식민지.
   4. 혈 청 학적인 특성
      1. O 항 원 특성
         1. O 항 원 다 원자가 세라 깨끗 한 슬라이드에 한 방울을 추가 합니다.
         2. 마이크로-루프와 갈기는 세라에 식민지의 한 루프를 수집 합니다.
         3. 흐르는 모래, 처럼 보이는 경우 3.1.4.1.4 단계로 이동 식민지는 세라 (그림 3)에 반응. 그렇지 않으면, 단계 3.1.4.1.5로 이동 합니다.
         4. O 항 원 여러차례 세라를 사용 하 여 특정 O 항 원 특징 단계 3.1.4.1.1 3.1.4.1.3 단계를 반복.
         5. 바이 세라를 사용 하 여 3.1.4.1.1 3.1.4.1.3 단계를 반복 하십시오. 튜브에서 그 Vi 세라 반응 식민지를 수집 하 고 건조 욕조에 5 분 동안 100 ° C에서 비등. 특정 O 항 원 특징 때까지 5 분을 위한 12000 x g에서 원심 분리기는 펠 릿 및 반복 단계 3.1.4.1.1 3.1.4.1.4 수집 합니다.
      2. H 항 원 특성
         1. H 항 원 다 원자가 세라 깨끗 한 슬라이드에 한 방울을 추가 합니다.
         2. 마이크로-루프와 갈기는 세라에 식민지의 한 루프를 수집 합니다.
         3. 3.1.4.2.4 모래, 흐르는 처럼 보이는 단계에 서는 식민지는 세라에 반응.
         4. H 항 원 여러차례 세라를 사용 하 여 특정 H 항 원 특징 단계 3.1.4.2.1 3.1.4.2.3 단계를 반복.
            참고: 때때로 혈 청 유도 필요할 수 있습니다 두 번째 단계 H 항 원 하. 그렇다면, 다음과 같은 선택적 단계 수행 되어야 한다.
         5. (선택 사항) 영양 한 천 배지 위에 특정 H 항 혈 청 한 방울을 추가 합니다. 모든 세라 흡수 됩니다 때까지 기다립니다.
         6. (선택 사항) 특정 H 항 원 세라 흡수는 마이크로 루프와 접시에 확산 식민지의 한 루프를 수집 합니다. 인큐베이터에서 18-24 h 36 ° C에서 품 어.
         7. (선택 사항) H 항 원 여러차례 세라를 사용 하 여 단계 3.1.4.2.1 3.1.4.2.3 단계를 반복 2 단계 H 항 원 특징입니다.
         8. 단계 4로 이동 합니다.
2. Shigella 종 PCR 긍정적인 샘플
   1. 접시에 문화를 분리
      1. 마이크로-루프와 사전 농축 문화의 한 루프를 수집 하 고 XLD 접시 또는 MAC 판에 확산. 인큐베이터에서 18-24 h 36 ° C에서 품 어.
   2. 생 화 확 적인 식별
      1. XLD 플레이트 (부드럽고, 라운드, 투명 하 고 빨간색 식민지) 또는 맥 플레이트 (부드럽고, 라운드, 직경; 2-3 m m 투명 하 고 무색 식민지에 의심 스러운 식민지를 수집 Shigella sonnei 더 큰 수 있으며 보육 시간 신장으로 핑크 빛 돌) (그림 4).
      2. 악기의 지시에 따라 자동화 된 미생물 식별 시스템에 생화학 식별을 위한 주제 의심 스러운 식민지.
   3. 혈 청 학적인 특성
      1. Shigella 종 다 원자가 세라 깨끗 한 슬라이드에 한 방울을 추가 합니다.
      2. 마이크로-루프와 갈기는 세라에 식민지의 한 루프를 수집 합니다.
      3. 3.2.3.4 흐르는 모래, 처럼 보이는 단계에 서는 식민지는 세라에 반응.
      4. Shigella 종 여러차례 세라를 사용 하 여 특정 Shigella 종 특징 단계 3.2.3.1 3.2.3.3 반복.
      5. 단계 4로 이동 합니다.

4입니다. 보고서

1. 위의 결과 따라 긍정적 이거나 부정적인 보고서를 발행.

결과

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 프로토콜 적용 된 음식과 물을 처리 하는 사람에서 항문 대변에서Shigella 종 샘플 /.

실시간 PCR 단계에서A, 그림 5같이 있었다 16 진수 채널 혼합된 샘플은 살 모 넬 라 종에 대 한 긍정적인 의미에서 성공적인 증폭 다음 추가 실시간 PCR은 긍정?...

토론

살 모 넬 라 종부터 /Shigella 종 종종 음식 중독 및 급성 위장염^28,29 의 지저분한 구두 전송 관련 된 고 일상적인 방법은 노동 집약적인 또는 소모 ⁷, 우리는 살 모 넬 라 종에 대 한 높은 처리 플랫폼을설명/Shigella 종 심사, 실시간 PCR를 사용 하 여 결합 가이드 문화.

이 플랫폼의 기능을 최대?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris	Sigma	10708976001
EDTA	Sigma	798681
NP40	Sigma	11332473001
ddH2O	Takara	9012
PrimeSTAR HS (Premix)	Takara	R040Q
Nutrient Broth	LandBridge	CM106
Nutrient agar	LandBridge	CM107
Selenite Cystine medium	LandBridge	CM225
XLD	LandBridge	CM219
MAC	LandBridge	CM908
Salmonella chromogenic agar	CHROMagar	SA130
Salmonella diagnostic serum	Tianrun	SAL60
Shigella diagnostic serum	Tianrun	SHI54
anal swab (collecting tube plus)	Huachenyang
slide	Mingsheng	7102
micro-loop	Weierkang	W511
incubator	Jinghong	DNP-9082
autoclave	AUL	SS-325
dry bath	Jinghong	KB-20
automated microbial identification system	bioMérieux	VITEK2	other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine	ThermoFisher	ABI7500	other equivalent machine could be used