오픈 액세스 NASA GeneLab 플랫폼을 사용 하 여 마우스 생리학에 Spaceflight의 효과 탐험

요약

NASA GeneLab 플랫폼 생물 spaceflight 실험에서 소중한 omics 데이터를 자유롭게 액세스를 제공합니다. 어떻게 일반적인 마우스 실험 공간에서 실시 하 고 같은 실험에서 데이터를 액세스 하 고 분석할 수 있습니다 어떻게 설명 합니다.

초록

생물 실험을 수행 하는 공간에서 특별 한 숙박 시설 및 효과적이 고 효율적으로 이러한 조사 수행 되도록 절차 필요 합니다. 또한,이 실험의 infrequency 주어진 그들의 영향 최대화 수 필수적입니다. Omics 기술의 급속 한 발전은 소중한 spaceflight 표본에서 생산 하는 데이터의 양을 극적으로 증가 하는 기회를 제공 합니다. 이것에 대 한 투자, 미 항공 우주국 spaceflight omics 데이터에 대 한 무제한 액세스를 제공 하 고 광범위 한 분석을 장려 GeneLab 플랫폼을 개발 했습니다. 설치류 (쥐, 쥐)는 과학자 들에 의해 공간 관련 생물 학적 영향을 조사 하는 데 사용 하는 일반적인 모형 유기 체. 인클로저 spaceflight 동안 집 설치류 쥐 서식 지 (이전 동물 인클로저 모듈), 라고 하며 물과 음식에 그들의 크기, 공기 흐름 및 액세스 표준 물고기 연습장에서 실질적으로 다른. 또한, 환경 및 대기 조건 국제 우주 정거장 (ISS)에, 때문에 동물 높은 CO₂ 농도에 노출 됩니다. 우리는 최근 쥐 쥐 서식 지에 땅에 동물 들이 있는지 여부에 관계 없이 그들의 transcriptome 또는 공간에 큰 변화를 경험 했다. 또한, 이러한 변경 내용을 잠재적으로 더 높은 CO₂ 농도 의해 구동 hypoxic 응답 일치 했다. 여기 우리는 일반적인 설치류 실험 공간에서 수행 되는 방법을, 어떻게 이러한 실험에서 omics 데이터 GeneLab 플랫폼을 통해 액세스할 수 있습니다 및이 데이터에서 중요 한 요소를 식별 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로세스를 사용 하 여, 모든 개인 미래 우주 임무 및 활동의 디자인을 바꿀 수 있는 중요 한 발견을 만들 수 있습니다.

서문

이 원고의 전반적인 목표는 NASA의 GeneLab 플랫폼¹ 공간에서 어떻게 설치류 실험을 사용 하는 방법의 명확한 방법론 omics 데이터 분석에 대 한 변환 됩니다 제공. 있어요 인간 바꾸 인된 중력 분야, 우주 방사선, 지구에서 격리 및 다른 적대적인 환경 요인^2,3,,45, 에서 수많은 건강 위험에 노출 되는 ⁶. 생물학 실험 수행 공간 및 지상에 정의 하 고 이러한 위험^7,,89,10,11, 를 계량 도움이 ^{12 , 13 , 14}. 공간에서 이러한 실험 국제 우주 정거장 (ISS), 우주 왕복선 및 다른 궤도 플랫폼에 실시 되었습니다. 이러한 실험 전문된 하드웨어 및 공간 제한 대원 시간 등 microgravity 환경에서에서 실험을 수행의 독특한 관심사를 주어 방법론 필요 합니다. 다양 한 플랫폼, 동물, 식물과 미생물 모델¹⁵를 사용 하 여 공간에 정교한 실험을 수행 하기 위한 지금 존재 한다.

설치류 모델 특히 포유동물, 인간을 포함 한 우주선에 응답 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 전진 하는 것이 중요 했습니다. 근육 구조^16,,1718 과 면역 기능^19,,2021에 spaceflight의 영향 포함 됩니다. 지구에 주택 설치류에 사용 되는 표준 물고기 연습장 spaceflight 실험^22,23적합 하지 않습니다. 따라서, 오버 년 쥐 및 쥐 비행 되었고 일본 항공 우주 탐험 기관 (JAXA) 서식 지 케이지²⁴, 이온-m 1에 사용 하는 공간 캡슐을 운반 하는 동물을 포함 하 여 다양 한 감 금 소에 무인 러시아 위성^{25 ,,2627}, 쥐 서랍 시스템 (MDS) 이탈리아 우주 기관^28,,2930, NASA 동물 인클로저 모듈 (AEM), 그리고 이제는 NASA에 의해 설계 된 설치류 전송 및 서식 지²³. 설치류 실험 동물 인클로저 모듈 (AEM)로 언급 하는 감 금 소를 사용 하 여 우주 왕복선에서 처음 시작 했다. 이 하드웨어는 우주 왕복선²³27 설치류 실험에 사용 되었다. AEM 원래 개발 되었다 상대적으로 짧은 실험 보드에 대 한 셔틀 (< 20 일). ISS의 개발 이후는 AEMs 더 긴 기간 실험에 대 한 수정 된 하 고 지금 쥐 서식 지^22,23라고. 새로운 쥐 서식 지는 우주 정거장 (익스프레스) 랙 인터페이스에 대 한 긴급 처리의 실험을 사용 하 여 ISS에 긴 내구 임무를 지원 하기 위해 설계 되었습니다. 설치류 서식 지는 음식과 물 (그림 1) 표준 물고기 감 금 소 그들의 크기, 공기 흐름, 필터 및 배기 시스템, 액세스에서에서 실질적으로 다르다. 그럼에도 불구 하 고,이 하드웨어 입증 포유류 생리학^{19,,3132,33 우주선 유도 된 변화에 중요 한 통찰력을 사용 하는 효과적인 연구 플랫폼 ,,3435,36}.

대용량의 omics 데이터 이제 설치류와 수행을 포함 한 생물 학적 spaceflight 실험에서 생성할 수 있습니다. 최근, 이러한 omics 실험에서 데이터 되었습니다 NASA GeneLab 플랫폼¹ 는 포괄적인 데이터 저장소 및 분석 플랫폼을 우주선 실험에서 가설을 개발 하는 사람을 허용을 통해 공개적으로 사용할 수 있습니다. GeneLab 검색, 액세스, 공유 및 데이터의 분석을 위한 도구를 제공합니다. 우리는 표준 물고기 장과 전문된 쥐 서식 지 공간에 사용 간의 차이 쥐³⁶transcriptome에 엄청난 차이가 발생할 보여 GeneLab 데이터 집합을 활용. 우리가 비교 하는 다른 조직에서 설치류 쥐 서식 지 또는 표준 물고기 감 금 소에 4 개의 다른 공개적으로 사용 가능한 데이터 집합 분석. 우리 주요 드라이버와 변경 된 경로 높은 CO₂ 농도 더 높은 CO에 이르게 ISS에 기인한 높은 CO₂ 수준 때문에 hypoxic 응답 일치 했다 결정 편견된 시스템 생물학 분석을 사용 하 여, ₂ 농도 주어진 쥐 서식 지에서 그들은 주위 공기에 수동 시스템입니다. 이 어떻게 과학자 사용 하 여 오픈 소스 도구 및 데이터 생성 ISS의 환경 우주 비행사 건강에 미치는 영향에 대 한 암시가와 소설 결과 보여 줍니다.

여기 우리가 어떻게 설치류 실험 설명 어떻게 이러한 실험에서 데이터를 통해 액세스할 수는 오픈-소스, omic 플랫폼 공간 생물학에 관련 된 공간에서 수행 됩니다. 우리는 우주 임무 및 spaceflight 조직 처리 방법 사용 쥐 서식 지의 구성 논의. 우리는 또한 spaceflight omics 데이터를 발견 하 고 GeneLab 및 우주선에 전체 응답을 촉진 하는 주요 요인에 액세스할 수 있습니다 수³⁶을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 우리가에이 프로토콜을 구현 하는 방법을 제시 하는 구체적인 예를 설치류 쥐 서식 지와 물고기 컨트롤 Beheshti에 의해 출판에에서 발생 하는 생물학적 차이 비교 것입니다 외.³⁶. 그라운드 컨트롤은 spaceflight 설치류 실험에 필수적인 중요 하다. 이 프로토콜에서 설명 된 대로 이러한 컨트롤 모두 동일한 조건 (즉, CO₂ 조건, 습도, 온도, 케이지 크기, 등)는 ISS에 쥐 서식 지 및 표준 물고기 감 금 소는 표준 완료 환경 (예:, CO₂ 조건, 온도 습도) 지구에 조건. 설치류 쥐 서식 지 지상 컨트롤에 공간에서 설치류를 직접 비교 하실 수 있습니다. 설치류 물고기 감 금 소에 있는 동안 다른 주택 (예를 들어, 물고기 감 금 소 설치류 하드웨어 대) 사이 생물학 비교 하실 수 있습니다. 쥐 서식 지는 다른 물고기에 지속적인 공기 흐름은 연습장 (0.1-0.3 m/s), 긴 기간, 그리고 보조 배기 필터를 캡처하고 microgravity에 지속적인 공기 흐름에 의해 배기 필터를 유도 동물 폐기물을 흡수. 또한, 설치류 서식 지는 수동 시스템 및 입구 주변 공기; 따라서, 그들은 또한 ISS 오두막 (~ 5000 ppm)에 높은 수준으로 인해 더 높은 CO₂ 농도 있다.

프로토콜

주택 및 조직 처리에 대 한 동물 프로토콜 실험실 동물 보호에 대 한 표준 지침 및 NASA의에 의해 승인 되었습니다 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지상 및 비행.

1입니다. 쥐 서식 지의 구성

참고: NASA 쥐 서식 지 (이전 AEMs) 작업 공간 (그림 1)에 맞게 물고기 연습장에서 다른 기능을가지고 있습니다.

1. 각 쥐 서식 지에서 하우스 10 마우스 (마우스 당 최대 30 g). 서식 지 구성 되어 있으면 두 개의 구획 또는 10 쥐로 단일 구획 경우 구획 당 5 쥐를 집.
   참고: NASA 쥐 서식 지를 더 큰 액세스할 수 표면적 쥐 당 표준 물고기 감 금 소 보다 있다.
2. 지상 동물 컨트롤, CO₂ 농도, 온도 및 상대 습도 포함 하 여 비행 동물로 쥐 서식 지 동일 환경 조건에서 ISS 환경 시뮬레이터 (ISSES)를 내부에서 쥐를 집.
3. Ad libitum 액세스와 사용자 정의 만든된 NASA 영양소 업그레이드 설치류 Foodbars (NuRFB) 쥐³⁷, 국가 연구 위원회 (NRC) 영양 요구 사항에 따라 동물을 제공 하 고 압력을 통해 물 lixits를 활성화.
4. 동물 들의 건강 및 12:12 h 라이트 사이클 물고기와 비슷한 하루 동안 LED 조명 및 비디오 상태 검사 동안 적외선 조명 표준 시설에 연습장 중 자리와 쥐 서식 지에서 사용할 수 있는 동작 모니터링 어두운 주기입니다.
5. 적외선 조명 밤 동안 동물 들의 건강 및 행동 및 수집 비디오의 일일 모니터링에 대 한 서식 지 쥐 감 금 소에 4 개의 카메라를 배치 합니다.
6. 용 캡슐 또는 유사한 발사 차량 타고 전송 (그림 2B)에 ISS에 설치류를 제공 합니다.
7. 설치류는 관찰 하 고 검사 전에 발사, 전송기에 NASA 비행 수 의사에 의해 그리고 ISS와 쥐 서식 지를 전송 하기 전에 도착 시 훈련된 승무원에 의해 확인 하십시오.
8. 이 전환 기간, 20 쥐 (각 측에 10) 또는 전송에서 12 쥐 집에 대 한.
   참고: 쥐의 서식 지와 마찬가지로 전송 환경 조건에 대 한 수동 단위입니다. 이 짧은 전환 기간 동안이 단일 단위 최대 20 쥐 집 수 있습니다.

2입니다. 쥐 Spaceflight 실험에 대 한 처리

1. 표준 공급 업체에서 설치류를 조달.
   참고: 배달, 다음 표준 물고기 감 금 소 내의 설치류를 그룹화 하 고 동물 들이 전송에 로드 될 때까지 미 항공 우주국 NuRFB, lixits, 그리고 제기 와이어 바닥에 적응 하는 동물이 있다. 감 금 소에 있는 설치류를 떠나 자연스럽 게 적응 하는 동물을 허용할 것 이다. 쥐 쥐 서식 지 및 물고기 새 장 밖의 처리는 모든 설치류 실험^12,,2728일반적으로 사용 되는 프로토콜을 다음과 같습니다. 쥐 서식 지 시스템 (그림 1A) 각각, 그리고 지상 컨트롤 시뮬레이션 ISS 또는 STS 환경 조건에 대 한 두 spaceflight 임무 STS와 ISS에 대 한 활용 될 것입니다.
2. 어떤 임무에 대 한 물고기 컨트롤에 대 한 표준 물고기 감 금 소 (그림 1B)를 사용 합니다. 5 또는 10 마우스를 사용 하 여 표준 물고기 감 금 소 당.
3. 쥐 서식 지에 대 한 구획 당 5 쥐와 두 개의 서로 다른 구획에 10 마우스를 놓습니다. 단일 구획에 서식 지 당 10 쥐 집에 감 금 소 분배자를 제거 합니다.
4. (그림 2) 아래에 설명 된 spaceflight 임무 중 쥐 하드웨어의 세 가지 구성 요소를 사용 합니다.
   1. 지구와 ISS 사이 또는 그 반대로 이중 밀도 (측 당 10 쥐, 전송 당 20 쥐)에서 여행에 대 한 전송 (그림 2B)에 설치류를 배치 합니다.
   2. 한 번, ISS에서 전송에 동물 액세스 단위 (AAU) (그림 2C) 첨부 합니다. 전송에서 마우스 전송 상자 (MTB)를 사용 하 여 서식 설치류를 전송 (5 쥐 MTB 당) (그림 2D).
      참고: 는 AAU ISS 오두막에서 어떤 동물 제품 (예:, 대변, 소변, 모피)를 포함 하는 데 사용 됩니다.
   3. 전송에서 AAU를 분리 하 고 쥐 서식 지를 연결. 다음 그들은 임무 동안에 있는 설치류 서식 (그림 2A)에 MTB에서 동물을 전송.
      참고: 모든 쥐 서식 지에 대 한 ISS 오두막에서 높은 수준 때문에 CO₂ 농도 5000 ppm 이다.
5. 온도 및 습도 쥐 서식 지의 모니터링 하지만 활성 열 컨트롤이 없습니다. 쥐 연구 팀 유지 하 고 쥐 서식 지에서 온도 결정 하는 오두막 온도 제어 ISS와 함께 작동 하는지 확인 합니다.
   참고: 쥐 서식 지에 빛과 어둠의 사이클 마다 12 h (예:, 5시-17시 그리니치 표준시, 표시등)과 ISS의 승무원 (매주 또는 격주) 음식에서 일정 하 고 빈번한 변화를 수행 하 고 리필 물 (매 ~ 28 일).

3입니다. 안락사의 설치류와 처리 조직

1. 안락사, 줄 쥐 일반적인 마 취 (마 취 제/Xylazine 150/45 mg/kg 몸 질량 0.3 mL의 전체 볼륨에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수에 희석까지)의 과다 복용의 안락사 (보조 방법으로 쌍 복 주입 (IP)를 통해 자 궁 경관 탈 구 또는 thoracotomy)입니다.
2. ISS에 실시 한 실험에 대 한:
   1. 설치류 중 라이브, 반환 또는
   2. ISS에 안락사.
      1. -95 ± 2 ° C는 ISS에 냉동 고에에서 설치류 시체를 고정 하 고 사용 가능한 반환 차량 (현재 스페이스 용 캡슐)에 지구에 반환 합니다.
      2. 설치류는 지구에 반환 됩니다, 일단 모든 장기와 조직 (즉,, 간, 신장, 피부, 근육, 심장, 비장, 눈, 부 신 분 비, 폐, 그리고 뇌) 해 부 고-80 ° C에 또는 RNA 안정화 솔루션에에서 저장 합니다.
3. ISS 원격 측정 데이터와 일치 하는 3-5 일 오프셋 비행 실험으로 동일한 절차와 모든 제어 지상 실험에 대 한 타이밍을 따릅니다.
4. 보존된 조직에서 RNA, 단백질과 DNA 격리 GeneLab 플랫폼 (genelab.nasa.gov)에서 각 데이터 집합과 관련 된 세부 사항에서 설명 하는 표준 프로토콜을 사용 하 여 격리 합니다.
   참고: 설치류 조직 기본 외관이 의해 활용 되지 NASA의 기관 과학 컬렉션의 일부가 됩니다. 이러한 샘플 에임스 연구 센터 (ARC)에 저장 됩니다 비-인간 Biobank 카탈로그 하 고 과학 커뮤니티에 의해 요청 가능. 사용할 수 있는 조직에서 생명 과학 데이터 아카이브 공개 웹사이트에서 찾을 수 있습니다: https://Lsda.jsc.nasa.gov/Biospecimen.

4. RNA, DNA, 단백질에서 Omics 데이터 생성 추출

1. 추출 된 고분자 (RNA, DNA, 단백질)에서 표준 프로토콜을 사용 하 여 omics 데이터 생성. 이러한 GeneLab 각각 연구 메타 데이터 세부 사항에 설명 되어 있습니다.

5. GeneLab 저장소 및 데이터 전송

참고: 공간 생물학 관련 omics 데이터 GeneLab 데이터 저장소에 제출 됩니다. GeneLab 수락 하 고 세계의 여러 공간 기관에 의해 자금 공간 관련 omics 데이터 호스트.

1. 생성 omics 관련 데이터는 GeneLab 저장소에 호스트 될 수 있습니다.
   1. 제출 GeneLab, 생성 된 데이터도 분석은 완전 한 또는 수 사관의 재량에 따라.
      참고: 다른 공공 omics 데이터베이스에 제출 하는 데이터는 가져오고 GeneLab 저장소에 게시. 생성 된 GeneLab 데이터 큐레이터 고 금지 기간 없이 출판. GeneLab, 특히 샘플 처리 실험실, spaceflight 실험에서 omics 데이터 증가에 최적화 된 추출 프로토콜 및 기술을 사용 하 여 다양 한 우주 실험에서 데이터를 생성 합니다.
2. 데이터 준비가 되 면 제출, 포맷 및 GeneLab (보충 그림 1) 다음과 같은 방법으로 메타 데이터 및 데이터 전송:
   1. ISAcreator 도구를 사용 하 여 실험 연구를 정의 하는 메타 데이터를 저장.
      참고: 는 ISAcreator 도구는 가이드 튜토리얼 여기³⁸로 다운로드할 수 있습니다.
   2. 참조 데이터 여기³⁹ 이해 허용된 데이터 형식 및 처리 되 고 원시 데이터 파일 형식에 나열 된.
      1. 업로드 및 저장을 최적화 하려면 데이터 파일을 압축.
   3. 작업 영역⁴⁰를 통해 GeneLab 데이터 큐레이터를 메타 데이터와 원시 또는 처리 된 데이터를 전송.
   4. 사용자 이름 및 암호를 만들고 데이터를 업로드 합니다.
3. 일단 데이터 작업 영역에 업로드 되어, 데이터 GeneLab 큐레이터를 공유 합니다.
   참고: 업로드 하 고 파일을 공유 하는 방법에 자세한 내용은⁴¹데이터 제출 가이드 찾을 수 있습니다.
4. 각 제출은 큐레이터에 의해 확인 하 고 GeneLab 저장소⁴²에서 출판.

6. GeneLab에서 검색 기능을 사용 하 여 분석용 데이터 집합 찾기

1. GeneLab에 링크 (추가 그림 2)³⁸로 이동 하 여 서로 다른 데이터 집합에 대 한 검색.
   1. 특히 이전 게시³⁶관련, 다음 용어에 대 한 검색: GLDS-21, GLDS-111, GLDS-25, 및 GLDS-63.
2. 화면 왼쪽에 "GeneLab 데이터 시스템"을 클릭 하 여 GeneLab 홈페이지를 액세스할.
3. 특정 관심 분야에 대 한 검색 하려면 "데이터 검색" 상자에 키워드를 입력 합니다. 이 경우에 다음 데이터 집합 식별자의 각각을 별도로 입력: GLDS 21, GLDS-111, GLDS-25, 및 GLDS-63.
4. GeneLab 저장소 검색 이외에 NIH 지리적, 등 비 자존심, ANL MG-RAST 검색 바에서 원하는 확인란을 선택 하 여 다른 데이터베이스에서 검색 합니다.
   참고: 현재 GeneLab 저장소에 대 한 사용자는 다음 필터 범주를 사용 하 여 검색할 수 있습니다: 유기 체, 분석 결과, 요인, 형식과 프로젝트.

7. 저장 하 고 분석에 대 한 관심의 파일을 전송

참고: GeneLab 작업 영역 저장 하 고 GeneLab 데이터베이스 (보충 그림 3)에서 직접 파일을 전송 설계 되었습니다.

1. 데이터 시스템 메뉴 상단 "작업 영역"을 클릭 합니다.
2. 경우 새 사용자, 새 계정에 등록.
   참고: GeneLab 작업 공간 GenomeSpace⁴³에 의해 구동 됩니다.
3. 액세스 자세한 상단 메뉴에서 "도움말"을 선택 하 고 사용자 가이드를 클릭 하 여 작업 영역을 사용 하는 방법에 대 한 지침.
4. 각 사용자에 대해 GeneLab 저장소의 모든 데이터 집합 왼쪽 메뉴에 "공개/genelab" 폴더를 선택 하 여 액세스할.
5. 관심의 데이터 폴더를 이동 하 여 관심 데이터 집합을 로컬 디렉터리 작업 영역에 복사 합니다. 특정 파일에 오른쪽 클릭, 나타나는 메뉴에서 "복사/이동"을 선택, 파일을 복사 하 여 다음 "복사"를 클릭 합니다 폴더를 선택.
   1. 위의 지시 대로 이전 게시³⁶ 와 관련 된 다음 데이터 집합을 찾아서 로컬 작업 영역을 복사: GLDS 21, GLDS-111, GLDS-25, 및 GLDS-63.

8. 각 연구의 설명과 메타 데이터에 액세스

참고: GeneLab 저장소에 있는 각 데이터 집합에 대 한 메타 데이터 파일은 왼쪽 메뉴에서 "공공/genelab" 데이터 집합 하위 폴더에 있습니다.

1. 각 데이터 집합의 "메타 데이터" 하위 폴더에 포함 된 하나 이상의 메타 데이터 파일에 액세스 하 여 관심 데이터 집합에 대 한 메타 데이터 정보를 찾을. 예를 들어 GLDS-100, 2 파일이 있다 "공개/genelab/GLDS-100/메타 데이터" 하위 폴더에: "GLDS-100_metadata_RR1_BIOBANK-눈-ISA.zip"와 "GLDS-100_metadata_RR1ExpDesign.pdf".
   1. 모든 데이터 집합 (이 MIAME, MIAPE, 및 다른 MIBBI 프레임 워크 표준 최소 메타 데이터 요구 사항에 대 한 subsumes 신체) ISATab 사양에 따라 메타 데이터를 제공 하는 단일 압축된 파일 있는지 확인 하십시오. 항상 이런이 종류의 파일 이름 "ISA.zip"에서 끝. 예를 들어 GLDS-100,이 파일은 "GLDS-100_metadata_RR1_BIOBANK-눈-ISA.zip".
2. ⁴⁴ ISACreator 도구 또는 텍스트 편집기를 사용 하 여 시각화 하 고 각 데이터 집합에 대 한 연구 및 분석 결과 메타 데이터에 대 한 텍스트 설명을 포함 하는 ISATab 메타 데이터 액세스.
   참고: ISATab 메타 데이터 내에서 샘플 설명 및 생물 검정와 관련 된 고 생물 검정은 설명 출력 데이터 파일과 관련 된.
3. 출력 분석 결과 데이터 파일을 하위 폴더에 있는 각 데이터 집합 내에서 분석 결과의 유형으로의 존재를 확인 합니다. 예를 들어 GLDS-100, RNA-Seq 출력 분석 결과 파일에 있는 "공공/genelab/GLDS-100/transcriptomics /" 폴더.

9입니다. GeneLab 데이터의 분석

참고: 각종 omics 데이터에 대 한 다양 한 파이프라인을 구현할 수 있습니다. 여기, 구체적인 예를 공부 되 고 시스템의 "핵심 드라이버"를 결정 하는 데 사용 되는 공평된 시스템 생물학 transcriptomic 파이프라인에 초점을 맞추고.

1. 확인 문학^{36,45,,4647,48,49,50} 이 파이프라인을 이해 하기 이전 게시 했습니다.
2. 일단 분석에 대 한 관심의 특정 데이터 집합을 선택 다음 방법으로 로컬 컴퓨터에 데이터를 다운로드:
   1. 특정 데이터 집합을 클릭 하십시오.
   2. 헤더의 왼쪽 끝에 "연구 파일" 탭을 클릭 하십시오.
   3. 모든 데이터 파일 및 메타 데이터가이 메뉴에서 사용할 수 있는지 확인 합니다.
   4. 각 파일을 다운로드 하려면 특정 파일 이름을 클릭 합니다.
3. Microarray 데이터 GeneLab에서 다운로드에 대 한 다음과 같은 사전 처리 단계를 사용 합니다.
   1. 별도로 배경 빼기와 상업 microarrays에 대 한 RMAExpress⁵¹ 을 사용 하 여 정규화 논집을 사용 하 여 각 데이터 집합에 대 한 원시 데이터를 처리 합니다.
   2. 그룹화 원리 구성 요소 분석 (PCA) 플롯을 얼마나 밀접 하 게 생물학 복제 R를 사용 하 여 만듭니다.
   3. MultiExperiment 뷰어⁵² 로 데이터를 가져오고 계산 먼저 루즈벨트 시작 틀린 발견 비율 (FDR) 통계를 사용 하 여 중요 한 유전자 < 0.05. 아무 중요 한 유전자 루즈벨트 통계와 함께 등장, 중요 한 유전자를 확인 하려면 사용 표준 t-테스트의 p-값 < 0.05로 시작 합니다.
   4. 통계적 통제 유전자를 확인 ≥ 1.2의 ≤를 비교할 컨트롤 실험 샘플-1.2 배 변화 커트 오프를 구현 합니다.
4. 통로 기능 예측에 대 한 유전자 설정 농축 분석 (GSEA)⁵³ 을 사용 합니다.
   1. GenePattern^54,55, GSEA, 또는 R 프로그래밍 환경을 사용 하 여 통해 직접 GSEA를 사용 합니다.
   2. 다음 유전자 세트를 사용 하 여 크게 규제 경로 결정: C2, C5, 및 특징.
   3. 크게 규제 유전자 세트에 첨단 분석을 수행 하 고 각 실험 비교 및 유전자 세트와 관련 된 첨단 유전자를 결정 합니다.
   4. 모든 유전자는 각 실험 조건 집합 사이 오버랩 첨단 유전자를 찾아.
5. 다른 플랫폼을 사용 하 여 예측 기능과 크게 통제 되는 경로 결정. 이 경우 중요 한 업스트림 레 귤 레이 터, biofunctions, 및 정식 경로 확인 하려면 독창성 통로 분석 (IPA)를 사용 합니다.
   1. 9.4.4 단계에서 결정 하는 통계적으로 중요 한 유전자에 대 한 배-변경 값으로 유전자의 목록을 업로드 합니다.
   2. 업스트림 레 귤 레이 터, biofunctions, 및 각 실험 비교에 대 한 정식 경로 생성 하기 위해 IPA의 지침을 따릅니다.
   3. 유전자 관련 된 업스트림 레 귤 레이 터, biofunctions, 및 정식 경로 활성화 z-점수 ≥ 2 (표시 된 활성화) 또는 ≤-2 (나타내는 억제)를 결정 합니다.
   4. 위의 모든 예측에 관련 된 중복 유전자를 찾아.
6. 공통/중복 유전자 단계 9.4와 9.5 사이 결정 합니다.
   참고: 이 유전자는 분석 되 고 실험 조건으로 예측된 기능 및 활동의 대부분을 제어 키/드라이버 유전자로 간주 됩니다. 이전 연구를 밖으로 노크 또는 실험 조건을 만들 것입니다 이러한 유전자를 홍보 또는 비작동^45,,4649공부 되는 시스템.
   1. IPA (또는 네트워크 어셈블리 소프트웨어) 결정 유전자의 연결을 통해 네트워크를 구성 합니다.
   2. 주요 유전자를 운전 하는 중앙 허브로 서 가장 연결 된 유전자를 고려 하십시오.
   3. 데이터 집합 간의 연결을 확인 하려면 네트워크에 반복 연결 테스트 분석 되 고 모든 데이터 집합에서 모든 주요 유전자 사이에서 발생 하는 중앙 허브를 모든 주요 유전자 그룹.

10. 인터페이스 사용 하 여 갤럭시⁵⁶ GeneLab에 Transcriptomic 데이터를 분석 하

참고: 여기 GeneLab은 인터페이스 (사용 가능한가 2018)을 사용 하 여 GeneLab에서 transcriptomic 데이터를 분석 하는 프로토콜을 설명 합니다. 갤럭시 자습서 풍부 하다. 갤럭시를 사용 하는 방법에 대 한 예제 자습서 일반적 사용할 수 elesewhere^57,58이다.

1. 사용자가 구글이 나 NASA 자격 증명을 사용 하 여 GeneLab에 로그인 수 있습니다. GeneLab은 도구 "분석" 메뉴 아래 있습니다.
2. GeneLab은 플랫폼에 데이터를가지고이 세 가지 방법에 따라.
   1. "데이터 업로드" 기능을 사용 하 여 로컬 파일 시스템에서 데이터를 업로드.
   2. GeneLab GenomeSpace GenomeSpace 가져오기 도구를 사용 하 여 "얻을 데이터" 섹션 아래에서 데이터를 가져옵니다.
      참고: 데이터 집합 승인 번호 (위 참조)에 의해 조직 "공용" 폴더 GeneLab의 모든 데이터 파일을 사용할 수 있습니다.
   3. 가져오기 데이터 분석 섹션 오른쪽에 "역사"에 표시 됩니다. 사용자는 기록 창 상단에 "역사" 옵션 또는 "모든 내역 보기" 버튼을 사용 하 여 관리 되는 여러 역사를 가질 수 있습니다.
3. 분석 도구는 인터페이스의 왼쪽에 나열 하 고 검색할 수 있습니다.
4. 현재 역사에서 가져온 데이터 집합의 모양을 확인 합니다.
   참고: 데이터에 대 한 많은 세부 사항을 각 데이터 집합에 대 한 검사를 위해 사용할 수 있습니다.
5. 분석 및 데이터 입력의 사양에 대 한 옵션과 함께 중앙 패널에 폼을 채울 왼쪽에 도구를 선택 합니다. 양식을 작성 하 여 "실행"을 눌러 분석을 실행 하기 위한 작업을 만듭니다.
6. 확인 작업 제출 역사에 표시 되 고 실행 (대기, 실행, 또는 없이 완료 된 오류)의 상태를 나타내는 색에 대 한.
7. 복잡 한 워크플로로 도구를 연결 합니다. "워크플로" 메뉴에 있는 도구를 통해 워크플로 관리 합니다. 그림 3 RNA-seq 데이터를 처리 하기 위해 만든 예제 워크플로를 보여 줍니다.
8. "데이터" 메뉴를 사용 하 여 다른 사용자와 데이터, 워크플로 및 역사를 공유.

결과

Spaceflight transcriptomic 데이터에서 키 드라이버를 결정 하는 것은 건강 위험을 확인 하 고 잠재적인 대책 개발로 우주 비행사 건강에 부정적인 영향을 방지 하기 위해 NASA 도움이 됩니다. 우리의 최근 게시물에서 우리는 위의 단계를 따라 성공적으로 ISS에 CO₂ 농도 건강³⁶영향 수 찾는 소설을 보여 GeneLab 데이터 집합을 활용. 우리는 또한 사용 위의 기술을 다른 연구에서 성공적으로 운전 되 고 공부^{45,,4647,48,49,50 시스템 핵심 요소를 결정 하} . 여기이 프로토콜을 사용 하 여 결과 결정 키 드라이버를 성공적으로 사용할 수 어떻게 보여 줍니다.

이 연구에서 우리는 주로 설치류 습관 지상 컨트롤 및 물고기 컨트롤에 설치류에서 발생 하는 생물학적 차이에 집중 했다. 위에서 설명한 대로 더 나은 우리에 게는 ISS에 환경으로 인해 건강에 영향을 미칠 수 있는 가능한 혼동 요인에 정보를 제공 하는 이러한 두 개의 서식 지를 이해 하는 열쇠입니다. 모든 설치류 spaceflight 실험에 대 한 이러한 지상 컨트롤 또한 어떤 생물학적 요인 ISS에 환경 조건 또는 spaceflight와 직접 관련 된 결정에 필수적입니다. 프로토콜에서 설명 했 듯이, 물고기 서식 지에 대 한 환경 조건 쥐 서식 지에 대 한 존재 하는 더 높은 CO₂ 수준에 노출 되지 않습니다. 물고기 서식 지는 지구 (현재 되 고 300 380 ppm)에 존재 하는 정상적인 공동₂ 수준. 온도 습도 모두 서식 지는 비슷합니다.

우리 쥐 서식 지 지상 컨트롤 및 두 개의 서식 지의 차이점을 운전에 대 한 책임은 물고기 지상 컨트롤에 설치류 사이 키 유전자를 결정 하기 위해 GeneLab 플랫폼에서 다음과 같은 데이터 집합을 사용: GLDS-21 GLDS-111, GLDS-25, 그리고 GLDS-63. 쥐 서식 지 (이전 AEM)와 독립적으로 각 데이터 집합에 대 한 물고기 컨트롤 위에서 설명한 대로 중요 한 유전자를 결정 하기 위해 분석 실시 됐다. 생물학의 PCA 플롯을 보여주었다 그룹화 (그림 4 쇼는 PCA 플롯 GLDS-21)를 복제 합니다. 전처리 된 데이터에서 우리는 다른 GSEA 유전자 집합에서 첨단 유전자 결정. 1.2-배 변화 (로그₂) 유전자를 사용 하 여, 우리가 업스트림 레 귤 레이 터, 정식 경로, 및 biofunctions에 대 한 예측에 관련 된 유전자를 예측할 수 있었다. 각 데이터 집합에 대 한 우리가 다음 발견 공통/중복 유전자 관련 된 모든 유전자 (그림 5)에 대 한. 이 유전자는 쥐 서식 지 (또는 AEM)에서 설치류 사이 응답 운전으로 지금 및 물고기. 어떻게 이러한 주요 유전자 연결의 네트워크 표현 되 고 각 데이터 집합에 대 한 중앙 허브 분석 (그림 6) 보여 줍니다. 예를 들어 MAPK1 마우스 (그림 6A)에서 STS-108 골격 근육 조직 위한 중앙 허브 이다. 이 운전 키 유전자와 대부분 중앙 선수 물고기 감 금 소 대 쥐 서식 지에서 지 내게 하는 마우스에 대 한 생물 학적 차이 일으키는 유전자로 해석 될 것 이다. 우리의 이전 작품에서는, 우리는 어떻게 이러한 핵심 유전자 연관-기존 과학 문학에서 CO₂ 응답와 어떻게 이러한 유전자 쥐³⁶에서 관찰 된 생물 학적 변화에 대 한 책임을 질 수 토론.

시스템 생물학 접근법, 우리 다음는 "마스터 레 귤 레이 터를" 연결 하는 모든 데이터 집합/조직 이며 잠재적으로 AEMs를 물고기 감 금 소에 비해에 설치류에 보편적인 생물학적 효과 대 한 책임을 확인 했습니다. 이것은 가장 연결 된 모든 데이터 집합에서 유전자를 확인 하 여 이루어졌다 모든 핵심 유전자 네트워크를 구성할 때. MAPK1는 가장 연결 된 유전자와 모든 핵심 유전자 (그림 7)에서 중앙 허브 수 있었습니다. 확인 하려면 MAPK1 AEMs에서 더 높은 CO₂ 수준에서 생쥐에 생물 학적 변화에 대 한 책임 수 있습니다, 만약 우리가 증거를 지원 하기 위한 과학 문학을 통해 보았다. 우리는 CO₂⁵⁹ 와 hypoxia^19,,6061와 MAPK1의 상관 관계를 나타내는 여러 연구를 발견.

그림 1 : The 쥐 서식 지 (이전 AEM) 물고기 감 금 소에 비해. (A) 이미지 NASA에서 제공 하는 AEM 케이지 (크레딧: NASA/도미 닉 하트). (B) 현재 표준 물고기 케이지 (우리의 실험실에 의해 촬영 사진) 사용. 이 그림에서 Beheshti 수정 되었습니다 외.³⁶. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 우주 임무에서 교통 하는 동안 관련 된 세 가지 다른 모듈과 쥐 서식 지 하드웨어 시스템. (A) 왼쪽된 모듈은 쥐 서식 지 모듈 (이전 AEM), 센터 모듈 (B) 전송, 이며 오른쪽 모듈 (C)는 동물 액세스 단위 (AAU). (D) 마우스 전송 상자 (MTB)입니다. (크레딧: NASA/도미 닉 하트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 예제 분석 워크플로 프로세스 RNA-seq 데이터에 GeneLab은 인터페이스에 사용 될 수 있는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

그림 4 : 주요 사전 처리 단계 후 대표 데이터 집합의 구성 요소 분석 (PCA). 물고기 감 금 소 대 AEM에 대 한 데이터 집합 GLDS-21에서 STS-118 임무 murine 골격 근육에 대 한 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 벤 다이어그램을 대표 하는 어떤 핵심 유전자 다른 통로 예측 도구를 사용 하 여 결정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

그림 6 : 모든 조건 및 AEM vs 사이 murine 조직에 대 한 결정 하는 핵심 유전자 . 물고기 감 금 소. (A-E) 각 데이터 집합/설치류 조직에 대 한 핵심 유전자의 네트워크 표현입니다. 로그₂ 배 변화 (1.2 배 변경의 구분)와 유전자 발현에는 붉은 색의 다른 음영 upregulated 유전자에서 배 변화를 묘사 하는 동안 배-변화 downregulated 유전자에 대 한 녹색의 다른 그늘을 얻기 위해 사용 되었다. 녹색 또는 빨강의 더 어두운 그늘 큰 배-변화. 이 그림에서 Beheshti 수정 되었습니다 외.³⁶. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 7 :는 "마스터 레 귤 레이 터" 설치류 물고기 감 금 소에 비해 쥐 서식 지 주택에 대 한 결정. 모든 개별 키 유전자 (그림 6) 사이 연결 했다 결정 하 고 IPA 통해 네트워크로 표시 됩니다. 네트워크는 가장 연결 된 주요 유전자, MAPK1, 중심에서 방사형 음모로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 데이터 처리 작업을 합리화 하기 위한 ISACreator와 GeneLab-GenomeSpace 통합. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. 

보충 그림 2: 이종 생물 정보학 외부 데이터베이스 (지리적, 자존심, MG-RAST)와 연맹/통합을 사용 하 여 GeneLab의 스크린샷 검색. 제발이이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

추가 그림 3: GeneLab 공동 작업 사용자의 스크린샷 계정 관리, 및 컨트롤에 액세스 (예:, 개인, 공유, 공용 폴더).  제발이이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

미 항공 우주국 GeneLab 플랫폼은 우주 생물학 관련 새로운 가설을 생성 하는 과학계 수 있도록 포괄적인 omics 데이터베이스 및 분석 플랫폼이입니다. 여기 우리는 공개적으로 사용 가능한 공간 생물학 플랫폼을 활용 하 여 데이터 분석에서 새로운 가설의 세대에 spaceflight의 시작 부분에서 설치류 실험에 대 한 포괄적인 절차를 제시. 또한, 우리는 또한 제공 된 광범위 한 프로토콜 편견된 시스템 생물학 분석에 공부 되 고 시스템을 운전 하는 핵심 유전자를 식별. 공간 생물학에 대 한 새로운 가설을 생성 하 우리의 최근 연구³⁶ 이 프로토콜 효과적으로 활용 되는 방법의 예제로 사용 했습니다. 우리는이 더 나은 이해와 spaceflight 실험 수행 하는 방법을 어떻게 그들 로부터 데이터 GeneLab에 사용할 수 있는 데이터를이 끌 고 궁극적으로 공개적으로 사용 가능한 공간 생물학 omics 데이터의 명확 하 게 해석에 대 한 조사를 통해 희망.

설치류 spaceflight 실험 및 생산 데이터의 분석에 관한 우리의 프로토콜 내에서 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 쥐 서식 지 이해 설치 개발 하 고 우주에 대 한 최적의 실험 디자인 중요 하다. 이 구체적으로 프로토콜 및 우리는 우리의 프로토콜의 1 단계에서 제공 하는 설명 수반할 것 이다. 조사 물고기 감 금 소에 비해 쥐 서식 지에서 존재 하는 다른 조건에 완벽 하 게 이해 하 고, 일단 생물 학적 결과 해석 되 고 공간에서 환경 조건에 제대로 상관 될 수 있다. 추가에 쥐 서식 지 수정 할 수 없습니다, 때문에 쥐 서식 지 최적 설계 및 우주 비행의 사용을 위해 NASA에 의해 승인 되었습니다.

생물 학적 결과 해석 하는 GeneLab를 소설 공간 생물학 가설 생성 하는 데이터의 분석 데이터를 업로드 관련 된 모든 단계에서 철저 한 프로토콜 제공 우리. 모든 단계는 데이터를 생성 하는 방법을 이해에서 중요 하다, 비록 데이터 분석을 위한 가장 중요 한 단계는 단계 9 및 10. 9 단계는 진정으로 분석 되 고 실험 조건 주도하 고 있는 유전자/경로 결정 하는 편견된 시스템 생물학 메서드를 사용 하 여 transcriptomic 데이터를 분석 하는 프로토콜을 제공 합니다. 10 단계가 중요 omics GeneLab 플랫폼을 사용 하 여 GeneLab 데이터 집합을 분석 하는 쉬운 방법을 가진 사용자를 제공 합니다. 제공 하는 프로토콜에 대 한 수정 일부 단계에 행 해질 수 있다 데이터 분석에 관한. 특히, 단계 9.4-9.6 해질 수 있다 R 프로그래밍 또는 사용자가 선호 하는 다른 좋아하는 도구를 사용 하 여. 데이터 집합에 따라 다른 통계 및 배 변경 차단 크게 규제 하는 유전자를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 9.5 및 9.6 단계에서 핵심 유전자를 결정, 사용자 수 있습니다 수정이 프로토콜 하 고 크게 규제 유전자 예측 함수를 사용 하는 모든 도구를 사용 하 여. 중요 한 개념은 여러 예측 기능 omics 도구를 사용 하 여 허용 하는지 결정 유전자의 공부 되 고 시스템에서 통제 되 고 기능의 대다수와 관련 된.

GeneLab 플랫폼 개발, 하는 동안 계속 데이터 다운로드 후 여기에 설명 된 분석 수행, GeneLab의 다음 단계 하면 omics의 분석에 대 한 데이터를 생성 하는 간편한 워크플로우를 제공 합니다 GeneLab 플랫폼에서 직접 더 높은 순서 분석을 위해 데이터 처리. 또한, 우리 transcriptomic 데이터를 해석 하기 위한 프로토콜에 집중 했다, 반면 GeneLab omics 데이터 proteomic, 게놈을 포함 하 여, metabolomic, 및 epigenomic 데이터의 광범위 한 포함 되어 있습니다. 결국 플랫폼 파이프라인 및 omics의 이러한 종류의 분석에 대 한 지침을 포함 합니다. GeneLab의 마지막 단계 또한 쉽게 공간 생물학 가설 생성 하는 기본 사용자를 허용 하도록 시스템 수준의 시각화 인터페이스를 구현 합니다.

마지막으로, 우리의 시스템 생물학 분석 어떤 시스템에서 유전자/경로 운전 하는 키를 확인 하려면 독특하고 편견 메서드를 제공 합니다 omics 데이터 집합을 사용 하 여 공부 되 고. 우리가이 방법론에서에서 사용 큰 성공 함께 몇 가지 다른 독립적인 연구는 키 드라이버 관련된^{36,45,,4647,48,49 결정 ,50}. 암 관련 omics 연구, 우리는 우리의 예측된 키 유전자/경로 실제로 운전 약물 치료 응답 체 외⁴⁵핵심 유전자를 노크 하 여 유효성을 실험적으로이 방법론을 사용 하 여. 우리가, 우리는이 프로토콜을 통해 예측 했다 관찰, 치료 핵심 유전자의 부재로 인해 더 이상 효과적 이었습니다. 우리는이 편견된 시스템 생물학 프로토콜 모든 omics 연구에 대 한 주요 경로 결정 하는 유용한 도구가 될 수 믿습니다.

이 프로토콜의 소설 공간 생물학 가설 생성 신속 하 고 효율적인 방법을 제공 한다. GeneLab에서 생성 된 데이터 미래 자금 기회, 실험 검증과 microgravity 그리고 우주 방사선에 대 한 대책의 개발에 대 한 잠재적인 대상에 대 한 조사에 의해 활용 될 수 있습니다. 여기에 제공 된 프로토콜 것입니다 안전한 장기 우주 임무에 대 한 수 있도록 최적의 효율으로 발생할 미래의 공간 생물학 조사 허가.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 Mice	The Jackson Laboratoy	C57BL/6J	C57BL/6 mice were used for datasets related to Rodent Research-1 experiments
BALB/C Mice	Taconic	BALB	BALB/C mice were used for datasets related to Rodent Research-3 experiments
Vivarium Cages	Charles River Laboratory		Standard murine cages purchased from Charles River Laboratory
Rodent Habitat	NASA		This cage and all components are built internally at NASA
RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	RNAlater is used to store the tissue for further RNA isolation