이중 가닥 RNA와 패턴 인식 수용 체 부정적인 감 RNA 바이러스 감염에의 confocal 영상

요약

RNA 바이러스 복제 생산 하는 이중 가닥 RNA는 타고 난 면역 반응 유도 하 패턴 인식 수용 체에 의해 인식할 수 있습니다. 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 낮은 수준의 dsRNA와 호흡기 간의 상호 작용 불분명 남아 있습니다. Arenavirus dsRNA와 개별 셀에서 PRR를 시각화 하는 confocal 현미경 검사 법 방법을 개발 했습니다.

초록

더블-좌초 (ds) RNA는 RNA 바이러스 감염 시 일차 중간으로 생산 됩니다. 호스트 패턴 인식 수용 체 (호흡기) retinoic 산 등으로 dsRNA의 인식 (장비-나) 수용 체 (RLRs) 의장 처럼-난 및 흑색 종 분화 관련 단백질 5 (MDA-5) 타고 난 면역 반응의 유도에 이르게. 형성 및 세포내 분포 긍정적인 감 RNA 바이러스 감염에서에서 dsRNA가 되었습니다 잘 특징 현미경 검사 법. 일부 arenaviruses를 포함 하 여 많은 부정적인 감 RNA 바이러스 감염 시 타고 난 면역 반응을 트리거합니다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스는 dsRNA 바이러스 성 dsRNA의 PRR 인식의 이미징 연구를 방해 하는 낮은 수준의 생산으로 생각 되었다. 또한, 감염 실험 높게 병원 성 arenaviruses 높은 견제 biosafety 수준 시설 (BSL-4)에서 수행 되어야 합니다. 높게 병원 성 RNA 바이러스에 대 한 바이러스 성 RNA와 호흡기 간의 상호 작용 크게 알려진 연구자 BSL-4 시설에서 직면 하는 추가 기술 도전 때문입니다. 최근, 단일 클론 항 체 (Mab) (클론 9D 5) 원래 팬 엔테로바이러스 감지에 사용 특히 dsRNA 전통적인 J2 또는 K1 안티 dsRNA 항 체 보다 더 높은 감도와 감지 하 발견 되었습니다. 9D 5를 이용 하 여 여기, 항 체, confocal 현미경 검사 법 프로토콜 dsRNA, 바이러스 성 단백질 및 PRR arenavirus에 의해 감염 하는 개별 셀에 동시에 시각화를 성공적으로 사용 된 설명. 프로토콜은 또한 이미징 연구 dsRNA 및 PRR 분포 BSL4 시설에서 감염 하는 병원 성 arenavirus 세포에 적합 합니다.

서문

타고 난 면역 반응의 유도의 초기 단계는 더블-좌초 (ds) RNA retinoic 산 등 패턴 인식 수용 체 (호흡기)에 의해 호스트 인식 (장비-나) 수용 체 (RLRs) 의장 처럼-난 및 흑색 종 분화 관련 단백질 5 (MDA-5)¹. 긍정적인 감 RNA 바이러스, dsRNA 수 있습니다 일반적으로 쉽게 감지가 J2 또는 K1 안티 dsRNA 단일 클론 항 체 (Mab)²를 사용 하 여. DsRNA와 호흡기 간의 상호 작용 picornavirus, 같은 긍정적인 물가 RNA 바이러스에 confocal 현미경 검사 법³을 사용 하 여 특징 되었습니다 했다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 시각화 및 PRR 및 dsRNA 상호 작용의 특성은 되었습니다 의해 방해 dsRNA에 중요 한 항 체의 부족. RNA 형광 제자리 교 잡 (물고기) 바이러스 성 RNA와 호흡기⁴의 시각화에 적용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 물고기 방법론 대상 RNA 시퀀스의 지식이 필요 하 고 PRR 공동 얼룩과 호환 되지 않을 수 있습니다. 최근, 9D 5는 원래 팬 엔테로바이러스 감염의 진단에 대 한 개발, Mab 발견 됐다 J2 Mab 보다 더 예민 하 고 쉽게 수 부정적인 감 RNA 바이러스 감염^5,6에서 dsRNA를 감지. 따라서, Mab 9D 5 소설과 바이러스 성 복제 및 PRR 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 바이러스 성 RNA의 상호작용 연구에 유용한 도구 이다.

Arenaviruses는 Lassa 바이러스 (LASV), Junín 바이러스 (JUNV)와 Machupo (MACV), 인간⁷에서 심각한 출혈 질병의 원인이 그 같은 여러 인간 병원 체를 포함 하는 단일 가닥, 부정적인 감 RNA 바이러스의 가족입니다. 임상 데이터로 새로운 세계 arenavirus JUNV에 의해 발생 하는 아르헨티나 출혈의 심각 하 고 치명적인 경우 혈 청 IFN-α^8,9의 비정상적으로 높은 수준의 전시. 우리 병원 성 NW arenaviruses (JUNV, MACV), 하지만 하지는 병원 성 올드 월드 arenavirus, LASV, 유도 종류 것으로 나타났습니다 내가 인간 monocyte 파생 된 모 수석 세포¹⁰인터페론 (IFN) 응답. 또한, 장비-센서 중 하나입니다 중재 유형 I IFN 응답 JUNV 감염 세포¹¹. 우리는 또한 전통적으로 dsRNA 인식에 대 한 알려져 있다는 단백질 키 니 아 제 R (PKR) 수용 체 병원 성 NW arenavirus 감염¹²활성화 됩니다 발견. 더 arenavirus 감염 시 바이러스 관련 IFN 응답의 메커니즘을 이해, 우리는 바이러스 성 dsRNA와 세포질 호흡기 간의 상호 작용을 시각화 하기 위해 프로토콜을 개발 목적.

병원 성 JUNV, MACV 및 LASV 감염 실험 biosafety에서 수행 되어야 하는 레벨 4 (BSL-4) 시설. 따라서, 뿐만 아니라 arenavirus 감염에 dsRNA의 아마도 낮은 수준 biosafety 요구 사항을 충족입니다 다른 기술 도전이 높게 병원 성 바이러스에 대 한 이미징 연구를 수행할 때. 9D 5를 이용 하 여 항 체와 JUNV의 Candid1 # 백신 긴장, confocal 현미경 검사 법 기반 프로토콜은 dsRNA, 바이러스 성 단백질 및 PRR에 arenavirus에 의해 감염 된 세포에 동시에 시각화를 성공적으로 사용 된이 보고서에 설명 BSL2 실험실입니다. 프로토콜 또한 세포내의 분포 dsRNA와 PRR BSL4 시설에서 병원 성 arenavirus 감염 시의 시각화를 위해 적당 하다.

프로토콜

1. 준비 A549 세포 및 JUNV 감염의

1. 폴 리-D-리 (PDL)에 시드 2 x 10⁵ 인간 폐 상피 A549 세포 감염 이전 24 시간에 유리 coverslips 12-잘 접시에 코팅.
2. JUNV¹³ 감염 (MOI)의 곱셈에서의 150 mL의 aliquots 단위를 형성 하는 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 미디어 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린과 스 (P/S 보충에 희석 셀당 1.0 플 라크의 준비 ).
3. 세포 배양에서 미디어를 제거 합니다. 각 잘 포함 coverslip에 바이러스 inoculum을 추가 하 고 37 ° c.에 1.5 h에 대 한 품 어 접시 마다 15 분 흔들.
4. 제거 바이러스 inoculum DMEM 5 %FBS 1 %P 보충의 1 mL을 추가/미 품 어 원하는 시간 지점에 대 한 37 ° C에서 접시.

2. 고정 및 immunostaining

1. 미디어 발음 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 칼슘과 마그네슘을 각 영역 보충의 1 mL을 추가 하 여 셀을 씻어.
2. PBS를 제거 합니다. 사전-20 ° C에서 냉장 메탄올 (MeOH)의 1 mL을 추가 하 고 15 분을 위한 드라이 아이스 또는-20 ° C에서 품 어.
3. MeOH를 제거 합니다.
4. 1 mL PBS의 각 음을 추가 하 고 부드러운 락을 5 분으로 4 ° C에서 워시 샘플 총 4 번의 세척을 반복.
5. 0.2 %t-octylphenoxypolyethoxyethanol 부드러운 락와 4 ° C에서 5 분의 1 mL에 coverslips에 고정 된 세포를 씻어.
6. 각 우물에 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 부드러운 락으로 5 분 동안 4 ° C에서 샘플을 씻으십시오. 총 4 번에 대 한 세척 단계를 반복 합니다.
7. DsRNA와 MDA5를 검출, 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 희석 하는 주 항 체의 200 mL에 샘플을 품 어. 1:2 희석에 안티-dsRNA 9D 5 항 체를 희석 하 고 1: 250에서 안티-MDA-5 항 체 희석. 부드러운 락을 4 ° C에서 하룻밤 함께 품 어.
8. 1 차 항 체를 제거 하 고 각을 씻어 부드러운 실시간 반복에서이 워시 4 번 더 락을 5 분에 대 한 PBS의 1 mL와 잘.
9. 200ml 2 차 항 체 (1:2, 000 희석)의 3 %BSA 희석을 추가 하 고 1 시간에 대 한 RT에서 품 어.
10. 2 차 항 체를 제거 하 고 각을 씻어 부드러운 실시간 반복에서이 워시 4 번 더 락을 5 분에 대 한 PBS의 1 mL와 잘.
11. JUNV nucleoprotein (NP)를 감지 하 고 장비-, 추가 3 %BSA 희석 활용 된 항 체의 200 mL. 1:1,000에서 활용 된 안티-JUNV NP (AG-12)을 묽 게 하십시오 그리고 부드러운 락 RT에서 h 2에 대 한 샘플을 품 어. 활용 된 안티-RIG-나 항 체 1: 500에 희석 하 고 부드러운 락으로 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
12. 활용 된 항 체를 제거 하 고 각을 씻어 부드러운 실시간 반복에서이 워시 4 번 더 락을 5 분에 대 한 PBS의 1 mL와 잘.
13. 실시간에 부드러운 락으로 3 분 DAPI (1:1, 000)와 coverslips counterstain
14. 워시는 coverslips 3 번, 실시간에 부드러운 락으로 0.5 %t-octylphenoxypolyethoxyethanol의 1 mL에 5 분 동안 각 시간
15. 실시간에 부드러운 락 각 시간 5 분에 대 한 PBS의 1 mL에 두 번 씻으십시오
16. DdH₂O RT, 부드럽게 락에 1 분의 1 mL에 한 번 씻어.
17. 설치 미디어를 사용 하 여 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재 합니다. 하룻밤 사이 치료 하자.
18. 매니큐어와 슬라이드를 밀봉 하 고 1 시간 동안 건조 공기.
19. 60 x confocal 현미경 이미지 / 1.42 숫자 조리개 기름 침수 렌즈 같은 레이저 방사를 사용 하 여 각 샘플에 대 한.
20. 필요한 경우 데이터를 분석, 밝기 및 대비 모든 샘플에 대 한 동일한 선형 조정을 사용 하 여 조정을 합니다.

결과

이 프로토콜 배포 및 colocalization는 RLRs 사이 연구에 적용 된 (장비-어 MDA-5) 및 JUNV에 감염 된 세포에 dsRNA. 그림 1 과 그림 2에서 같이, dsRNA의 축적 바이러스 감염 진행으로 시간이 지남에 따라 증가 합니다. MDA-5 (그림 1) 및 장비를 집중-(그림 2) 신호는 NP의 dsRNA punctate 구조와 colocalized 발...

토론

긍정적인 감 RNA 바이러스 및 dsDNA 바이러스, dsRNA J2 안티 dsRNA 널리 사용 항 체로 쉽게 검색 됩니다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스는 dsRNA 동일한 항 체²를 사용 하 여 감지 수준 이하로 낮은 생산 하는으로 추정 된다. 따라서, 바이러스 성 RNA 및 PRR 상호 작용의 여러 측면 크게 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 명확 하지 않다. 우리는 dsRNA J2 항 체를 사용 하 여 arenavirus 감염에 대 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit	Invitrogen	A10475
BSA	Sigma Aldrich	A4503
DAPI	Cell Signaling	4083	1:1,000 dilution
Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-11058	1:2,000 dilution; Lot #: 1454437
Dulbecco's modified Eagle's medium	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
Glass microscope slides	Fisher	12-550-15
Goat-anti mouse Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029	1:2000 dilution; Lot #: 1874804
Human lung epithelial A549 cells	ATCC	CCL-185
Methanol	Fisher	A412	Stored at -20 °C
Mouse MAb anti-JUNV NP	BEI	NA05-AG12	Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution
Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent	Millipore Sigma	3361	ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445
PBS supplemented with Ca and Mg	Corning	21-030-CV
PDL Coated coverslips	Neuvitro	H-12-1.5-pdl
ProLong Gold antifade	Invitrogen	P10144
Rabbit MAb MDA-5	Abcam	ab126630	1:250 dilution; Lot #: GR97758-7
recombiant Candid#1 strain of JUNV	Lab generated	Lab generated	As previously described in reference 13.
RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594	Santa Cruz	sc-376845	1:1000 dilution; Lot #: AO218
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787