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요약

종합적으로 활용되는 합계 주파수 생성(SFG) 진동 분광법은 중합체 및 생체 거시적 계면에서 일어나는 사슬 형태 순서 및 이차 구조 변화를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

초록

2차 비선형 광학 분광법으로서, 합계 주파수 생성(SFG) 진동 분광법은 다양한 표면과 인터페이스를 조사하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이 비침습적 광학 기술은 단층 또는 하위 단일층 감도로 국소 분자 수준 정보를 제공할 수 있습니다. 우리는 여기에서 거대 분자와 생체 거대 분자 둘 다를 위한 매장된 계면을 선택적으로 검출하는 방법에 대한 실험적인 방법론을 제공하고 있습니다. 이를 염두에 두고, 실크 섬유인의 계면 보조 구조와 모델 짧은 사슬 올리고뉴클레오티드 이중 을 둘러싼 물 구조가 논의된다. 전자는 체인 체인 중복 또는 공간 감금 효과를 나타내며, 후자는 물의 키랄 척추 상부 구조로 인한Ca2+ 이온에 대한 보호 기능을 보여줍니다.

서문

화 주파수 생성 (SFG) 진동 분광법의 개발은 30 년 전1,2. 계면 선택성 및 하위 단층 감도의 고유성은 SFG 진동 분광법을 물리학, 화학, 생물학 및 재료 과학 등의 분야에서 많은수의 연구자들이 평가하게 합니다 3,4 ,5. 현재 표면 및 인터페이스와 관련된 광범위한 과학적 문제가 SFG를 사용하여 조사되고 있으며, 특히 중합체 및 생체 거시 분자와 관련된 복잡한 인터페이스(예: 체인 구조 및 구조적 이완)에 대해 매장 된 폴리머 인터페이스, 단백질 이차 구조및 계면 물 구조 9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.

폴리머 표면 및 인터페이스의 경우, 박막 샘플은 일반적으로 원하는 표면 또는 인터페이스를 얻기 위해 스핀 코팅으로 제조됩니다. 문제는 준비된 필름의 두 인터페이스로부터의 신호 간섭으로 인해 발생하며, 이는 수집된 SFG스펙트럼(27,28,29)을분석하는 데 불편함을 초래한다. 대부분의 경우 필름/기판 또는 필름/기타 매체중 하나의 인터페이스에서만 진동 신호가 바람직합니다. 사실,이 문제에 대한 해결책은 실험적으로 바람직한 인터페이스에서 광필드를 최대화하고 다른 인터페이스에서 광필드를 최소화하는 것은 매우 쉽습니다. 따라서, 프레넬 계수 또는 국부적 필드 계수는 박막 모델을 통해 계산되어야 하며 실험 결과3,9,10,11에대하여 검증되어야 한다. 12,13,14,15,30.

위의 배경을 염두에 두고 분자 수준에서 기초 과학을 이해하기 위해 일부 중합체 및 생물학적 인터페이스를 조사 할 수 있습니다. 다음에서, 예를 들어, 세 가지 계면 문제를 예로 들자면, 폴리티렌(PS) 표면에 폴리(2-hydroxyethyl methacrylate) 표면 및 기판9와의 부설 된 인터페이스, 실크 섬유린 (SF) 이차 구조물의 형성 및 모델 단사슬 올리고뉴클레오티드 듀플렉스16,21을둘러싼 물 구조는 SFG 진동 분광법을 기본 과학과 관련하여 계면 분자 수준 구조를 밝히는 데 어떻게 도움이되는지 보여줍니다.

프로토콜

1. SFG 실험

  1. Nd:YAG 레이저를 기반으로 펄스폭 ~20ps 및 주파수 50Hz의 기본 1064 nm 빔을 제공하는 상업용 피코초 SFG 시스템(재료 표)을 사용합니다.
  2. 기본 1064 nm 빔을 두 번째 및 세 번째 고조파 모듈을 사용하여 532 nm 빔과 355 nm 빔으로 변환합니다. 직접 입력 광 빔으로 532 nm 빔을 안내하고 광학 파라 메트릭 생성 (OPG)/ 광학 파라 메트릭 증폭 (OPA)를 통해 1000 ~ 4000cm-1의 주파수 범위를 포함하는 다른 입력 중간 적외선 (IR) 빔을 생성합니다. 차이 주파수 생성 (DFG) 프로세스.
  3. 두 입력 빔의 입사 각도를 표면 법선대비 각각 53°(IR) 및 64°(가시)로 설정합니다.
  4. 폴리머 계면 구조(필름/기판 인터페이스 또는 필름/기타 중간 인터페이스)를 감지하려면 ssp(s-편광 화주파수 빔, s편광 가시 광선 및 p 편광 적외선 빔) 및 ppp 편광 조합을 사용합니다.
  5. DNA를 둘러싼 계면 단백질 이차 구조 및 물 구조를 검출하기 위해, ssp 및 ppp 외에, 키랄 Spp 및 psp 편광 조합을 사용하였다.
  6. 시료가 손상되지 않도록 적외선 및 가시 펄스 에너지를 각각 ~70 및 ~30 mJ로 제어합니다. 에너지 레벨 다이어그램이 있는 SFG 프로세스의 회로도는 그림1에 나타내졌습니다. 그림 2는 클린룸의 SFG 시스템을 보여줍니다.

2. 프레넬 계수

  1. 여기서 설명한 모든 실험에 대해 직각 프리즘을 기판으로 사용합니다. 고체 기판, 즉 공기 및 폴리머/기판 인터페이스의 폴리머 표면에 폴리머 필름에 대한 두 개의 인터페이스가 존재한다. 두 인터페이스 모두에서 반전 대칭이 끊어지므로 둘 다 SFG 신호를 생성할 수 있습니다. 따라서, 수집된 SFG 스펙트럼은 간섭된 스펙트럼이다. 그러나, 두 인터페이스에서의 로컬 필드 계수 또는 프레넬 계수는 입사각 또는 막 두께를 한 번에 하나씩 또는 동시에31,32로변화시킴으로써 조절될 수 있다. 이를 통해 하나의 인터페이스에서만 SFG 진동 신호를 프로브할 수 있습니다. 여기서, CaF2 프리즘에 대한 PHEMA 필름은 실시예9로촬영되었다.
  2. 그림3에 도시된 바와 같이, 직각 프리즘 지오메트리를 사용하여 하단 PHEMA 필름에서 생성된 SFG 신호를 검출한다. 반사 모드의 SFG 출력 강도는
    figure-protocol-1521(1)
    여기서 figure-protocol-1619 효과적인 2차 비선형 감수성 텐서를 나타냅니다.
    figure-protocol-1737다음 방정식과 같이 프리즘/폴리머 인터페이스, 폴리머/하단 매체 인터페이스(하단 매체는 가스, 액체 또는 고체 포함) 및 비공명 배경등 세 부분으로 구성됩니다.
    figure-protocol-1917(2)
    여기서 바닥 매체는 공기, 물 또는 다른 것일 수 있습니다. F는 로컬 필드 보정을 담당하는 해당 프레넬 계수를 나타냅니다.
  3. 박막 모델을 적용하여 이 경우 프레넬 계수를 계산합니다. 여기에 간단한 계산 절차만 제공됩니다.
    1. 프리즘/폴리머 인터페이스의 경우,
      figure-protocol-2184(3)
      figure-protocol-2278(4)
      figure-protocol-2350(5)
      표시된 각 매개 변수의 의미는 아래에 나와 있습니다.
      1. ω i는 빔 주파수를 나타낸다.
      2. tp 및 ts는 전체 전송 계수를 나타내며
        figure-protocol-2582(6)
        figure-protocol-2676(7)
      3. tp12 및 ts12는 프리즘/폴리머 인터페이스에서 광빔의 선형 투과 계수를 나타냅니다.
      4. rp23 및 rs23은 폴리머/매체 인터페이스에서 광선의 선형 반사 계수를 나타냅니다.
      5. α는 폴리머 박막에 걸쳐 전파된 후 반사 빔과 이차 반사 빔 사이의 위상 차이를 나타내고 다시 반사하여 표현할 수 있습니다.
        figure-protocol-3058(8)
      6. λ는 광선의 파장을 나타내고 d는 중합체 막 두께이다.
      7. Φ 1과 Φ2는 각각 프리즘/폴리머 인터페이스와 폴리머/매체 인터페이스에서 입사 각을 나타냅니다.
      8. n1 및 n2는 각각 프리즘 및 폴리머 필름의 굴절 지수를 나타낸다.
      9. n12 프리즘/폴리머에 대한 중합체 계면 층의 굴절 률 을 나타냅니다.
    2. 폴리머/매체 인터페이스의 경우,
      figure-protocol-3545(9)
      figure-protocol-3619(10)
      figure-protocol-3694(11)
      1. Δ는 두 인터페이스에서 광 전기장의 위상 차이를 나타냅니다.
      2. 입력 빔의 펄스 폭은 ~20ps이기 때문에 분산 효과와 관련된 시간 지연의 오차를 무시할 수 있습니다.
      3. 출력 SFG, 입력 가시 및 입력 적외선 빔에 대한 이러한 위상 차이의 발현은 별도로 기록될 수 있다.
        figure-protocol-3961(12)
        figure-protocol-4036(13)
        figure-protocol-4111(14)
         
  4. 위의 논의에서 프리즘-폴리머 필름 매체(1-2-3) 시스템의 경우, 프리즘/폴리머 및 폴리머/매체 인터페이스에 대한 총 프레넬 계수를 다음 방정식으로 표현하고, ssp 및 ppp 편광 조합에 대해 . 물론, 두 인터페이스는 azimuthally 등방성으로 간주됩니다.
    1. 프리즘/폴리머 인터페이스의 경우, ssp 및 ppp 편광 조합 모두에 대한 총 프레넬 계수의 발현은 다음과 같이 제시된다.
      1. ssp의경우 방정식은
        figure-protocol-4523(15)
      2. 그리고 ppp의경우 방정식은
        figure-protocol-4635(16)
        figure-protocol-4733(17)
        figure-protocol-4831(18)
        figure-protocol-4929(19)
         
      3. t10 및 t01은 각각 공기/프리즘 및 프리즘/공기 인터페이스에서 선형 전송 계수를 나타냅니다.
    2. 중합체/매체 인터페이스의 경우, ssp 및 ppp 편광 조합 모두에 대한 총 프레넬 계수의 발현은 다음과 같이 설명한다.
      1. ssp의경우 방정식은
        figure-protocol-5286(20)
      2. ppp의경우 방정식은
        figure-protocol-5416(21)
        figure-protocol-5514(22)
        figure-protocol-5612(23)
        figure-protocol-5710(24)
           
         
  5. 샌드위치 모델을 사용하여 프레넬 계수를 계산한 후 그림4와 같이 필름 두께의 함수로 플롯합니다.
    참고 : 이 경우, 약 150 nm인 다른 인터페이스에서 무시 가능한 기여와 CaF2 프리즘 / PHEMA 인터페이스에서 SFG 신호를 수집하기위한 두께 범위가 존재한다. 마찬가지로, 적절한 두께는 CaF2 프리즘/PHEMA 인터페이스에서 무시할 수 없는 기여와 함께 PHEMA/하단 중간 인터페이스의 검출을 위해 선택될 수 있습니다.

3. C히랄 SFG 편광 조합

  1. 일반적인 치수 인터페이스의 경우 일반적으로 앙상블 평균33,34의관점에서 C∞v 대칭을 사용합니다. 반전 대칭의 작동으로, 비제로 2 차 비선형 감수성 텐서 구성 요소는 cxxz,cxzx,czxx,cyyz,cyzy,c zy, czyy 및 czzz ( 기존 용어는 등방성 인터페이스가 가정되는 경우 더 줄일 수 있으며, 이는 x와 y가 동일하다는 것을 의미합니다) 그러나 키랄 인터페이스의 경우 상황이 다를 수 있습니다. 키랄 인터페이스는 C∞ 대칭을 가지며 회전 대칭 작업만 허용됩니다. 이 경우, 일반적인 치수 용어 외에, 더 많은 2 차 비선형 감수성은 비 전자의 고려하에 키랄 용어, 즉, czyx,czxy 및 cyzx라고 할 수있는 비영점이 될 것입니다. 공명. 따라서, psp, pps 및 spp 편광 조합을 사용하여, 키랄 SFG 스펙트럼을33,34를수집할 수 있다.

4. 견본 준비

  1. PHEMA 필름의 준비
    1. PHEMA 분말(재료 표참조)을 무수 에탄올에 용해하여 각각 2 wt%와 4wt%로 용액을 준비합니다.
    2. PHEMA 필름을 증착하기 전에, 먼저 톨루엔 용매에 CaF2 직각 프리즘을 담근 다음 에탄올 및 초순수 (18.2 MΩ +cm)로 세척하십시오.
    3. 그 후, 플라즈마 클리너에 의해 가능한 유기 오염 물질을 제거하기 위해 산소 플라즈마에 기판 (CaF2 직각 프리즘)을 노출 (재료표참조).
      1. 먼저 플라즈마 클리너를 켜고 그 안에 기판을 넣어.
      2. 그런 다음 진공 펌프를 켜서 청소기를 진공 청소기로 청소합니다. 산소를 입력합니다.
      3. 마지막으로 청소를 위해 4 분을 설정합니다. 그 후, 순차적 PHEMA 막 제조를 위한 깨끗한 기판을 보존한다.
      4. 그런 다음 스핀 코터로 CaF2 프리즘에서 PHEMA 필름을 준비합니다(재료 표참조). 용액 농도 및 스핀 속도에 따라 필름 두께를 조정합니다.
        1. 스핀 코터의 빠는 디스크에 CaF2 프리즘을 고정시.
        2. 1,500 rpm에서 1,500 rpm으로 깨끗한 기판 상에 제조되기 전에 제조된 PHEMA 용액의 한 방울을 1분 동안 떨어뜨린다(필름 두께 2 wt%는 100 nm에, 200 nm의 경우 4 wt%).
      5. 밤새 80°C에서 진공 오븐에서 제조된 PHEMA 필름을 모두 어닐레.
  2. 실크 섬유의 준비 (SF)
    참고: 카플란 외35에 의해 제안된 프로토콜이 채택되었다.
    1. 끓는 탄산나트륨(Na2CO 3, 0.02 M) 수성용액(3L)에 B. 모리의 실크 고치 7.5 g을 30분 동안 놓고 섬유질 SF를 깨끗한 용기에 제거합니다.
    2. 세리신 분자를 제거하고 섬유질 샘플에 SF 분자만을 남기기 위해 교반 하에 3회 동안 탈이온수로 얻어진 섬유질 SF를 세척한다.
    3. 섬유질 SF 샘플을 진공 오븐에서 60°C에서 밤새 건조시다.
    4. 그 후, 탈구섬유성 SF 샘플을 리튬 브로마이드(LiBr, 9.3 M) 수성 용액(1 g의 SF가 LiBr 용액의 ~4 mL에서 해결하였다)에 용해시키고 교반 하에서 2시간 동안 60°C에서 배양하였다.
    5. 용해된 LiBr을 제거하기 위해 3일 동안 탈이온수(3,500 Da 투석 백)에 대하여 SF 용액을 투석하였다. 매일 세 번 새로운 탈이온수를 변경하십시오. 최종적으로 처리된 SF 솔루션을 4°C에 저장하여 이후의 SFG 실험을 하였다.
  3. 단사슬 올리고뉴클레오티드 듀플렉스의 제조
    1. 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 샘플을 콜레스테롤 트리에틸렌 글리콜(Chol-TEG)(5'-GCTTCCGAAGGTCGA-3')에 의해 변형된 3'-말단으로 상업적 법인(재료 표참조)과 상보적인 샘플을 주문합니다. 각 단일 가닥에 대해 샘플 분말 10 nmol을 0.5 ml의 초순수에 녹입니다. 그런 다음 이를 함께 혼합하여 이중 올리고뉴클레오티드 용액(10 nmol/mL)을 형성합니다.
    2. 1,2-디팔미토일-스니-글리세로-3-포스포콜린(DPPC) 2 mg과 2 mg의 Deuterated DPPC(D-DPPC)를 혼합하고 1 mL의 클로로포름에 용해하여 지질 용액을 준비합니다.
    3. 랭뮤어-블로젯(LB)에 의한 DPPC 및 D-DPPC 단층 준비
      1. 직각 CaF2 프리즘을 LB 트로프의 수성 환경에 수직으로 담근 프리즘 면 1개를 사용하여 홈메이드 샘플 홀더에 부착합니다.
      2. 그 후, 표면 압력이 34 mN·m-1 이하의 특정 값에 도달할 때까지수면에 제조된 혼합 지질 용액을 주입한다.
      3. 표면 압력 레벨을 벗어난 후, 2개의 테프론 장벽을 사용하여 34 mN/m-1의 표면 압력에 도달할 때까지 5 mm/min의 비율로 지질 단층을 압축합니다.
      4. 수직으로 1mm /min의 속도로 물에서 지질 단층으로 프리즘을 들어 올립니다.
    4. 다른 지질 단층의 제조
      1. 소수성 상호작용(콜레스테롤 및 지질 알킬 사슬)을 통해 이중 올리고뉴클레오티드 및 지질 분자의 조립을 용이하게 하기 위해, 이중 올리고뉴클레오티드 용액을 지질 용액과 1:100의 어금니 비율로 혼합한다(올리고뉴클레오티드 지질)을 참조하십시오.
      2. 혼합 지질 및 이중 올리고뉴클레오티드 용액을 수제 테플론 용기에 수면에 주입하여 34 mN/m-1의 표면 압력에 도달할 때까지.
    5. 마지막으로, 지질 단층의 바닥에 지질 단층을 삽입된 이중 올리고뉴클레오티드를 수면에 삽입하여 SFG 측정을 위한 최종 샘플을 형성한다.
  4. 로렌츠 방정식
    1. Lorentz 방정식을 사용하여 SFG 스펙트럼에 맞게 특정 진동 모드에 대한 진동 정보를 추출합니다.
      figure-protocol-9808(25)
      여기서 figure-protocol-9909 는 qth 진동 모드의 figure-protocol-9999 강도를 나타내고, 공진 주파수를 나타내고, figure-protocol-10091 반 최대(HWHM)에서 반 폭을 나타내고 입사 figure-protocol-10185 IR 빔의 스캐닝 주파수를 나타낸다.

결과

프로토콜 섹션의 프레넬 계수 부분에서는 이론적으로 한 번에 하나의 인터페이스만 선택적으로 감지하는 것이 가능하다는 것을 보여 주어 도모했습니다. 여기서, 실험적으로, 우리는 이 방법론이 그림 5 및 그림 6에 도시된 바와 같이 기본적으로 정확하다는 것을 확인하였다.

도 5는 ~150 nm PHEMA 하이드로겔 필?...

토론

분자 수준에서 구조 정보를 조사하기 위해 SFG는 고유의 장점 (즉, 단층 또는 하위 단면 감도 및 계면 선택성)을 가지고 있으며, 이는 솔리드 / 솔리드, 솔리드 / 액체, 고체/가스, 액체/가스, 액체/액체 인터페이스. 장비 유지 보수 및 광학 정렬은 여전히 시간이 많이 걸리지만 표면 및 인터페이스에서 상세한 분자 수준 정보를 얻을 수 있다는 점에서 보수가 중요합니다.

프로?...

공개

우리는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 중국 의 기본 연구를위한 국가 핵심 개발 프로그램 (2017YFA0700500)과 중국의 국립 자연 과학 재단 (21574020)에 의해 지원되었다. 중앙대학의 기초연구기금, 강소고등교육기관(PAPD)의 우선학술프로그램 개발사업과 국립실험생물의학공학시범센터 교육 (동남 대학) 또한 크게 평가했다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc.850355P-1g
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680≥99.7%
CaF2 prismChengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10005817≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC)Avanti Polar Lipids, Inc.860345P-100mg
Electromagnetic ovenZhejiang Supor Co., LtdC21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) troughKSV NIMA Co., Ltd.KN 2003
Lithium bromide anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd20056926
Milli-Q synthesis systemMilliporeUltrapure water
Plasma cleanerChengdu Mingheng Science&Technology Co., LtdPDC-MGOxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA)Sigma-Aldrich Co., LLC.192066 MSDSMw = 300 000
PolystyreneSigma-Aldrich Co., LLC.330345 MSDSMw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoonsFrom Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotideNanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.H035965'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotideNanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.H04936 3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019260≥99.8%
Spin-coaterInstitute of Microelectronics of the Chinese Academy of SciencesKW-4AFor the prepartion of ploymer films 
Step profilerVeecoDEKTAK 150For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy systemEKSPLAA commercial picosecond SFG system

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